Отзывы масло енеос: Отзывы на Масло моторное Eneos Premium TOURING 5w30 синтетическое, SN/GF-5, для бензинового двигателя, 4л, арт. 8809478942216

Отзывы на Масло моторное Eneos Premium TOURING 5w30 синтетическое, SN/GF-5, для бензинового двигателя, 4л, арт. 8809478942216

Масло моторное Eneos Premium TOURING 5w30 SN/GF-5 синтетическое, для бензинового двигателя

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Экологическое высококачественное моторное масло для четырехтактных бензиновых двигателей, в том числе для применения в автомобилях, оборудованных гибридной установкой, системой Start-Stop и турбонаддувом.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Произведено на основе базовых масел наивысшей степени очистки. Благодаря применению технологии японской Корпорации JXTG NIPPON OIL & ENERGY, имеет максимальную степень очистки от нежелательных примесей, обладает наивысшими физико-химическими характеристиками, устойчивостью к окислению, испаряемости, стабильностью вязкости и высоким сопротивлением масляной пленки на сдвиг.

ОСНОВНЫЕ ЭКСПЛУАТАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Обеспечивает надёжную защиту и топливную экономичность современных двигателей легковых автомобилей. Сохраняет превосходные смазывающие свойства при высоких нагрузках. Снижает износ и обеспечивает чистоту двигателя, что увеличивает срок его службы.

ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

Плотность при 15 °С, g/ml: 0.8516 ASTM D4052 KS M ISO 12185
Точка вспышки COC, °С: 218 ASTM D92 KS M ISO 2592
Кинематическая вязкость при 40 °С, mm²/s: 60.81 ASTM D445 KS M ISO 3104
Кинематическая вязкость при 100 °С, mm²/s: 10.56 ASTM D445 KS M ISO 3104
Индекс вязкости: 165 ASTM D2270 KS M ISO 2909
Точка потери текучести, °С: — 39.0 ASTM D97 KS M ISO 3016
Щелочное число, mgKOH/g: 7.24 ASTM D2896 KS M ISO 3771
Цвет ASTM: L2.0 ASTM D1500 KS M ISO 2049

О БРЕНДЕ

ENEOS — масло №1 в Японии, бренд крупнейшей японской нефтяной корпорации JXTG Nippon Oil & Energy. ENEOS — это лидер нефтяной промышленности Японии, крупнейшая в Японии сеть АЗС (14 000 станций — 51% рынка), Золотой партнер Олимпийских игр 2020 в Токио.

Производитель оставляет за собой право без уведомления менять характеристики, внешний вид, комплектацию товара и место его производства.

В случае, если в описании товара прямо не указано обратное, гарантийный срок на такой товар не установлен.

ENEOS Gran-Touring SM 5W-40 4 л

Самые выгодные предложения по ENEOS Gran-Touring SM 5W-40 4 л

 
 

Андрей, 15.02.2019

Достоинства:
жидкое масло для новых малонагруженных двигателей, мало потребляющих масло

Недостатки:
небольшой пакет присадок, двигатель работает громче
угар при повышенных оборотах средний

Комментарий:
при работе напоминает zic 10w40

Пол Адриан, 16.08.2018

Достоинства:
Стоит не дорого, не горит, не течет.

Недостатки:
Нет

Комментарий:
Прекрасная альтернатива всяким Шеллам и иже с ним, качество в разы выше, а стоимость ощутимо приятнее.
Абсолютно устраивает масло со всех сторон, не замерзает, даже при — 34 на глазок абсолютно не теряет текучести.

Журавлёв Владимир, 14.01.2018

Достоинства:
Работа двигателя отличная

Недостатки:
Не обнаружены

Комментарий:
Масло отвечает всем необходимым техническим требованиям.
Нет подделок. Использую на фольксвагене.

Korobkin Artyom, 21.11.2017

Достоинства:
Цена, прекрасная работа мотора, упаковка

Недостатки:
не обнаружил

Комментарий:
Лью в Турбо-субарик, машина довольна, я тоже

Евгеныч Евген, 21.04.2017

Достоинства:
Не горит, не подтекает. оцениваю на отлично.

Недостатки:
Нет

Комментарий:
Пробег у меня уже солидный на Кашкае, давно перевалил за 100 тыс. км. поэтому выбираю масло с прицелом на сохранность и бережное отношение к двигателю. Беру то в котором уверен, по вязкости 5w40 меня очень устраивает. Качеством Энеоса доволен, пользуюсь исключительно им уже 2,5 года. Доволен как показывает себя в диаметрально противоположных погодных условиях (жара/холод).

Александр Пушкин, 13.04.2017

Достоинства:
Упаковка. Качество. Рабочие характеристики.

Недостатки:
Недостатков не обнаружил.

Комментарий:
Лью в Монтеро 3. Двигатель 3.5.бензин. 6g74mpi инжектор. Пробег 215000.расход масла прекратился. Угара масла нет. Синтетика. .отлично. 5+++

Белорусов Михаил, 23.03.2017

Достоинства:
Хорошие характеристики за эту цену.
Масло подходит для морозов до -32 при более низкой температуре лучше лить 0W40, правда у Eneos такой марки не замечал.

Недостатки:
Пользовался данным маслом с 2010 года пробег был 380 000 двигатель 1G-FE, потом оно резко пропало и в нашем городе (Хабаровск) его было не найти. Пришлось переходить на Elf той же вязкости. Обе марки масел соответствуют своим характеристикам.

Сейчас у нас в городе снова появилось в продаже.

Комментарий:
Не хватает представительств в России.

Дмитрий, 27.02.2017

Достоинства:
С автозапуска заводится без проблем даже при температуре -22 градуса (если температура выше что бы не издеваться над машиной выхожу и завожу машину с выжатым сцеплением), В отличие от очень распространённого бренда масла на котором ездил до этого (M….. 3000) данное масло движок расходует значительно меньше. Гидрики не стучат напротяжении всех 10000 от замены до замены, металлическая канистра почему то придаёт больше уверенности то что данное масло подделывать дороже и нарваться на подделку всё же меньше шансов.

Недостатки:
Не сильно распространённое масло которое сложно найти в магазинах Рязани,

Комментарий:
Больше года использую данное масло и всем доволен. Машинка бежит хорошо, ну а расход масла у неё и должен быть, так как при загибе клапанов была восстановлена только головка блока цилиндров. На данном масле расход значительно меньше чем на том более дорогом которое я использовал до него.

Пономарев Валерий, 16.11.2016

Достоинства:
хорошая цена, железная банка

Недостатки:
нет

Комментарий:
11 лет лью в лансер, меняю через 10-11 тыс. пробовал кастрол,мотор работал на звук более жестко

Неткачев Иван, 05.07.2016

Достоинства:
Дешево (1750 4л)

Недостатки:
Улетало по 500мл на 1000 км. Да, двигатель старый, но Motul 6100 держит уровень ни капли не ушло, а я расстроился думал капиталь пришел.

 

Отзывы о моторных маслах Eneos: Оценки, Рейтинги, Сайт, Страна

Что мы знаем о моторных маслах Eneos

Бренд производителя зарегистрирован в стране — Япония. Официальный сайт находится по адресу: http://www.eneosoil.ru/.

В апреле 2021 года на PartReview сложилось неоднозначное мнение о моторных маслах Eneos. Оценка PR — 76 из 100, базируется на основе 137 отзывов и 432 голосов. 99 отзывов имеют положительную оценку, 17 — нейтральную, и 21 — отрицательную. Средняя оценка отзывов — 4 (из 5). Голоса распределились так: 332 — за, 100 — против.

Запчасть не участвует в рейтинге из-за малого количества отзывов. Вы можете помочь это исправить, если напишите отзыв на моторные масла Eneos.

Пользователи также составили мнение о качествах моторных масел Eneos:

  1. Температура — эффективность при экстремальных температурах — оценивается позитивно. 4.6 балла из 5.
  2. Работа двигателя — влияние на работу двигателя — оценивается позитивно. 3.8 балла из 5.
  3. Расход масла — влияние на потребление масла — оценивается позитивно. 3.6 балла из 5.

Моторное масло Eneos в авторейтингах

Здесь можно узнать владельцы каких марок и моделей ставили моторные масла Eneos на свои авто. Далее список авторейтингов, в которых данная запчасть входит в ТОП-3 лучших:

  1. Eneos на первом месте в авторейтинге моторных масел для: Mitsubishi L200, Toyota Land Cruiser, Nissan AD, Kia Magentis .
  2. Eneos на втором месте в авторейтинге моторных масел для: Mitsubishi Mirage, Toyota Corona, Mazda Familia, Honda Fit, Toyota MR2 .
  3. Eneos на третьем месте в авторейтинге моторных масел для: Toyota Crown, Volkswagen Jetta, Mitsubishi Pajero, BMW X5, Nissan Wingroad .

Моторное масло Eneos в сравнении

На PartReview доступны 60 сравнений моторных масел Eneos c другими производителями.

В частности можно выяснить, чьи моторные масла лучше: Eneos или Eurol, Eneos или AMSOIL, Eneos или REPSOL, Eneos или Fanfaro, Eneos или Chevron .

Масло Eneos — какие отзывы, плюсы и минусы?

Моторное масло Eneos производится в Корее, и уже довольно давно присутствует на отечественном рынке, являясь достаточно распространённым смазочным материалом в своём сегменте, среди большого количества автовладельцев.

Оригинальное масло Eneos в течение относительно длительного периода создаётся совместно с японскими специалистами, и характерно использованием в производстве множества самых различных передовых разработок и технологий, позволяющих поддерживать качество масла на высоком уровне, вместе с развитием самих автомобильных двигателей. Масло бренда Eneos может похвастаться официальным соответствием множеству международных стандартов по различным видам классификаций. Помимо большой популярности и признанности в Азии, моторные масла Eneos также активно реализуются и в Европе, где составляют достаточно уверенную конкуренцию другим компаниям-производителям.

Очевидным минусом масел данного производителя является его пока ещё недостаточная популярность, как бренда, и как следствие, распространённые низкокачественные подделки на рынке, которые иногда очень трудно идентифицировать как подделку.

Также минусом можно назвать относительно маленькое щелочное число масла на уровне 5.65-6.00, что не выходит за пределы нормы в Азии, однако может негативно сказаться на двигателях, в которых масло не меняется чаще, чем один раз на 10 000 километров пробега, а также при определённых климатических условий. Иногда масло не держит должных характеристик, и меняет свои свойства слишком быстро, за первые 2-3 тысячи километров, может появиться посторонний шум двигателя. Ещё одним минусом можно назвать относительно бедный пакет присадок, в результате чего масло в некоторых двигателях может течь. Кроме того, масло часто «съедается» достаточно быстро.

Плюсы продукции Энеос заключаются в способности поддерживать должный уровень чистоты в двигателе, при этом, не образовывая чрезмерный угар. Также масло поставляется в очень удобных банках, которые позволяют не только удобно заливать масло, но и безопасно возить его с собой в багажнике автомобиля.

Как показывает практике, масло подобного типа лучше всего подходит для двигателей на автомобилях азиатских производителей, с желательной его заменой один раз в пределах каждых 10 000 км пробега.

особенности, отзывы, фото- и видеообзор

Название компании Eneos в переводе с греческого означает «Новая энергия». И это название полностью отвечает действительности, так как в данную марку масла разработчики вложили самые прогрессивные технологические разработки, отвечающие лишь высоким стандартам. В основе всех смазывающих жидкостей этой компании — формула Cutting-Edge Technology, которая создавалась вместе с японскими производителями автомобилей.

Моторное масло компании Eneos полностью отвечают самым высоким требованиям SAE, ACEA, API, ILSAC, что делает его серьезным конкурентом на мировом рынке смазывающих материалов. Масло Eneos 5w30 синтетика — отзывы о которой в основном положительные — по своим характеристикам и адаптированностью к нашим условиям может стать маркой номер один в нашей стране.

Масло в канистрах различного размера

Компоненты смазывающих смесей Eneos производятся в Японии. Далее отправляются в Южную Корею, где на предприятии – блендере, в них добавляют присадки для адаптации под наши условия, которые принято считать экстремальными: перепады температур, грязь, низкокачественное топливо (вследствие высокого щелочного числа в силовом агрегате полностью происходит нейтрализация продуктов сгорания, благодаря чему мотор остается постоянно чистым). Вся продукция компании Eneos располагает специальными пакетами присадок, которые обеспечивают совершенную функциональность той системы, для которой она создавалась.

Большой плюс масла Eneos — это цена, которая существенно ниже масел с такими же характеристиками. Это стало возможным, благодаря отсутствию посреднических звеньев в цепи дистрибьюторов.

Содержание

[ Раскрыть]

[ Скрыть]

Технические характеристики

На нашем рынке продукция Eneos представлена более чем тридцатью видами, специализированными для большого диапазона различных устройств: от тяжелогрузной техники до гоночных автомобилей. Автомасла компании Eneos выпускаются как на синтетической, так и на полусинтетической основе. Коротко становимся на каждой из них.

Синтетическое

Синтетическое масло Eneos 5w30

Новейшая ILSAC GF-5 классификация означает более высокую производительность, нежели наиболее распространенная сейчас GF-4. Синтетика 5W30 ILSAC GF-5 отличается более высокой экономией горючего, продлевает ресурс выхлопной системы. Улучшает очистку поршневой системы, препятствует появлению шламовых отложения и образованию нагара в моторе, также повышает защищенность турбокомпрессора. Отличается одной из лучших высокотемпературной сопротивляемостью. Идеальная очистка мотора и высокое сопротивление влаге. Минимизированный расход масла. Отвечает допускам ILSAC GF-5 и API.

Полусинтетическое

Полусинтетика Eneos 5w30 – это продукт новейшего технологического процесса в изготовлении автомасел. Его уникальная полусинтетическая основа с оптимальным набором присадок гарантируют надежную работу мотора, при этом увеличивая его ресурс. Масло ENEOS 5w-30 часто применяется, как базовая смазка в четырехтактных моторах, работающих на бензине в автомобилях, небольших автобусах и фургонах.

Устойчивая масляная пленка гарантирует высочайшие противоизносные характеристики и отличается стабильной вязкостью даже при очень высоких температурах. С защитой от всевозможных отложений и нагара отлично справляются диспергирующие и стабилизирующие присадки. Моторное масло Eneos обладает высокими антикоррозийными характеристиками, длительным сроком эксплуатации, что существенно продлевает ресурс узлов двигателяя. Отличная вязкость при низких температурах гарантирует хороший пуск даже при больших морозах.

Масло для гоночных автомобилей

Отзывы

Синтетическое

Положительные отзывыОтрицательные отзывы
Тихая работаЗамерзает при больших морозах
Экономит горючее
Легко заводится в любое время года
Невысокая стоимость

Полусинтетическое

Положительные отзывыОтрицательные отзывы
Хороший холодный старт даже в морозыСильно угорает
Стабильная вязкостьРедко в продаже
Хорошо чистит двигательБыстро расходуется
Невысокая стоимостьНе смягчает работу мотора, как обещано изготовителем
Если старый двигатель, то плохо заводится зимой
 Загрузка . ..

Видео «Тест масла ENEOS на автомобиле БМВ»

В этом ролике показан тест масла Eneos 5w30 на автомобиле БМВ.

Синтетическое масло Eneos 5W40 и отзывы пользователей

Название компании-изготовителя масла Eneos на греческом значит «новая (или обновленная) энергия». Связано это с новейшими технологическими новшествами, которые используются при изготовлении масла.

Содержание статьи

Достоинства и преимущества

Главным достоинством марки Eneos, а также всего ряда масел, в том числе 5W40, является вхождение в состав формулы Cutting-Edge Technology. Созданная в Японии и производимая в Корее, на местных промышленных объектах, она учитывает все особенности и потребности автомобиля. В создании формулы также приняли участие представители Японского автопрома, на основании сотрудничества с которыми и получился настолько универсальный продукт.

Процесс изготовления разбит на несколько этапов, интересным фактом есть то, что частично масло изготавливают в обеих странах. Так, например, компоненты разрабатывают в Японии, после чего их отправляют на соединение  в Корею. Благодаря присадкам, которые нейтрализуют продукты сгорания, двигатель остаётся более чистым даже после длительного применения масла Eneos

Eneos — марка масла, которая абсолютно и полностью отвечает мировым стандартам. Среди норм и требований, которые следует отметить, есть SAE, ACEA, API, ILSAC.

Благодаря своим техническим свойствам масла Eneos могут составить достойную конкуренцию.

Подыскав в Интернете моторное масло Eneos 5W40 и отзывы о нем, можно смело покупать. Но следует помнить, что в Кореи или Японии вряд ли удастся приобрести оригинал. Дело в том, что жители этих стран создали его с целью экспорта, поэтому в основном продается на просторах СНГ. Хотя в этом также есть и огромный плюс, ведь масла по своим теххарактеристикам и главным свойствам полностью прошел адаптацию как к погодным условиям в РФ, так и к конкурентной среде, что позволило рассчитывать на достаточно хорошее масло по умеренной цене.

Отзывы, которые можно увидеть в сети, преимущественно положительные. Это в первую очередь касается нескольких аспектов — низкого выгорания, удобной тары и других.

Отзывы о синтетическом масле Eneos 5W40

Вот что пишут о масле марки в сети автолюбители и автовладельцы:

Отзывы пользователей
1Как только отдал Eneos для лабораторного анализа (на перерабатывающий завод), мне все параметры показались нормальными, кроме щелочного. 5,65 — достаточно низкое и в Японии это нормально — на уровне 6-7, но для наших то тяжелых условий — разве подойдет? Для наших условий и климата норма — это 7-9, да и меняем мы масло реже, чем японцы. У них раз на 5000-7000 километров происходит замена масла, а у нас — раз на 12000 километров. Неясно как-то…
2Уже больше 5 лет лью это масло себе, подсказал еще предыдущий владелец. По сравнению с 10W40 выгорает немного меньше, а 5W40 практически не перегорает — и это при том, что наездил уже 300000 километров.
3Достало меня постоянно экспериментировать, после того как пришлось менять шатунные вкладыши. Это так я залил Мобил. Искал другое, наткнулся на Eneos (и раньше уже пользовался их продукцией, в частности, дексронами), решил залить его. 4000 км проехал, остался доволен — ни постоянных до этого шумов не осталось, двигатель заработал мягко (не так, как до этого на Кастроле). Расход топливный снизился — на уровне 7 литров на 100 километров  теперь, хотя раньше до 7,8 доходил.
Старенький Мицубиси Лансер после этого масла впервые пришлось лечить: не заводился зимой, началась протечка сальника, под колпаком появилась эмульсия. Это было в 2006 году, масло мало где продавалось. Подумал, что нарвался на подделку, и решил поискать в другом месте. Нашел, залил, все проблемы исчезли. Сейчас не использую, потому что фирменное масло, как говорят, лучше, а играться и пробовать охоты нет.

Eneos Super Gasoline 5W-30 полусинтетическое масло, характеристики и отзывы

Eneos Super Gasoline 5W-30 – полусинтетическое масло для надежной защиты и продления ресурса двигателя. Представляет собой всесезонное масло с эффективными моющими и чистящими присадками, которые усилены за счет добавления синтетических компонентов. Масло Eneos адаптировано к различным климатическим и дорожным нагрузкам, а также подходит для разных стилей вождения. Обладает прочной масляной пленкой с прочной структурой, которая не разрушается под негативным воздействием каких-либо внешних и внутренних факторов. Рассчитано на длительный срок службы без необходимости внеплановой замены. Увеличивает ресурс двигателя, повышает его топливную экономичность, а также снижает уровень шумов и вибраций благодаря плавному скольжению деталей, которые взаимодействуют друг с другом.

Eneos SL 5W-30 подходит для четырехтактных бензиновых двигателей атмосферного или турбированного типа, а также с мультиклапанной системой. Также заявлена совместимость с каталитическими нейтрализаторами, которые отвечают за снижение токсичности отработанных газов. Кроме того, масло обладает устойчивыми моющими свойствами, которые сохраняют свою полезную способность как можно дольше, и независимо от стиля вождения – будь то спокойная или интенсивная езда на максимальной скорости, а также с частыми стартами, остановками и резкими маневрами в светофорных городских пробках.

Как расшифровать 5W-30 в названии масла

  • 5 – адаптация к низким температурам до минус 30-35 градусов
  • W – адаптация к холодным климатическим условиям
  • 30 – совместимость с плюсовыми температурами до 30 градусов Цельсия

Технические характеристики

  • Вязкость (кинематическая) при 40 гр. – 65,81
  • Вязкость (кинематическая) при 100 гр. – 9,77
  • Температура застывания – минус 42 гр.
  • Общий щелочной показатель – 5,98 мг КОН/г
  • Температура вспышки – 220 гр.

Спецификации

  • ACEA A3
  • API SL
  • ILSAC GF-3
  • OEM MB 229.1;
  • VW 502.00;
  • VW 505.00

Видео

Отзыв о Eneos Super Gasoline 5W-30

Как стареет Eneos Super Gasoline 5W-30 в двигателе

Плюсы

  1. Безопасные показатели угарности, летучести и испаряемости, а также отсутствие пены в холодном и горячем состояниях
  2. Снижение расхода топлива, повышение производительности и КПД двигателя
  3. Высокие моющие и чистящие характеристики обеспечивают комплексную защиту ДВС от чрезмерного износа, перегрева и сухого трения, в том числе благодаря прочной масляной пленке
  4. Диспергирующие и солюбилизирующие характеристики способствуют растворению мелких грязевых отложений (частицы сажи, шлама и т. д.) в моторном масле, которое при этом не густеет и сохраняет свою текучесть в морозную погоду
  5. Эффективный холодный запуск благодаря быстрой прокачке масла, а также его способность поддерживать оптимальное давление в теплую погоду
  6. Высокий уровень антикоррозионной защиты позволяет минимизировать вред металлических деталей на протяжении всего срока службы ДВС
  7. Максимальная совместимость с современными бензиновыми моторами, а также их уплотнителями для защиты от протечек
  8. Защита от термических и окислительных процессов, а также эффективное отведение тепла и охлаждение поршней, поршневых колец и других компонентов, наиболее подверженных перегреву.

Минусы

  1. Большое количество подделок из-за дефицита на российском рынке
  2. Условная совместимость с очень старыми двигателями, которые склонны к протечкам из-за микротрещин и ослабления герметичности уплотнителей.

Форма и объем выпуска

Как выбрать оригинальное масло

  1. Масло кустарного производства, как правило, стоит на 10-20% дешевле оригинала, и продается в основном в малоизвестных торговых сетях, которые только открылись, не могут предоставить никаких гарантий, а скорее наоборот – могут сделать виноватым пострадавшего покупателя. Крупные магазины, свою очередь, наоборот, возлагают всю ответственность на продавца, которому невыгодно торговать подделкой. Этим можно объяснить низкую вероятность контрафакта в наиболее известных магазинах. Однако есть мошенники, которые продают контрафактное масло по цене оригинала, и тем самым могут избежать подозрений. Поэтому далее рассмотрим другие варианты отличий контрафакта от оригинала.
  2. Оригинальная канистра с маслом изготовлена из качественного пластика, который имеет вкрапления и переливается на свету, как краска металлик. Также отметим гладкую поверхность и ровные края. Подделка, в свою очередь, имеет неоднородный пластик, который довольно тонкий и просвечивается, из-за чего можно даже увидеть места спайки двух половинок канистры. Еще канистра может иметь неровную разметку шкалы уровня масла.
  3. Стопорное кольцо-пломба с усиками, которые фиксируют крышку и обеспечивают защиту от протечек, свидетельствует о подлинности изделия. Дело в том, что мошенники используют обычный клей, из-за чего канистра со временем начинает протекать, если ее перевернуть вверх дном.
  4. Штрихкод или логотип производителя, расположенный на боковой поверхности крышки и стопорного кольца. Размещен таким образом, что при открытии крышки надпись с логотипом разделяется на две половинки, которые невозможно восстановить в кустарных условиях.
  5. Подделку можно отличить по более узкой форме ребер крышки в сравнении с оригиналом.
  6. Защитная голограмма с меняющимися символами Original или Genuine, которые видны под углом. Они исчезают после открытия крышки.
  7. Дата производства масла, как правило, не совпадает с датой изготовления канистры, которая произведена раньше масла. Сведения о сроке годности и номере партии есть только у оригинальной канистры.
  8. Этикетка наносится на канистру ровно и не должна иметь пузырей. Поддеть такую наклейку не так просто подручными средствами. Шрифт на этикетке – всегда четкий и без ошибок, а качество полиграфии не должно привлекать внимание блеклыми и размытыми изображениями, которые не имеют градиентов и переходов цветов – именно это отличает поддельную этикетку от оригинала.

Выводы

Eneos Super Gasoline SL 5W-30 – полусинтетика с набором сильнодействующих полезных свойств, которые продолжают действовать вплоть до следующей замены масла, без необходимости внеплановой доливки. Несмотря на полусинтетическую основу, в масле используются синтетические компоненты, устойчивые к перегрузкам в широком диапазоне температур, а также независимо от стиля вождения. Масло Eneos является универсальным и подходит для всех типов бензиновых ДВС автомобилей Фольксваген и Мерседес-Бенц.

Отзывы автовладельцев о Eneos Super Gasoline 5W-30

  • Ярослав, Краснодарский край. Добротное масло, но ничего выдающегося. Стандартная полусинтетика, способная поддерживать мотор в рабочем состоянии. Но если агрегат уж очень старый, тогда возможны протечки даже с полусинтетическим маслом – виной тому наличие микротрещин и ослабевших уплотнителей, как было в случае с моей Опель Омегой с пробегом за 200 тыс. Сейчас у меня более свежая Королла, но тоже далеко не молодой аист. Протечек нет, угара нет, продукты износа в минимальном количестве. Масло светлее чем Кастрол, Шелл и другие брендовые смазки, что говорит о худших моющих свойствах, например, после 3-х тыс. км. Жидкость Eneos темнеть не спешит, а интервал замены составляет 7-8 тыс. км.
  • Андрей, Таганрог. Eneos Super Gasoline SM 5W-30 – полусинтетическое масло с универсальными параметрами, которые подходят для низких и высоких температур. Масло не густеет, не замерзает, не склонно к образованию грязевых отложений спустя 4-5 тыс. км. У меня регламент 7 тыс. км, что для полусинтетики абсолютно нормально. Двигатель работает тихо и шустро, не издает посторонних звуков, вибраций и шумов – явный признак на эффективную смазку деталей, которые скользят плавно и почти бесшумно.
  • Михаил, Калининградская область. Eneos 5W-30 SL – «проходное» масло, не имеющее преимуществ на фоне конкурентов. Оно мне нравится невысокой ценой и хорошими моющими свойствами, а также оно адаптировано к всесезонным условиям. Ну и самый главный плюс в моем случае – оно идеально совместимо с моим «бородатым» Мерседесом 190. Хорошо раскрывает потенциал ДВС – я был приятно удивлен этому. Масло устойчиво к температурным нагрузкам, и его по праву можно считать всесезонной полусинтетикой.

Upstate Chevrolet — Chevrolet, Продавец подержанных автомобилей, Сервисный центр

Если возможно, даст 0. Несколько недель назад у моего автомобиля была такая проблема, когда вода капала внутрь заливной горловины, замерзала и не позволяла открывать крышку, чтобы я мог качать бензин. У Chevrolet Equinox 2018 есть герметичное уплотнение на двери, поэтому газовая крышка отсутствует. Приняли его в этом представительстве, и пара рабочих пришла к выводу, что, поскольку они никогда не видели и не сталкивались с подобной проблемой и не знали, как ее исправить, они сломают заслонку и уберут лед.Они осмотрели мой автомобиль, увидели, что на него не распространяется гарантия, и посоветовали мне, что на эту деталь не будет распространяться гарантия, но, поскольку они причинили ущерб, они должны будут исправить это. Это решение принял сотрудник по имени Кейден, но он обсудил его с другим работающим техником. Он заказал деталь, а через 3 недели подтвердил, что она пришла, и назначил встречу, чтобы они ее заменили. Вот где история становится веселее … Сегодня я использовал вал отбора мощности, чтобы привезти мою машину, заменить деталь и пройти техосмотр.Примерно через 20 минут после того, как я ушел, Кэйден позвонил мне и сообщил, что его менеджер Джесси решил, что, поскольку моя гарантия недействительна, они не будут покрывать расходы, и, хотя они сломали ее, они не исправят ее, и это будет стоить мне около 430 долларов за замену детали. Я отклонил продуманное предложение, лол Чего я не понимаю, так это того, почему Джесси делает вид, будто его компания не знала о том, что гарантия закончилась, когда его сотрудник Кейден сообщил мне, что моя гарантия закончилась, когда я впервые появился там в начале декабря. и сказал мне, что, поскольку он сломал заливную горловину, его компания должна будет заменить ее.Самое приятное то, что после того, как они завершили проверку, они попросили меня подписать некоторые документы … Я подумал, что это странно, что они попросили меня подписать два отдельных пакета, а второй пакет аккуратно поместили под некоторые счета-фактуры проверки, чтобы только подпись область была видна … оказывается, частично скрытый пакет был документами для заливной горловины, за которую они не хотят нести ответственность. Первый пакет был инспекционной документацией, так почему они дошли до того, что использовали другие счета-фактуры из этого пакета, чтобы скрыть заказ на обслуживание и договор на заправочную горловину, даже закрепив счета наверху, пытаясь обмануть меня, чтобы подписать Это.Когда я начал расспрашивать об этом, мне сказали, что им нужны документы, я не могу получить их все, но могу иметь копию титульного листа, и мне нужно подписать оба пакета за выполненную работу. Я не согласился, у них есть моя подпись за выполненную работу, то есть инспекцию. Я отказался закончить свою подпись на втором пакете и оторвал свое имя, так что, надеюсь, они не пытаются утверждать, что я подписал его сознательно. Всегда знайте, что вы подписываете, потому что эти ребята пытались обманом заставить меня подписать документы, в которых говорилось, что я буду нести ответственность за ту часть, которую они намеренно повредили. Я позвонил в Корпоративный Chevrolet и объяснил им, что произошло, но не жду многого. Пока есть открытое дело. Все, что я хочу, — это чтобы другие члены сообщества знали об этом инциденте, чтобы они могли быть осторожными, я слышал о других бензобаках без крышки, у которых есть проблемы, и мне бы не хотелось, чтобы они были вовлечены в подобные махинации … i есть фотографии подписи, которую мне пришлось удалить из-за их неэтичного поведения.

Читать далее

Масло рисовых отрубей первого отжима облегчает гипертонию за счет активации eNOS и уменьшения окислительного стресса и воспаления у крыс с гипертензией, вызванной L-NAME., Питание

ЦЕЛЬ Эндотелиальная дисфункция, связанная со снижением биодоступности оксида азота (NO), играет важную роль в развитии гипертонии. Похоже, что потребление диеты, богатой антиоксидантами, снижает риск гипертонии. Масло из рисовых отрубей первого отжима (VRBO) обладает антиоксидантной, противовоспалительной и гипохолестеринемической активностью.Однако, насколько нам известно, антигипертензивный эффект VRBO не исследовался. Целью этого исследования было изучить антигипертензивный эффект VRBO у крыс с гипертонической болезнью, индуцированной Nω-нитро-1-аргинином (L-NAME), и лежащие в ее основе механизмы. МЕТОДЫ Гипертонию у крыс вызывали введением L-NAME, после чего вводили VRBO, лизиноприл (Lis) или VRBO + Lis. Затем были проведены исследования гемодинамики сосудистых реакций на вазоактивные вещества, ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) плазмы, нитрат / нитрит плазмы, окислительный стресс и маркеры воспаления.ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Введение L-NAME вызывало гемодинамические изменения, включая повышение артериального давления, повышенное сопротивление периферических сосудов и эндотелиальную дисфункцию. У крыс с гипертензией L-NAME наблюдались снижение уровня нитрата / нитрита в плазме, гиперпродукция сосудистого супероксида и повышение уровня АПФ, малонового диальдегида, карбонила белка и фактора некроза опухоли плазмы-α. Изменения были связаны с заметным снижением экспрессии эндотелиальной NO-синтазы, повышенной экспрессией gp91phox и молекулы-1 адгезии сосудистых клеток и активацией ядерного фактора-κB в тканях аорты.Применение VRBO или Lis значительно смягчило все эти вредные эффекты. Комбинация VRBO и Lis была более эффективной, чем любое лечение по отдельности. ВЫВОДЫ Антигипертензивный эффект VRBO может быть опосредован восстановлением гемодинамики, увеличением биодоступности NO и облегчением окислительного стресса и воспаления. VRBO оказывает аддитивное действие на антигипертензивные препараты.

中文 翻译 :


处女 米糠油 通过 上调 eNOS 并 减轻 L-NAME 诱导 的 高血压 大鼠 的 氧化 应激 和 炎症 减轻 高血压。

的 与 一 氧化氮 (NO) 生物 利用 度 降低 相关 的 内皮 功能 障碍 在 高血压 的 发展 中 起 重要 作用。 食用 富含 抗 的 饮食 可以 降低 患 高血压 米糠油 (VRBO)抗 氧化 , 消炎 和 降 胆固醇 的 活性。 然而 据 我们 所知 , 尚未 VRBO 的 降压 作用。 这项 研究 的 目的 是 VRBO 在 Nω- 硝基 -1- 精氨酸 甲酯 (L- НАЗВАНИЕ) 诱导 的 高血压 大鼠 中 的 抗 高血压 作用 及其 潜在 机制。 方法 通过 给予 L-NAME 诱导 大鼠 高血压 , 然后 给予 VRBO , 赖诺普利 (Lis) 或 VRBO + Lis。 然后 研究 了血管 对 血管 活性 物质 反应 的 血液 动力学 , 血浆 血管紧张素 酶 (ACE) , 血浆 硝酸盐 / 亚 , 氧化 应激 和 标志 物。 L-NAME 给药 可 引起 动力学 变化 ,包括 血压 升高 , 外周血 管 阻力 增加 和 功能。 L-NAME 高血压 大鼠 中 观察 到 血浆 硝酸盐 / 亚 硝酸盐 的 减少 , 血管 的 过量 产生 以及 血浆 ACE , 丙二 醛 ,羰 基 和 肿瘤 子 -α 的 增加。 这些 变化 与 主动脉 组织 中 的 显 的 降低 gp91phox 和 -1 因 子 -κB使用 VRBO 或 Lis 可以 显 着 减轻 所有 这些 有害 影响 。VRBO 和 Lis 的 联合 治疗 单独 的 两种 治疗 更 有效。 VRBO 的 降压 作用 可能 是 通过 , NO 的 生物 利用 度 以及减轻 氧化 应激 和 炎症 来 介 导 的 。VRBO 对 降压 药物 有 加 和 作用。

Масло рисовых отрубей первого отжима снижает артериальную гипертензию за счет активации eNOS и уменьшения окислительного стресса и воспаления у крыс с гипертензией, вызванной L-NAME

Цель: Эндотелиальная дисфункция, связанная со снижением биодоступности оксида азота (NO), играет важную роль в развитии гипертонии. Похоже, что потребление диеты, богатой антиоксидантами, снижает риск гипертонии. Масло из рисовых отрубей первого отжима (VRBO) обладает антиоксидантной, противовоспалительной и гипохолестеринемической активностью. Однако, насколько нам известно, антигипертензивный эффект VRBO не исследовался. Целью этого исследования было изучить антигипертензивный эффект VRBO у крыс с гипертонической болезнью, индуцированной Nω-нитро-1-аргинином (L-NAME), и лежащие в ее основе механизмы. Методы: Гипертонию у крыс вызывали введением L-NAME, после чего вводили VRBO, лизиноприл (Lis) или VRBO + Lis.Затем были проведены исследования гемодинамики сосудистых реакций на вазоактивные вещества, ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) плазмы, нитрат / нитрит плазмы, окислительный стресс и маркеры воспаления. Полученные результаты: Введение L-NAME вызывало гемодинамические изменения, включая повышение артериального давления, повышенное сопротивление периферических сосудов и эндотелиальную дисфункцию. У крыс с гипертензией L-NAME наблюдались снижение уровня нитрата / нитрита в плазме, гиперпродукция сосудистого супероксида и повышение уровня АПФ, малонового диальдегида, карбонила белка и фактора некроза опухоли плазмы-α.Изменения были связаны с заметным снижением экспрессии эндотелиальной NO-синтазы, повышенной экспрессией gp91phox и молекулы-1 адгезии сосудистых клеток и активацией ядерного фактора-κB в тканях аорты. Применение VRBO или Lis значительно смягчило все эти вредные эффекты. Комбинация VRBO и Lis была более эффективной, чем любое лечение по отдельности. Выводы: Антигипертензивный эффект VRBO может быть опосредован восстановлением гемодинамики, увеличением биодоступности NO и облегчением окислительного стресса и воспаления.VRBO оказывает аддитивное действие на антигипертензивные препараты.

Брайан Энос Slide-Glide — Dawson Precision, Inc.

• Смягчает войлочную отдачу в полуавтомобилях
• Супер «тягучий» — он остается там, где вы его положите — навсегда
• С добавлением высококачественного противозадирного компаунда

От самого Брайана Эноса:
Slide-Glide — это смазка с уникальной формулой, которая защищает все огнестрельное оружие от коррозии и износа. Он также смягчает «ощущаемую отдачу» во всех полуавтоматах, особенно в пистолетах.

Slide-Glide обеспечивает резкое улучшение смазки по сравнению с обычными маслами и консистентными смазками, такими как металлические смазки на литиевой или литиевой основе, содержащие молибден или графит.

Кроме того, он спроектирован так, чтобы иметь вязкую характеристику, которая предотвращает «трескание» или срезание скользящих металлических поверхностей. Он остается на месте — беспрерывно втягивая себя обратно в зоны трения велосипедного затвора и ствола. Slide-Glide Lite (тонкая вязкость)

Заявки:

  • 30+ градусов F
  • Все огнестрельное оружие:
  • Пистолеты центрального огня
  • Без компенсации и без компенсации
  • Винтовки: все типы действий (включая рычажные)
  • Ружья: все типы действия
  • Револьверы (только детали внутреннего действия — не для цилиндра)
  • .22 ◦ «Carry Guns» Применяется крайне экономно для максимальной надежности

Вязкость Slide-Glide Lite специально подобрана для «открытых пистолетов IPSC» при любой температуре, а также отлично работает с «коннектором» Glock.

Подробнее ..
Slide-Glide Lite — это все, что вам нужно для максимальной защиты от износа. Но для максимального гашения отдачи — используйте самую густую вязкость, которая позволит вашему пистолету работать со 100% надежностью при температуре, в которой вы стреляете.

Cary or Duty Pistols:
Slide-Glide — это смазка, поэтому она снижает скорость скольжения пистолета (по сравнению с маслом). Для переносных или служебных пистолетов защита от износа не является проблемой — 100% надежность является наиболее важным фактором. По этой причине я рекомендую Slide-Glide Lite только для переносных или служебных пистолетов. И даже тогда — очень экономно!

Полимер или нержавеющая сталь:
Slide-Glide отлично подходит для пистолетов с полимерной рамой, таких как Glocks и Springfield Armory XD. Что касается пистолетов из нержавеющей стали, у меня было довольно много сообщений о том, что Slide-Glide сделает пистолет функционирующим со 100% надежностью — он практически не работал бы с любым другим маслом или смазкой.

ПЕРЕД стрельбой из Slide-Glide на соревнованиях:
Проверьте вязкость и количество нанесенного раствора при температуре, при которой вы будете стрелять! Его вязкая характеристика удерживает смазку между движущимися частями, что заметно смягчает ощутимую отдачу полуавтоматических пистолетов. Когда вы стреляете из пистолета, он кажется «более гладким».

С тремя значениями вязкости на выбор существует вязкость Slide-Glide, которая снижает износ и улучшает работу любого огнестрельного оружия, инструмента или машины.

Активация эндотелиального оксида азота (eNOS) происходит через различные мембранные домены в эндотелиальных клетках

Abstract

Эндотелиальные клетки реагируют на широкий спектр стимулов, включая циркулирующие липопротеины, факторы роста и изменения гемодинамических механических сил, чтобы регулировать активность эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и поддерживать кровяное давление.Хотя были картированы многие сигнальные пути, идентичность мембранных доменов, через которые передаются эти сигналы, охарактеризована не так хорошо. Здесь мы манипулировали эндотелиальными клетками бычьей аорты (BAEC) холестерином и оксистерином 7-кетохолестерином (7KC). Используя ряд методов микроскопии, включая конфокальную, 2-фотонную, микроскопию сверхвысокого разрешения и электронную микроскопию, мы обнаружили, что обогащение стеролов оказывает различное влияние на колокализацию eNOS и кавеолина-1 (Cav1), порядок мембран плазматической мембраны, числа кавеол и Cav1. кластеризация.Мы обнаружили корреляцию между индуцированной холестерином конденсацией плазматической мембраны и повышенной активностью eNOS, вызванной липопротеинами высокой плотности (HDL), и фосфорилированием, предполагая, что домены холестерина, но не отдельные кавеолы, опосредуют стимуляцию eNOS HDL. Активность eNOS, вызванная фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и напряжением сдвига, относительно не зависит от порядка мембран и может преимущественно контролироваться количеством кавеол на поверхности клетки. Взятые вместе, наши данные предполагают, что сигналы, которые активируют и фосфорилируют eNOS, передаются через отдельные мембранные домены в эндотелиальных клетках.

Образец цитирования: Тран Дж., Магенау А., Родригес М., Рентеро С., Ройо Т., Энрих С. ​​и др. (2016) Активация эндотелиального оксида азота (eNOS) происходит через различные мембранные домены в эндотелиальных клетках. PLoS ONE 11 (3): e0151556. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556

Редактор: Иван Р. Наби, Университет Британской Колумбии, КАНАДА

Поступила: 30 августа 2014 г .; Дата принятия: 1 марта 2016 г .; Опубликовано: 15 марта 2016 г.

Авторские права: © 2016 Tran et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе.

Финансирование: Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом (ARC) и Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (грант программы 1037320).TG получил поддержку Сиднейского университета, Австралия (U1758, U7007). CE получил поддержку от Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; BFU2012-36272, CSD2009-00016) и Fundació Marató TV3 (PI042182) (Испания). CR получил докторскую стипендию (CSD2009-00016) в рамках исследовательской программы CONSOLIDER-INGENIO (MINECO) и поддержку от Fundació Marató TV3. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Introduction

Плазматическая мембрана организована в отдельные домены, которые, как полагают, имеют характерный липидный состав и содержат подмножество мембранных белков [1]. Такая компартментализация может иметь решающее значение для регуляции сигнальных путей [2]. Наиболее заметные липидные домены, липидные рафты, определяются как небольшие временные структуры в плазматической мембране, которые обогащены холестерином и гликосфинголипидами [1]. Первоначально идентифицированные как устойчивые к детергентам мембраны (DRM) [3], гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -зависимые белки, ацилированные белки и отдельные трансмембранные белки [1, 2], как предполагается, связаны с липидными рафтами из-за преимущественного разделения на высокоупорядоченные области восстановленные [4–8] и клеточные мембраны [9, 10].В восстановленных мембранах холестерин и сфинголипиды способны способствовать разделению фаз между жидкоупорядоченной (l o ) и жидко-неупорядоченной (l d ) фазами [11]. Следовательно, биофизическим признаком липидного рафта является высокий порядок мембран, который можно количественно оценить с помощью флуоресцентного липидного красителя, 6-лауроилпропион-2-диметиламино-нафталина (лаурдана) и двухфотонной микроскопии [12, 13].

Кавеолы ​​- специализированные домены плазматической мембраны, содержащие интегральный мембранный белок кавеолин-1 [1, 14].Они классифицируются как относительно небольшие (50–100 нм) колбообразные инвагинации плазматической мембраны [15]. Выделение богатых кавеолином мембран методами устойчивости к детергентам привело к идентификации ряда белков, связанных с кавеолами, таких как рецепторы скавенджеров класса B CD36 и SR-BI для модифицированного липопротеина низкой плотности (ЛПНП) и липопротеина высокой плотности (ЛПВП). ) соответственно, а также GPI-сцепленные белки и множественные цитоплазматические сигнальные молекулы [16, 17].

Одной из ключевых функций эндотелиальных клеток является производство оксида азота (NO), а ферментом, ответственным за производство NO, является эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS).В эндотелиальных клетках eNOS генерирует NO в реакции превращения L-аргинина в L-цитруллин [18]. Эндотелиальные изоформы NOS связывают кальмодулин (CaM) зависимым от кальция (Ca 2+ ) образом и могут активироваться различными внеклеточными стимулами, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), HDL, напряжение сдвига и фармакологические агенты, которые увеличивают внутриклеточные Ca 2+ [19, 20].

eNOS располагается на плазматической мембране [19], комплексе Гольджи [21], цитозоле, митохондриях и ядре [22].На плазматической мембране ассоциация eNOS с кавеолами и некавеолярными доменами внутри плазматической мембраны, как было установлено, зависит от ее пальмитоилирования, миристоилирования и фосфорилирования [23, 24]. eNOS также взаимодействует с Cav1 независимо от состояния ацилирования фермента [25], а Cav1 негативно регулирует eNOS в кавеолах [26]. В частности, последние исследования с использованием линий клеток рака щитовидной железы и простаты крыс предоставили первый пример пространственной регуляции передачи сигналов в кавеолах, которые отличаются от некавеолярных рафтовых доменов [26].Остатки 82-101 в каркасном домене Cav1, как предполагается, связывают eNOS, ингибируя взаимодействие фермента с Ca 2+ -CaM [27, 28], хотя детали взаимодействия ставятся под сомнение [29]. Исследования in vivo показали, что избыточная экспрессия Cav1 в эндотелиальном слое ингибирует VEGF-опосредованную активацию eNOS [30]. Напротив, Cav1-дефицитные мыши имели повышенную активность eNOS и системные уровни NO [31]. Эти исследования предполагают, что субклеточная локализация eNOS регулирует его активность и, по крайней мере, частично регулируется уровнями экспрессии Cav1.

Несмотря на все вышеупомянутые знания о микродоменах, способствующих активации eNOS [19–31], сравнение того, как обогащение холестерина в эндотелиальных клетках влияет на способность мембранных доменов передавать активирующие сигналы eNOS после стимуляции VEGF, HDL или напряжения сдвига, все еще не хватает. В эндотелиальных клетках VEGF связывается с рецепторами VEGF (VEGFR2, также известными как KDR / Flk-1), которые локализуются в кавеолах и связываются с Cav1 [32] и eNOS [33]. Cav1 негативно регулирует VEGFR2 в нестимулированных условиях.Стимуляция VEGF приводит к быстрой диссоциации VEGFR2 и Cav1 от кавеол [32]. Кроме того, есть доказательства того, что активированный VEGFR2 использует комплексы сигнальных белков в очаговых адгезиях, обогащенных высокоупорядоченными мембранными доменами [34], чтобы инициировать биологические ответы [35, 36].

HDL-опосредованная стимуляция активации eNOS происходит через связывание HDL с SR-BI, которое ассоциируется с DRM и Cav1 [17, 37]. В то время как большая часть современной литературы отдает предпочтение локализации SR-BI в липидных рафтах и ​​кавеолах [38], точная клеточная локализация SR-BI на клеточной поверхности полностью не изучена [39].Связывание HDL с SR-BI может способствовать обмену холестерина и фосфолипидов между плазматической мембраной и липопротеиновой частицей, что может модулировать мембранные домены и косвенно локализацию SR-BI. Наиболее значимая для индуцированной ЛВП активации eNOS, способность SR-BI связывать холестерин и способность способствовать оттоку холестерина является предпосылкой для инициирования каскадов передачи сигнала, необходимых для активации eNOS [38, 40, 41].

Силы напряжения сдвига накладываются непосредственно на эндотелий циркулирующей кровью, а NO, полученный из eNOS, является одним из основных регуляторов реорганизации сосудов в ответ на напряжение сдвига.Гемодинамические силы снимают ингибирование eNOS с помощью Cav1 в кавеолах [42] и повышают его активность, открывая доступ к Ca 2+ -CaM [43]. Исследования in situ показали, что интактные кавеолы ​​на просветной поверхности эндотелиальных клеток необходимы для индуцированной током активации сигнальных путей [43–45], участвующих в фосфорилировании eNOS по Ser 1179 [46, 47]. Напротив, хроническое напряжение сдвига индуцирует транслокацию Cav1 от Гольджи к плазматической мембране и увеличивает образование просветных кавеол, указывая тем самым, что напряжение сдвига играет роль в перемещении кавеолин-1 / кавеол [47, 48].

Поскольку холестерин является неотъемлемым компонентом доменов липидных рафтов и напрямую связывается с Cav1, резкое истощение холестерина с использованием метил-ß-циклодекстрина (mßCD) нарушает не только организацию плазматической мембраны, но также приводит к перемещению eNOS во внутриклеточные пулы с последующим влияет на его активность. Вместо того, чтобы использовать радикальные и нефизиологические агенты истощения холестерина и лучше имитировать колебания клеточного уровня холестерина без отрицательного воздействия на жизнеспособность клеток, здесь мы сравнили эффекты обогащения эндотелиальных клеток холестерином и оксистерином 7-кетохолестерином (7KC) на мембранную организацию. и активация eNOS с помощью VEGF, HDL и напряжения сдвига.7KC менее эффективен, чем холестерин, в образовании комплексов фосфолипид-стерол и комплексов белок-липид, которые поддерживают формирование рафта [49]. Это связано с расположением кислородных фрагментов и хиральной природой оксистеринов, что ограничивает их упаковку в фосфолипидных бислоях [50, 51]. Мы обнаружили, что обогащение холестерина и 7KC по-разному влияет на порядок плазматической мембраны и кавеолы, что позволило нам определить вклад этих доменов в активацию eNOS, стимулируемую VEGF, HDL и напряжением сдвига.

Результаты и обсуждение

Клетки BAEC были обогащены холестерином (chol) или 7-кетохолестерином (7KC) в комплексе с метил-β-циклодекстрином (mßCD) в течение 30 минут при 37 ° C. Это привело к увеличению клеточных стеринов в 1,6–2,2 раза (таблица 1). Постепенно заменяя холестерин на 7KC в комплексе с mßCD в растворе, мы достигли различных соотношений клеточного холестерина и 7KC в диапазоне от 0–30% до 7KC от общей концентрации клеточных стеролов, при этом примерно поддерживая общие уровни стеролов.Хотя 7KC вызывает апоптоз при высоких концентрациях [52], жизнеспособность клеток составляла> 90% во всех условиях (данные не показаны).

Таблица 1. Стерольный состав БАЭК.

BAEC были обогащены 40 мкМ Chol, 20 мкМ 7KC или смесью 20 мкМ Chol и 20 мкМ 7KC (Ch: 7KC). Стерины экстрагировали из полных клеточных лизатов и анализировали с помощью ВЭЖХ. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. трех независимых экспериментов. нет данных = не обнаруживается.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556.t001

Чтобы изучить распределение белков Cav1 и eNOS при обогащении холестерина или 7KC, мы выполнили иммунофлуоресцентную визуализацию и количественно оценили совместную локализацию Cav1 и eNOS путем расчета коэффициента Пирсона (рис. 1). Хотя на общую экспрессию белка не влияла обработка стеролом (фиг. 1A), что подтверждено вестерн-блоттингом (данные не показаны), совместная локализация Cav1 и eNOS была немного снижена после обогащения 7KC (фиг. 1B). Таким образом, мы исследовали субклеточное распределение eNOS и Cav1 более подробно, измеряя интенсивность флуоресценции на периферии клетки по сравнению с внутриклеточной интенсивностью (Рис. 1C – 1F).Мы определили «плазматическую мембрану» как области, находящиеся на расстоянии 5 пикселей (= 1,2 мкм) от края клетки, и «внутриклеточные области», прилегающие к областям плазматической мембраны, но дальше от края клетки. Обогащение 7KC, но не обогащение холестерином, привело к увеличению локализации eNOS на плазматической мембране без изменения интенсивности внутриклеточного окрашивания (рис. 1C и 1D). Напротив, обогащение холестерина увеличивало плазматическую мембрану и внутриклеточное окрашивание Cav1, в то время как обогащение 7KC только увеличивало внутриклеточный Cav1 (рис. 1E и 1F).Тем не менее, индуцированное холестерином перераспределение Cav1, по-видимому, не влияет на совместную локализацию Cav1-eNOS, в то время как индуцированное 7KC увеличение eNOS на плазматической мембране и внутриклеточного Cav1 могло способствовать снижению совместной локализации Cav1-eNOS в этих клетках. (Рис. 1B).

Рис. 1. Иммунофлуоресценция стероловой BAEC.

(A) BAEC, нанесенные на покрытые желатином покровные стекла, обогащали 40 мкМ Chol, 20 мкМ 7KC или смесью 20 мкМ Chol и 20 мкМ 7KC (Ch: 7KC), фиксировали и иммуноокрашивали Cav1-Alexafluor 647 и eNOSIII-. Alexafluor 488 и визуализируется конфокальной флуоресцентной микроскопией.Шкала: 20 мкМ. (B) Корреляция Пирсона совместной локализации Cav1 и eNOS в конфокальных изображениях. (C-F) Интенсивность флуоресценции eNOS (D-C) и Cav1 (E-F) в плазматической мембране (C, E) и во внутриклеточных областях (D, F) на конфокальных изображениях. Плазматическая мембрана была определена как область ~ 1,2 мкм от периферии клетки и внутриклеточные области, прилегающие к областям плазматической мембраны. В C-F каждый символ представляет одно (объединенное) изображение, а горизонтальные полосы указывают средства. Существенные отличия от контрольных клеток проверяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556.g001

Затем мы исследовали, влияют ли холестерин и обогащение 7KC на порядок плазматической мембраны, используя флуоресцентный краситель Лаурдан и 2-фотонную микроскопию. Лаурдан — чувствительный к окружающей среде мембранный зонд, спектр излучения которого показывает степень упаковки липидов в бислое [53]. Мембранный краситель не флуоресцирует в воде и при включении в мембрану смещает свой спектр излучения в соответствии с полярностью мембраны.Например, в жидкоупорядоченных мембранах, подобных плоту, липиды в мембране более плотно упакованы вместе, предотвращая проникновение молекул воды в бислой. Это приводит к синему смещению излучения лаурдана и высокому значению обобщенной поляризации (GP). Хотя нельзя исключить другие факторы, такие как взаимодействие лаурдана с клеточными трансмембранными белками, значения Laurdan GP считаются отличным инструментом для определения порядка мембран. Таким образом, мы записали интенсивность Лаурдана в двух спектральных каналах и рассчитали значение GP для каждого пикселя.Значения GP варьируются от +1 (высокоупорядоченные мембраны) до -1 (очень жидкие мембраны) [34, 53–55]. Чтобы визуализировать порядок мембран, мы сгенерировали псевдоцветные изображения GP контрольных и подвергнутых манипулированию стеролом BAEC с зеленым указанием жидких мембран и красными высокоупорядоченными мембранами (рис. 2A, изображение GP). В соответствии с предыдущими данными [54], обогащение холестерина существенно увеличивало порядок мембран BAEC, в то время как обогащение 7KC обращало этот эффект. Чтобы идентифицировать структуры мембран кавеол, меченные лаурданом клетки были иммуноокрашены на Cav1 и конфокальные изображения были получены на той же глубине фокуса, что и изображения GP (Рис. 2A, Masked GP).Конфокальные изображения Cav1 затем использовались для маскировки изображений GP, чтобы остался только Cav1-положительный пиксель. Сравнение изображений GP с замаскированными изображениями GP показывает, что Cav1-положительные пиксели обнаруживаются преимущественно в высокоупорядоченных мембранах.

Рис. 2. Влияние обогащения стерином на порядок мембран BAEC.

BAEC обогащали 40 мкМ Chol, 20 мкМ 7KC или смесью 20 мкМ Chol и 20 мкМ 7KC (Ch: 7KC) и окрашивали 5 мкМ лаурданом с последующей фиксацией и иммуноокрашиванием на Cav1.(A) Конфокальное изображение окрашивания Cav1-Cy3 (верхний ряд), изображение Laurdan GP с той же глубиной фокуса (средний ряд) и замаскированные изображения GP, показывающие только GP-изображение областей Cav1-позитивной мембраны (нижний ряд). Изображения GP были псевдоокрашены в соответствии с цветовой шкалой, показанной на первом изображении GP. Синий цвет указывает на значения GP 0,3, а красный цвет указывает на значения GP 1,0. Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Общие значения GP плазматической мембраны были определены из изображений GP, записанных при большом увеличении. Все условия обогащения стеролов значительно различались (P <0.001) для контрольных ячеек. (C) Cav1-положительные значения GP мембраны определяли с использованием замаскированного изображения GP. Обогащение холестерина и Chol: 7KC значительно увеличивало порядок мембран (P <0,001), в то время как обработка 7KC также увеличивала порядок мембран по сравнению с контролем (P <0,01). Данные взяты из трех независимых экспериментов с общим количеством клеток 60. В B-C каждый символ представляет собой одно изображение, обычно с одной ячейкой; горизонтальные линии обозначают средства. Значимость проверяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0151556.g002

Чтобы количественно определить порядок мембран плазматической мембраны на основе изображений GP и замаскированных изображений GP, плазматическая мембрана снова была определена как периметр клетки ~ 1,2 мкм (5 пикселей) от периметра клетки. в изображениях с большим увеличением (данные не показаны). Затем мы измерили значения GP всей плазматической мембраны (рис. 2B) и областей Cav1-положительной плазматической мембраны (рис. 2C) и обнаружили небольшие различия между этими доменами. Это неудивительно, учитывая, что и кавеолы, и липидные рафты, вероятно, будут ниже предела разрешения микроскопа, так что Cav1-положительные домены плазматической мембраны могут также содержать не рафтовые домены и наоборот .Однако мы обнаружили значительную разницу между условиями, обогащенными холестерином и 7KC. Обогащение холестерином значительно улучшает порядок мембран за счет увеличения количества рафт-подобных доменов. Учитывая предел разрешающей способности микроскопического подхода, мы не можем различить, было ли увеличение численности рафтов вызвано увеличением числа рафтообразных доменов, то есть кавеол, или увеличенным упорядоченным доменом, увеличением порядка мембран или комбинацией этих процессов. . 7KC обращал эффект обогащения холестерина в зависимости от концентрации, так что клетки, обогащенные 7KC, имели более низкий порядок плазматической мембраны по сравнению с контрольными клетками (рис. 2B).Напротив, Cav1-положительные мембранные домены поддерживают более высокий мембранный порядок даже после обогащения 7KC (Рис. 2C), подчеркивая упорядочивающий эффект Cav1 на его локальное липидное окружение, которое может быть замаскировано в обогащенных холестерином мембранах, которые уже сильно конденсированы.

Затем мы исследовали влияние обогащения стеролом на количество кавеол на клеточной поверхности. Таким образом, тонкие срезы фиксированного и встроенного BAEC были визуализированы при увеличении в 35 000–40 000 раз с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ, рис. 3).При таком увеличении кавеолы ​​легко идентифицировать по их характерной морфологии (см. Вставку на рис. 3D). Показаны репрезентативные изображения ТЕМ контрольных (A), Chol (B), Ch: 7KC (C) и 7KC-обогащенных (D) клеток. Мы сшили отдельные изображения вместе, подсчитали количество кавеол на поверхности клетки и нормализовали количество на 1 мкм периметра клетки (рис. 3E). Как видно из количественной оценки, наблюдалась значительная вариация от клетки к клетке с повышенными концентрациями 7KC, увеличивающими эту жизнеспособность (распределение точек данных на фиг. 3E).Наблюдалась тенденция к более высокой плотности кавеол в клетках, обогащенных 7KC, но это не было статистически значимым. Таким образом, мы пришли к выводу, что обработка стеролом не влияла на количество кавеол на поверхности клетки, несмотря на увеличение Cav1 в плазматической мембране (рис. 1E) и модуляцию порядка мембраны стеринами (рис. 2).

Рис. 3. Количественное определение кавеол в контрольной и обогащенной стеролами BAEC.

BAEC были обогащены 40 мкМ Chol, 20 мкМ 7KC или смесью 20 мкМ Chol и 20 мкМ 7KC (Ch: 7KC).Клетки фиксировали и погружали в смолу Spur, обрабатывали для ПЭМ и отображали. Изображения были соединены с использованием плагина Mosaic J в изображении J. Репрезентативные изображения ТЕМ для (A) контрольных, (B) Chol, (C) Ch: 7KC и (D) 7KC-обогащенных клеток. В (D) изображения были объединены, и увеличенная область показана с кавеолами, видимыми в мембране. Изображения представляют> 20 ячеек на одно условие. Масштабная линейка = 0,5 мкм (A-C) и 1 мкм (D). (E) Кавеол количественно определяли вдоль плазматической мембраны, чтобы получить количество кавеол / мкм периметра клетки.Каждый символ представляет одну ячейку и несколько изображений. Данные взяты из 5 независимых экспериментов. Горизонтальные линии обозначают средства. Не наблюдалось существенной разницы между контрольными клетками и клетками, обогащенными стеролом (проверено с помощью однофакторного дисперсионного анализа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556.g003

Чтобы оценить распределение Cav1 в мембране на молекулярном уровне, мы использовали фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM) в сочетании с количественным кластерным анализом [ 56, 57].Клетки трансфицировали Cav1, меченным в фотопреобразованный белок mEOS2 (Cav1-mEOS2), который превращается из зеленого в красный при облучении УФ-лазером. Трансфицированные клетки обрабатывали стеролами, как описано выше, и преобразованную в красный цвет форму отображали при полном внутреннем отражении (TIRF), ограничивающем зону возбуждения ~ 150 нм за границей раздела стекло-клеточная мембрана. Одиночные молекулы были обнаружены путем подбора функции рассеяния точки (PSF) для каждого флуоресцентного события и вычисления центра каждого PSF.Это позволило осуществить прямую локализацию молекул Cav1 с точностью ~ 20 нм (рис. 4A) и количественную оценку кластеризации Cav1 с помощью анализа K-функции Рипли (рис. 4C и 4D). Пример изображения одной молекулы Cav1-mEOS2 показан на рис. 4A. K-функция Рипли, L (r) -r, измеряет молекулярное распределение относительно пространственно случайного распределения [58, 59]. Масштаб длины r, на котором пики L (r) -r указывает на доминирующий масштаб кластеризации Cav1, который был сходным для всех клеточных условий (рис. 4C).Чтобы количественно определить, изменило ли обогащение стеролом молекулярное распределение Cav1, мы извлекли максимальное значение L (r) -r для отдельных изображений. С помощью Cav1-mEOS2 мы обнаружили увеличение кластеризации Cav1 в обогащенных холестерином клетках, тенденция, которая снова была обращена обогащением 7KC (рис. 4D).

Рис. 4. Количественная оценка распределений Cav1 с помощью PALM и dSTORM.

BAEC были трансфицированы Cav1-mEOS2 для визуализации ЛАДОНА (A, C-D) или иммуноокрашены с помощью Cav1-Alexa Fluor 647 для визуализации dSTORM (B, E-F).BAEC не получали лечения (контроль) или обрабатывали стеринами, как указано, фиксировали и отображали с помощью PALM и dSTORM. (A-B) PALM (A) и dSTORM (B) TIRF-изображения Cav1 в мембране BAEC (масштабная полоса = 5 мкм) с белым квадратом, указывающим увеличенную область (масштабная полоса = 0,5 мкм). Каждая черная точка представляет одну обнаруженную молекулу Cav1. (C-F) Графики K-функции Рипли (C, E) и количественная оценка (D, F) распределения Cav1 изображений PALM (C-D) и dSTORM (E-F). L (r) -r сообщает о степени неслучайности точечных рисунков на радиальной шкале длины r относительно случайного распределения (обозначенного пунктирными линиями).На C и E показаны графики K-функции Рипли для контрольных (зеленый), холестерин- (красный), Chol: 7KC- (оранжевый) и 7KC-обработанных клеток (синий). В D и F максимальные значения L (r) -r отражают максимальную степень кластеризации. Каждый символ представляет собой одну область изображения; горизонтальные полосы отражают средства. Достоверность рассчитывалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа (в F не было обнаружено значимых различий).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556.g004

Чтобы проверить, могла ли сверхэкспрессия Cav1 в сочетании с повышением холестерина вызывать повышенную кластеризацию Cav1, мы также использовали микроскопию прямой стохастической оптической реконструкции (dSTORM). где эндогенный Cav1 исследуется с помощью иммуноокрашивания (рис. 4B).Мы достигли такой же точности локализации, как и с PALM. Кривые K-функции Рипли имеют пик в масштабе длины для эндогенного Cav1, что и для Cav1-mEOS2 (рис. 4E). Однако было заметно, что максимальная степень кластеризации (значения max L (r) -r) была ниже с dSTORM по сравнению с PALM (рис. 4F). Действительно, мы не обнаружили различий в максимальных значениях L (r) -r в клетках, обработанных стеролом. Это интересное наблюдение, возможно, указывающее на дифференциальное влияние обогащения холестерина на распределение эндогенного Cav1 и эктопически экспрессируемого Cav1, слитого с mEOS2.Действительно, недавние исследования показали, что сверхэкспрессированные слитые белки Cav1 усиливают агрегацию и деградацию Cav1 дикого типа [60], указывая тем самым, что сверхэкспрессированные слитые белки Cav1 и эндогенный Cav1 могут локализоваться и вести себя по-разному. Хотя это выходит за рамки данного исследования, будущие исследования могут выявить влияние белковых меток и сверхэкспрессию Cav1 на клеточное распределение эндогенного Cav1. Взятые вместе, данные подтверждают, что избыточная экспрессия Cav1 усиливает кластеризацию Cav1 за счет холестерина.Подобно интенсивности флуоресценции Cav1 в плазматической мембране (Рис. 1F) и плотности кавеол (Рис. 3F), похоже, что обогащение стеролом не приводило к перераспределению Cav1 на поверхности клетки.

Дифференциальный эффект обогащения стеролом на мембранные домены в эндотелиальных клетках дал нам возможность исследовать чувствительность активации eNOS при стимуляции VEGF, HDL и напряжением сдвига. Поскольку нас интересовали ранние пути передачи сигнала, которые, возможно, опосредуются отдельными мембранными доменами, мы инкубировали BAEC с 25 мкг / мл VEGF в течение 5 минут или 50 мкг / мл HDL в течение 20 минут или подвергали BAEC воздействию 10 дин / см 2 напряжения сдвига в течение 5 мин и сравнил активность eNOS со стимулированными контрольными клетками (фиг. 5).Экспрессия VEGFR2, SR-B1, а также киназы Src и фосфорилирование киназы 1/2, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK1 / 2), не подвергались воздействию стеринов, как определено с помощью вестерн-блоттинга (данные не показаны). Активность eNOS определяли количественно путем измерения превращения [ 3 H] -L-аргинина в [ 3 H] -L-цитруллин в присутствии или в отсутствие специфического ингибитора eNOS, L-NAME. Все три стимула — VEGF, HDL и воздействие напряжения сдвига — индуцировали активность eNOS в эндотелиальных клетках в 5-10 раз по сравнению с нестимулированными клетками, тогда как модификации стеролов без дополнительных стимулов не изменяли базальную активность eNOS (данные не показаны).

Рис. 5. Активность eNOS стеринового BAEC в ответ на различные стимулы.

BAEC были обогащены 40 мкМ Chol, 20 мкМ 7KC или их смесью (20 мкМ Chol: 20 мкМ 7KC). Клетки не обрабатывали (контроль, A) или стимулировали 25 нг / мл VEGF в течение 5 минут (B), 50 мкг / мл HDL в течение 20 минут (C) или 10 дин / см 2 напряжения сдвига в течение 5 минут ( D). Данные представлены как степень превращения [ 3 H] -L-аргинина в [ 3 H] -L-цитруллин, который чувствителен к предварительной обработке эндотелиальных клеток в течение 30 минут 1 мМ L-NAME и выражается в dpm / 10 6 клеток.Данные были нормализованы к контролю и выражены как средние значения ± стандартная ошибка среднего из по меньшей мере семи независимых экспериментов, выполненных в трех повторностях. Достоверность по сравнению с контролем была рассчитана с помощью однофакторного дисперсионного анализа, и одна звездочка указывает на P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556.g005

Активность

eNOS была аналогичной в контрольной и управляемой стеролом BAEC с активацией VEGF и без нее (рис. 5A и 5B). Наблюдалась тенденция к увеличению активности eNOS при обогащении 7KC в контрольных и инкубированных с VEGF клетках, что, возможно, указывает на большее количество eNOS на плазматической мембране (рис. 1D) и потерю ингибирующего взаимодействия eNOS-Cav1 (рис. 1B).Однако эти результаты не были статистически значимыми и отражались, когда клеточные лизаты VEGF-стимулированных и нестимулированных клеток зондировали на фосфорилирование eNOS по серину 1179 (рис. 6A и 6B), показывая, что обогащение стеролов не оказывало большого влияния на базальный и VEGF- индуцированная активность eNOS и фосфорилирование. Напротив, когда BAEC стимулировали HDL (фиг. 5C), активность eNOS значительно усиливалась в клетках, обогащенных холестерином, в то время как повышение уровней 7KC снижало активность eNOS, повышенную холестерином.Эти результаты могут указывать на то, что обогащение холестерина, но не 7KC, улучшает связывание HDL с SR-BI, обеспечивая более быстрый и эффективный поток холестерина, который считается важным для активации eNOS. Это изменение активности eNOS было связано с 1,5-кратным увеличением фосфорилирования eNOS в клетках, обогащенных холестерином (рис. 6C). Интересно, что повышенное фосфорилирование eNOS также наблюдалось при увеличении уровней 7KC (рис. 6C). Сходство между наборами данных, полученными для порядка мембран (рис. 2) и активности eNOS, индуцированной ЛПВП (рис. 5C), предполагает, что потенциальные чтобы повлиять на активность eNOS.В условиях напряжения сдвига активность eNOS была значительно повышена в клетках, обогащенных Chol: 7KC и 7KC (рис. 5D). Напротив, фосфорилирование eNOS (фиг. 6D) снова явно отличалось от паттерна активности eNOS (фиг. 5D), достигая пика в обогащенных холестерином клетках и снижаясь при добавлении 7KC. Взятые вместе, мы обнаружили, что два стимулирующих состояния eNOS, HDL и напряжение сдвига, очень чувствительны к холестерину или обогащению 7KC, что приводит к паттернам фосфорилирования eNOS на Ser1179, которые не отражают активность eNOS.

Рис. 6. Фосфорилирование с помощью eNOS стеринов BAEC в ответ на различные стимулы.

Обогащенные

BAEC обрабатывали, как указано выше, а затем либо не стимулировали (A), либо стимулировали VEGF (25 нг / мл) в течение 5 минут (B), 50 мкг / мл HDL в течение 20 минут (C) или стимулировали 10 дин. / см 2 напряжение сдвига в течение 5 мин (D). Клетки лизировали и равные количества белка анализировали иммуноблоттингом с антителами против фосфо-eNOS Ser1179 и общего eNOS. Фосфорилирование измеряли с помощью денситометрии фосфорилированного белка, деленного на общий белок и нормализованного к контрольным условиям.Данные представляют собой средние значения ± SEM из шести независимых экспериментов. Достоверность по сравнению с контролем была рассчитана с помощью однофакторного дисперсионного анализа и обозначена одной звездочкой, показывающей P <0,05, или двумя звездочками, показывающими P <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151556.g006

Заключение

Мы продемонстрировали, что в эндотелиальных клетках экзогенно добавленный холестерин и 7KC по-разному влияют на субклеточное распределение Cav1 и eNOS, а также на порядок мембран, но не на общее количество кавеол на поверхности клетки.Эти изменения связаны с дифференциальным ответом на фосфорилирование и активность eNOS, вызванные VEGF-, HDL- или сдвигающим стрессом, что подтверждает модель, согласно которой в зависимости от стимулов различные микродомены на плазматической мембране способствуют регулированию активации eNOS.

Хотя 7KC, но не обогащение холестерина, увеличивает локализацию eNOS на плазматической мембране и снижает совместную локализацию Cav1-eNOS, это, по-видимому, не способствует значительным изменениям в фосфорилировании и активности eNOS в базальных и VEGF-стимулированных условиях.Следовательно, мы предполагаем, что высвобождение eNOS из Cav1 не активирует автоматически eNOS, хотя связывание eNOS-Cav1 ингибирует ферментативную активность eNOS. Учитывая большие количества VEGFR2 в кавеолах, возникает соблазн предположить, что активация eNOS, индуцированная VEGF, связана с количеством кавеол, а не с повышенным образованием высокоупорядоченных доменов.

Однако дифференциальный ответ, наблюдаемый для активности и фосфорилирования eNOS, вызванных HDL и стрессом сдвига, подразумевает, что изменения порядка мембран могут иметь существенные последствия в зависимости от анализируемых стимулов.Здесь особенно поразительным является опосредованный холестерином эффект на организацию мембраны, коррелирующий с повышенной активностью eNOS и фосфорилированием в эндотелиальных клетках, инкубированных с ЛПВП. Это предполагает, что порядок мембран в целом или домены с усилением холестерина в плазматической мембране, а не взаимодействие eNOS-Cav1 или кавеолы ​​ per se , влияют на индуцированную HDL активацию eNOS. Мы предполагаем, что улучшенная способность SR-BI связывать холестерин, возможно, обеспечивая более направленный поток холестерина между HDL и обогащенными холестерином доменами плазматической мембраны, может способствовать передаче сигнала для более эффективной активации eNOS.В поддержку этой модели, обогащение 7KC будет мешать предполагаемой холестерин-чувствительной роли SR-BI в этом контексте, полностью отменяя активность eNOS, но все же позволяя фосфорилирование eNOS.

Полученные выше данные показали, что некоторые сигнальные каскады, запускающие активацию eNOS, могут происходить независимо от микродоменов, богатых холестерином. Интересно, что индуцированное напряжением сдвига фосфорилирование eNOS усиливалось в клетках, обогащенных холестерином, но это не коррелировало с повышенной активностью eNOS.Следовательно, мы предполагаем, что высокоупорядоченные и / или увеличенные холестерином домены могут способствовать фосфорилированию eNOS, индуцированному сдвиговым напряжением, но этого может быть недостаточно для управления активностью eNOS в этих условиях. Мы предполагаем, что домены с повышенным уровнем холестерина оказывают сильное влияние на индуцированную HDL активность eNOS, фосфорилирование eNOS, вызванное стрессом сдвига, но вносят меньший вклад в индуцируемую VEGF активность eNOS. Молекулярная идентификация этих доменов все еще неясна, но, основываясь на экспериментах, представленных здесь, эти домены вряд ли будут кавеоальными и могут быть Cav1-независимыми доменами липидных рафтов [61].Холестерин также играет роль в кластеризации сверхэкспрессированных Cav1, и здесь обогащение холестерина и избыточная экспрессия Cav1 могут приводить к образованию новых кавеол. Тот факт, что напряжение сдвига может вызывать разборку кавеол, чего не происходит с VEGF или HDL, дополнительно указывает на потребность в различных доменах для обеспечения активации eNOS в ответ на различные физиологические стимулы.

Таким образом, это исследование, впервые использующее обогащение холестерина или 7KC вместо истощения холестерина, поддерживает модель для эндотелиальных клеток, в которой сигнальные каскады, индуцированные VEGF, HDL и сдвигающим напряжением, запускают активацию eNOS и фосфорилирование, демонстрируют дифференциальную чувствительность к холестерину, возможно, из-за их расположения в разных мембранных доменах.

Материалы и методы

Клеточные культуры и стерины

Эндотелиальные клетки аорты крупного рогатого скота (BAEC; пассажи 3–9, Cell Systems) культивировали в EBM (эндотелиальная базальная среда) с добавлением EGM SingleQuot (Lonza) или в DMEM с добавлением 10% FBS, 50 ед. Пенициллина, 50 мкг / мл. стрептомицин и 2 мМ L-глутамин при 37 ° C с 5% CO 2 до 70–80% конфлюэнтности. Перед экспериментами BAEC инкубировали в среде DMEM с пониженным содержанием сыворотки, содержащей 0,5–1,0% FBS, 5 Ед пенициллина, 5 мкг / мл стрептомицина и 0.2 мМ L-глутамин (DMEM с пониженным содержанием сыворотки) в течение минимум 2 ч и максимум 16 ч при 37 ° C с 5% CO 2 и 95% воздуха.

BAEC были обогащены 40 мкМ холестерина, или 20 мкМ 7-кетохолестерина, или смесью 20 мкМ холестерина: 20 мкМ 7-кетохолестерина (1: 1) в течение 30 минут при 37 ° C с 5% CO 2 . Каждый стерол был образован комплексом с 38 мкМ метил-ß-циклодекстрином (mßCD) путем добавления 4 x 10 мкл 15 мг / мл холестерина или 7-кетохолестерина (в воде) к 400 мкл 5% mß-ЦД (в воде) при 80 ° C. в течение 1 ч.Для определения стеринового обогащения ВАЕС клетки лизировали в 1 мл 0,2 М NaOH. Образцы были подготовлены для количественного анализа ВЭЖХ, как описано ранее [62].

Стимуляция VEGF, HDL и напряжения сдвига

После обогащения стеролом клетки стимулировали путем инкубации с 25 нг / мл VEGF 165 (VEGF; R&D Systems) в течение 5 минут в среде без сыворотки для большинства экспериментов или в буфере Hepes / Krebs для измерения активности eNOS. Клетки инкубировали в присутствии VEGF в течение 5 мин при 37 ° C, 5% CO 2 .

HDL выделяли из плазмы человека центрифугированием в градиенте плотности. Клетки стимулировали 50 мкг / мл HDL в течение 20 мин перед использованием для дальнейших экспериментов.

Для экспериментов по напряжению сдвига стерильные предметные стекла для микроскопии покрывали тонким слоем 1% BD Matrigel в PBS и оставляли сушиться на воздухе в течение 2 часов. Перед использованием предметные стекла промывали один раз PBS. BAEC культивировали на предметных стеклах в полной среде до примерно 80–90% конфлюэнтности с последующей депривацией сыворотки в течение минимум 2 ч в среде DMEM с пониженным содержанием сыворотки.Напряжение сдвига измеряли в камере с параллельным потоком модели Streamer (Flexcell Inc.) при 10 дин / см 2 в течение 5 минут с использованием DMEM с пониженным содержанием сыворотки в качестве проточной среды.

Активность eNOS

BAEC выращивали до конфлюэнтности и инкубировали с или без 1 мМ ингибитора eNOS L-NAME (метиловый эфир L-нитро-аргинина) в течение 30 минут в присутствии или в отсутствие стерола. Все реагенты разводили в буфере Hepes / Krebs (состав в ммоль / л: NaCl 99,01, KCl 4,69, CaCl 2 1.87, MgSO 4 1,20, K 2 HPO 4 1,03, NaHCO 3 25,0, Na-HEPES 20,0 и глюкоза 11,1; pH 7,4). Для измерения активности стимулированной eNOS клетки стимулировали, как описано выше. После стимуляции или сразу после инкубации L-NAME (базальная активность) клеток активность eNOS оценивали путем количественной оценки превращения [ 3 H] -L-аргинина в [ 3 H] -L-цитруллин с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Данные представлены как степень превращения [ 3 H] -L-аргинина в [ 3 H] -L-цитруллин, который чувствителен к предварительной обработке эндотелиальных клеток в течение 30 минут L-NAME (1 мМ) и выражается в dpm на 10 6 эндотелиальных клеток.

Иммуноблоттинг

Первичные антитела представляли собой мышиный анти-кавеолин-1 (№ 610406), кроличий анти-кавеолин-1 (№ 610060) и мышиный анти-NOSIII (№ 610296), все от BD Transduction Laboratories. Кроличий антифосфо-eNOS Ser1179 (№ 07–428) был из северной части штата. Вторичные антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой антимышиную пероксидазу хрена (анти-ms-HRP) и анти-кроличью пероксидазу хрена (анти-rb-HRP) (все от Jackson ImmunoResearch). Равные количества белка (3-5 мкг) на образец загружали и разделяли с использованием систем NuPAGE (Invitrogen).Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Amersham) с использованием системы переноса NuPAGE или системы переноса геля iBlot (Invitrogen). Белки выявляли с помощью вторичных антител против ms-HRP или против rb-HRP. Иммуноблотированные белки были разработаны с помощью хемилюминесцентной системы вестерн-блоттинга ECL (Amersham) и отображены на мини-системе LAS-4000 (Fujifilm). Хемилюминесцентные сигналы белков определяли количественно с использованием программного обеспечения NIH image (ImageJ) и выражали в произвольных единицах (AU).

Конфокальная визуализация и визуализация Лаурдана

Клетки высевали на покрытые желатином покровные стекла, обогащали стеринами, как описано выше, и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) при комнатной температуре. Избыток PFA гасили 50 мМ NH 4 Cl. Клетки были проницаемы и заблокированы в блокирующем буфере (0,1% сапонина, 0,5% BSA) в течение 1 часа. Для определения субклеточного распределения Cav1 клетки eNOS иммуноокрашивали с помощью Cav1-Alexa fluor 647 и eNOS-Alexa fluor 488.

Для количественной оценки порядка мембран клетки окрашивали 5 мкМ лаурданом в течение 20–30 мин перед фиксацией.После фиксации и блокировки клетки иммуноокрашивали Cav1-Cy3 и устанавливали, используя смесь Mowiol 4–88 и глицерина с 5% DABCO. Получение изображений осуществляли на микроскопе Leica Microsystems TCS SP5 с масляным объективом 1,4 NA 100x. Cav1-Alexa fluor 647 возбуждали DPSS-лазером на He / Ne-лазере на длине волны 633 нм, а eNOS-Alexa fluor 488 возбуждали аргоновым лазером. Лаурдана возбуждали на длине волны 800 нм с помощью лазера MaiTai HP, Spectra-Physics (Leica Microsystems SP). Интенсивности регистрировались с помощью внутренних фотонных умножителей.Значения GP были определены количественно, как описано Owen et al. [53]. Для количественной оценки Cav1-положительных участков мембраны изображения интенсивности Cav1-Cy3 использовались для маскировки изображений GP. Весь периметр клеток очерчивали путем выбора 5 пикселей (равных 1,2 мкм) от периферии клетки и количественно оценивали GP для определения общего порядка мембран.

Для сравнения интенсивности плазматической мембраны с интенсивностью цитоплазмы при различных обработках стеролов использовали изображения интенсивности Cav1-Alexa fluor 647 и eNOS-Alexa fluor 488 для расчета совместной локализации на основе корреляции Пирсона.Средняя интенсивность плазматической мембраны и цитоплазмы измерялась с помощью Fiji ImageJ. Плазматическая мембрана представляла собой полосу размером 1–1,2 мкм, прослеживаемую по периметру клетки, а область, прилегающая к полосе, представляла внутриклеточные области. Измеряли и сравнивали среднее значение плазматической мембраны и цитоплазмы.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

BAEC обрабатывали, как указано выше, промывали, фиксировали 2% глутаральдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (PB) при 4 ° C в течение минимум 2 часов и обрабатывали для получения изображений ПЭМ.Образцы окрашивали 1% OsO 4 и обезвоживали ацетоном / PB с последующим погружением в смолу Spurr (Sigma). Образцы разрезали на тонкие срезы с помощью ультрамикротома (Leica) и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца перед помещением на медные сетки. Клетки визуализировали на просвечивающем электронном микроскопе Jeol JEM 1010, оснащенном цифровой камерой Gatan Bioscan для записи изображений, или на Jeol JEM 1400, оснащенном цифровой камерой Gatan Bioscan. Изображения были сделаны с увеличением 25 000X или 40 000X.При таком увеличении кавеолы ​​были четко видны на плазматической мембране, однако было невозможно отобразить целые клетки, и поэтому необходимо было визуализировать области вдоль плазматической мембраны. Отдельные изображения областей клетки были связаны с помощью плагина Image J под названием MosaicJ (NIH), чтобы сформировать полную ячейку. Для количественного определения кавеол / мкм периметра клетки весь периметр клетки в мкм был нанесен на карту с помощью ImageJ, и кавеолы ​​подсчитаны вручную по периметру клетки.

Фотоактивированная локализационная микроскопия и анализ

BAEC были временно трансфицированы Cav1-mEOS2 с использованием липофектамина LTX и зафиксированы 4% PFA при 37 ° C.Изображения PALM получали на микроскопе полного внутреннего отражения (ELYRA PS-1, Carl Zeiss MicroImaging) с масляно-иммерсионным объективом 100x NA 1,46. Для mEos2 фотопреобразование из зеленого в красное было достигнуто с помощью 8 мкВт лазерного излучения с длиной волны 405 нм, а преобразованное в красный цвет mEos2 было отображено с помощью 12 мВт света с длиной волны 561 нм. 15000 изображений (время экспозиции 30 мс) было получено на образец с помощью охлаждаемой камеры электронного умножителя с зарядовой связью (iXon DU-897D; Andor).

Необработанные изображения интенсивности флуоресценции были проанализированы с помощью программного обеспечения Zen 2010D (Carl Zeiss Microscopy).Для каждого образца дрейф во время сбора был скорректирован относительно положения 100-нанометровых шариков коллоидного золота с иммобилизованной поверхностью (BBInternational).

После фильтрации по Гауссу и Лапласу события считались происходящими от одиночных молекул, когда I M > 6 S , где I — интенсивность события, M — средняя интенсивность изображения и S — интенсивность события. стандартное отклонение интенсивности изображения. Затем вычисляли центр каждой функции рассеяния точки путем подгонки профилей интенсивности к двумерному распределению Гаусса.После коррекции дрейфа координаты частиц x y каждой молекулы были сохранены в таблице. Двумерные молекулярные координаты были обрезаны до неперекрывающихся областей размером 3 мкм × 3 мкм, а события с точностью локализации хуже 30 нм отбрасывались. Отдельные флуорофоры могут пройти несколько «циклов мигания», поэтому множественные мигания были учтены путем выбора соответствующего выключенного промежутка, как опубликовано ранее [63, 64].

Микроскопия прямой стохастической оптической реконструкции (dSTORM) и анализ

Иммуноокрашивание для визуализации STORM выполняли, как описано выше для конфокальной визуализации.Кроме того, параформальдегид гасили 50 мМ NH 4 Cl в течение 10 минут сразу после фиксации. Клетки окрашивали вторичными антителами Cav1 и Alexa Fluor 647 и промывали PBS пять раз по 15 минут на каждую промывку на качалке.

изображений dSTORM были получены с помощью того же прибора, что и для PALM. Чтобы возбудить и выключить флуоресцентный краситель, муку Cav1-Alexa 647 возбуждали и выключали лазером возбуждения с длиной волны 642 нм при максимальной мощности (150 мВт).После выключения возбужденных молекул мощность лазера возбуждения была уменьшена до 45 мВт, и было получено 20000 кадров (время экспозиции 30 мс и усиление 50 В), чтобы получить изображения сверхвысокого разрешения. Во время регистрации использовался лазер с длиной волны 405 нм (от 0,05 до 2,5 мВт) для дальнейшей активации большего количества молекул при низкой частоте мигания.

В состав буфера STORM, используемого для Alexa Fluor 647, входят: 25 мМ HEPES, 25 мМ глюкоза, 5% глицерин, pH 8,0, 10 мМ 2-меркаптоэтиламин (SIGMA # 30070), 50 мкг / мл глюкозооксидазы (SIGMA # G2133). ) и 25 мкг / мл пероксидазы хрена (SIGMA # P8375).Как и в случае с PALM, коррекция дрейфа проводилась с использованием реперных точек и программного обеспечения Zeiss Zen 2010D. Анализ данных dSTORM выполнялся, как описано для анализа данных PALM.

Статистика

Статистическая значимость множественных сравнений была проведена с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и теста множественных сравнений Тьюки (Prism, Graphpad). Корреляция Пирсона была рассчитана с помощью плагина JACoP в ImageJ (NIH).

Благодарности

Мы благодарим Австралийский исследовательский совет (ARC) и Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (грант программы 1037320).T.G благодарит за поддержку Сиднейский университет, Австралия (U1758, U7007). C.E благодарит за поддержку Министерство экономики и конкуренции (MINECO; BFU2012-36272, CSD2009-00016) и Fundació Marató TV3 (PI042182) (Испания). C.R. благодарит исследовательскую программу CONSOLIDER-INGENIO (MINECO) за постдокторскую стипендию (CSD2009-00016) и Fundació Marató TV3.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AM MR CR CE ST TG KG. Проведены эксперименты: JT AM MR CR TR.Проанализированы данные: JT AM MR CR. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: CR TR CE ST TG. Написал статью: AM MR CR CE TG KG.

Ссылки

  1. 1. Саймонс К., Иконен Э. Функциональные рафты в клеточных мембранах. Природа. 1997. 387 (6633): 569–72. pmid: 9177342.
  2. 2. Саймонс К., Тоомре Д. Липидные рафты и передача сигналов. Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2000; 1 (1): 31–9. pmid: 11413487.
  3. 3. Браун Д.А., Роуз Дж.К. Сортировка GPI-заякоренных белков на обогащенные гликолипидом мембранные субдомены во время транспорта к апикальной поверхности клетки.Клетка. 1992; 68: 533–44. pmid: 1531449
  4. 4. Xu X, London E. Влияние структуры стерола на липидные домены мембран показывает, как холестерин может индуцировать образование липидных доменов. Биохимия. 2000. 39 (5): 843–9. Epub 2000/02/02. bi992543v [pii]. pmid: 10653627.
  5. 5. Ахмед С.Н., Браун Д.А., Лондон Э. О происхождении нерастворимых в детергентах клеточных мембран с высоким содержанием сфинголипидов / холестерина: физиологические концентрации холестерина и сфинголипида индуцируют образование нерастворимой в детергенте упорядоченной жидкой липидной фазы в модельных мембранах.Биохимия. 1997. 36 (36): 10944–53. pmid: 9283086.
  6. 6. Лондон Э. Понимание структуры и образования липидного рафта из экспериментов на модельных мембранах. Текущее мнение в структурной биологии. 2002. 12 (4): 480–6. pmid: 12163071.
  7. 7. Xu X, Bittman R, Duportail G, Heissler D, Vilcheze C, London E. Влияние структуры природных стеринов и сфинголипидов на формирование упорядоченных сфинголипид / стероловых доменов (рафтов). Сравнение холестерина с растительными, грибковыми и связанными с болезнями стеролами и сравнение сфингомиелина, цереброзидов и церамидов.J Biol Chem. 2001. 276 (36): 33540–6. Epub 2001/07/04. [pii]. pmid: 11432870.
  8. 8. Шредер Р.Дж., Ахмед С.Н., Чжу Й., Лондон Э., Браун Д.А. Холестерин и сфинголипид увеличивают нерастворимость Triton X-100 гликозилфосфатидилинозитол-заякоренных белков, способствуя образованию нерастворимых в детергенте упорядоченных мембранных доменов. Журнал биологической химии. 1998. 273 (2): 1150–7. pmid: 9422781.
  9. 9. Kenworthy AK, Edidin M. Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK, исследованных с разрешением & lt; 100 A с использованием визуализации переноса энергии резонанса флуоресценции.Журнал клеточной биологии. 1998. 142 (1): 69–84. pmid: 9660864.
  10. 10. Мелконян К.А., Остермайер А.Г., Чен Дж.З., Рот М.Г., Браун Д.А. Роль липидных модификаций в нацеливании белков на устойчивые к детергентам мембранные рафты. Многие белки рафта ацилированы, а немногие пренилированы. Журнал биологической химии. 1999. 274 (6): 3910–7. pmid: 9920947.
  11. 11. Браун Д.А. Структура и функция мембранных рафтов, богатых сфинголипидами и холестерином. Журнал биологической химии.2000. 275 (23): 17221–4. pmid: 10770957
  12. 12. Gaus K, Zech T, Harder T. Визуализация мембранных микродоменов с помощью 2-фотонной микроскопии Лаурдана (обзор). Молекулярная мембранная биология. 2006. 23 (1): 41–8. pmid: 16611579
  13. 13. Гаус К. Визуализация липидной структуры и рафтовых доменов в живых клетках с помощью двухфотонной микроскопии. Труды Национальной академии наук. 2003. 100 (26): 15554–9.
  14. 14. Rothberg KG, Heuser JE, Donzell WC, Ying YS, Glenney JR, Anderson RG.Кавеолин, белковый компонент мембранных оболочек кавеол. Клетка. 1992. 68 (4): 673–82. Epub 1992/02/21. 0092-8674 (92) -Z [pii]. pmid: 1739974.
  15. 15. Ямада Э. Тонкая структура эпителия желчного пузыря мыши. J Biophys Biochem Cytol. 1955; 1 (5): 445–58. Epub 1955/09/25. pmid: 13263332.
  16. 16. Lisanti MP, Scherer PE, Vidugiriene J, Tang Z, Hermanowski-Vosatka A, Tu YH, et al. Характеристика богатых кавеолином мембранных доменов, выделенных из богатого эндотелием источника: последствия для болезней человека.J Cell Biol. 1994. 126 (1): 111–26. Epub 1994/07/01. pmid: 7517942.
  17. 17. Минео С., Шауль П.В. Стимуляция эндотелиальной синтазы оксида азота ЛПВП: новый механизм действия ЛПВП. Trends Cardiovasc Med. 2003. 13 (6): 226–31. pmid: 12922018.
  18. 18. Сесса WC, Хеккер М., Митчелл Дж. А., Вэйн-младший. Метаболизм L-аргинина и его значение для биосинтеза фактора релаксации эндотелия: L-глутамин подавляет выработку L-аргинина культивируемыми эндотелиальными клетками.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1990; 87 (21): 8607–11. Epub 1990/11/01. pmid: 1978327; PubMed Central PMCID: PMC55006.
  19. 19. Hecker M, Mulsch A, Bassenge E, Forstermann U, Busse R. Субклеточная локализация и характеристика синтазы оксида азота в эндотелиальных клетках: физиологические последствия. Biochem J. 1994; 299 (Pt 1): 247–52. pmid: 7513152.
  20. 20. Робинсон LJ, Мишель Т. Мутагенез сайтов пальмитоилирования в эндотелиальной синтазе оксида азота идентифицирует новый мотив для двойного ацилирования и субклеточного нацеливания.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1995; 92 (25): 11776–80. pmid: 8524847.
  21. 21. Сесса В.С., Гарсия-Кардена Дж., Лю Дж., Кех А., Поллок Дж. С., Брэдли Дж. И др. Ассоциация Гольджи эндотелиальной синтазы оксида азота необходима для эффективного синтеза оксида азота. J Biol Chem. 1995. 270 (30): 17641–4. Epub 1995/07/28. pmid: 7543089.
  22. 22. Фултон Д., Бэббит Р., Зёлльнер С., Фонтана Дж., Асеведо Л., МакКейб Т. Дж. И др. Нацеливание эндотелиальной синтазы оксида азота на цитоплазматическую поверхность комплекса Гольджи или плазматическую мембрану регулирует Akt-, а не кальций-зависимые механизмы высвобождения оксида азота.J Biol Chem. 2004. 279 (29): 30349–57. Epub 2004/05/12. [pii]. pmid: 15136572.
  23. 23. Шауль П.В., Смарт Э.Дж., Робинсон Л.Дж., Герман З., Юханна И.С., Ин Йи и др. Ацилирование нацелено на эмдотелиальную синтазу оксида азота в кавеолах плазмалеммы. J Biol Chem. 1996. 271 (11): 6518–22. pmid: 8626455.
  24. 24. Гарсия-Кардена Дж., Фан Р, Стерн Д. Ф., Лю Дж., Сесса WC. Эндотелиальная синтаза оксида азота регулируется фосфорилированием тирозина и взаимодействует с кавеолином-1. J Biol Chem.1996. 271 (44): 27237–40. pmid: 8910295.
  25. 25. Ферон О, Мишель Дж. Б., Саза К., Мишель Т. Динамическая регуляция эндотелиальной синтазы оксида азота: дополнительные роли двойного ацилирования и взаимодействий кавеолина. Биохимия. 1998. 37 (1): 193–200. pmid: 9425039.
  26. 26. Sowa G, Pypaert M, Sessa WC. Различие между сигнальными механизмами в липидных рафтах и ​​кавеолах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2001; 98 (24): 14072–7. pmid: 11707586.
  27. 27. Ju H, Zou R, Venema VJ, Venema RC.Прямое взаимодействие эндотелиальной синтазы оксида азота и кавеолина-1 подавляет активность синтазы. J Biol Chem. 1997. 272 ​​(30): 18522–5. Epub 1997/07/25. pmid: 9228013.
  28. 28. Бернатчес П.Н., Бауэр П.М., Ю. Дж., Прендергаст Дж. С., Хе П., Сесса В. Анализ молекулярного контроля эндотелиальной NO-синтазы с помощью кавеолина-1 с использованием проницаемых для клеток пептидов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102 (3): 761–6. Epub 2005/01/08. 0407224102 [pii] pmid: 15637154; PubMed Central PMCID: PMC545535.
  29. 29.Коллинз Б.М., Дэвис М.Дж., Хэнкок Дж.Ф., Партон Р.Г. Структурная переоценка модели передачи сигналов кавеолина: регулируют ли кавеолы ​​передачу сигналов через взаимодействия кавеолин-белок? Клетка развития. 2012; 23 (1): 11–20. pmid: 22814599
  30. 30. Бауэр П.М., Ю. Дж., Чен И., Хики Р., Бернатчез П. Н., Лофт-Уилсон Р. и др. Эндотелиально-специфическая экспрессия кавеолина-1 ухудшает проницаемость микрососудов и ангиогенез. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102 (1): 204–9. Epub 2004/12/24.0406092102 [pii] pmid: 15615855; PubMed Central PMCID: PMC544041.
  31. 31. Wunderlich C, Schober K, Lange SA, Drab M, Braun-Dullaeus RC, Kasper M, et al. Нарушение кавеолина-1 приводит к усилению нитрозативного стресса и тяжелой систолической и диастолической сердечной недостаточности. Biochem Biophys Res Commun. 2006. 340 (2): 702–8. pmid: 16380094.
  32. 32. Labrecque L, Royal I, Surprenant DS, Patterson C, Gingras D, Beliveau R. Регулирование активности рецептора-2 фактора роста эндотелия сосудов с помощью кавеолина-1 и холестерина плазматической мембраны.Mol Biol Cell. 2003. 14 (1): 334–47. Epub 2003/01/17. pmid: 12529448; PubMed Central PMCID: PMC140249.
  33. 33. Фэн Й., Венема В.Дж., Венема Р.К., Цай Н., Бехзадян М.А., Колдуэлл РБ. Увеличение проницаемости, вызванное VEGF, опосредуется кавеолами. Инвестируйте Ophthalmol Vis Sci. 1999. 40 (1): 157–67. Epub 1999/01/15. pmid: 9888439.
  34. 34. Gaus K, Le Lay S, Balasubramanian N, Schwartz MA. Интегрин-опосредованная адгезия регулирует порядок мембран. J Cell Biol. 2006. 174 (5): 725–34. Epub 2006/09/01.jcb.200603034 [pii] pmid: 16943184; PubMed Central PMCID: PMC2064315.
  35. 35. Soldi R, Mitola S, Strasly M, Defilippi P, Tarone G, Bussolino F. Роль интегрина αvβ3 в активации рецептора-2 фактора роста эндотелия сосудов. Эмбо Дж. 1999; 18 (4): 882–92. pmid: 10022831
  36. 36. Le Boeuf F, Houle F, Huot J. Регулирование опосредованного рецептором 2 фактора роста сосудистого эндотелия фосфорилирования киназы фокальной адгезии с помощью белков теплового шока 90 и активности киназы Src.Журнал биологической химии. 2004. 279 (37): 39175–85. pmid: 15247219.
  37. 37. Филдинг ЧП, Филдинг С.Дж. Кавеолы ​​плазматической мембраны опосредуют отток холестерина, свободного от клеток. Биохимия. 1995. 34 (44): 14288–92. Epub 1995/11/07. pmid: 7578031.
  38. 38. Саддар С., Минео С., Шауль П.В. Передача сигналов высокоаффинным рецептором скавенджера HDL рецептора типа I. Артериосклероз, тромбоз и биология сосудов. 2010. 30 (2): 144–50. Epub 2010/01/22. 30.02.144 [pii] pmid: 20089950.
  39. 39. Пэн Ю., Акментин В., Коннелли М.А., Лунд-Кац С., Филлипс М.С., Уильямс Д.Л. Рецептор скавенджера BI (SR-BI), сгруппированный на продолжениях микроворсинок, предполагает, что этот домен плазматической мембраны является промежуточной станцией для переноса холестерина между клетками и липопротеинами высокой плотности. Mol Biol Cell. 2004. 15 (1): 384–96. Epub 2003/10/07. [pii]. pmid: 14528013; PubMed Central PMCID: PMC307555.
  40. 40. Ассанасен С., Минео С., Ситхарам Д., Юханна И.С., Марсель Ю.Л., Коннелли М.А. и др.Связывание холестерина, отток и PDZ-взаимодействующий домен рецептора-скавенджера-BI опосредуют инициируемую HDL передачу сигналов. J Clin Invest. 2005. 115 (4): 969–77. pmid: 15841181.
  41. 41. Mulay V, Wood P, Rentero C, Enrich C, Grewal T. Пути передачи сигнала предоставляют возможности для увеличения HDL и апоАИ-зависимого обратного транспорта холестерина. Современная фармацевтическая биотехнология. 2012. 13 (2): 352–64. pmid: 21470119.
  42. 42. Риццо В., Мортон С., ДеПаола Н., Шнитцер Дж. Э., Дэвис П. Ф.Рекрутирование эндотелиальных кавеол в пути механотрансдукции путем кондиционирования потока in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003. 285 (4): h2720–9. pmid: 12816751.
  43. 43. Риццо В., Макинтош Д.П., О П, Шнитцер Дж. Э. Поток in situ активирует эндотелиальную синтазу оксида азота в просветных кавеолах эндотелия с быстрой диссоциацией кавеолина и ассоциацией кальмодулина. J Biol Chem. 1998. 273 (52): 34724–9. pmid: 9856995.
  44. 44. Ю. Дж., Бергая С., Мурата Т., Альп И. Ф., Бауэр М. П., Лин М. И. и др.Прямые доказательства роли кавеолина-1 и кавеол в механотрансдукции и ремоделировании кровеносных сосудов. J Clin Invest. 2006. 116 (5): 1284–91. pmid: 16670769.
  45. 45. Пак Х., Го Ю.М., Дарджи Р., Чой Дж. У., Лисанти М.П., ​​Маланд М.С. и др. Кавеолин-1 регулирует зависимую от напряжения сдвига активацию киназы, регулируемой внеклеточными сигналами. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000; 278 (4): h2285–93. pmid: 10749726.
  46. 46. Бу YC, Sorescu G, Boyd N, Shiojima I, Walsh K, Du J и др.Напряжение сдвига стимулирует фосфорилирование эндотелиальной синтазы оксида азота по Ser1179 посредством Akt-независимых механизмов: роль протеинкиназы A. J Biol Chem. 2002. 277 (5): 3388–96. Epub 2001/12/01. [pii]. pmid: 11729190.
  47. 47. Бойд Н.Л., Пак Х., Йи Х., Бу Ю.К., Сореску Г.П., Сайкс М. и др. Хронический сдвиг вызывает образование кавеол и изменяет ответы ERK и Akt в эндотелиальных клетках. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003; 285 (3): h2113–22. pmid: 12763750.
  48. 48. Sun RJ, Muller S, Zhuang FY, Stoltz JF, Wang X.Перераспределение кавеолина-1 в эндотелиальных клетках человека, индуцированное ламинарным потоком и цитокином. Биореология. 2003. 40 (1–3): 31–9. Epub 2002/11/28. pmid: 12454384.
  49. 49. Мэсси Дж. Б., Паунолл Х. Дж. Роль структуры оксистерина в индуцированной микродоменом микросолюбилизации фосфолипидных мембран аполипопротеином A-I. Биохимия. 2005. 44 (43): 14376–84. pmid: 16245954.
  50. 50. Massey JB, Pownall HJ. Строение биологически активных оксистеринов определяет их дифференциальное действие на фосфолипидные мембраны.Биохимия. 2006. 45 (35): 10747–58. Epub 31.08.2006. pmid: 16939227.
  51. 51. Wang J, Megha, London E. Взаимосвязь между структурой стерол / стероид и участием в упорядоченных липидных доменах (липидных рафтах): последствия для структуры и функции липидных рафтов. Биохимия. 2004. 43 (4): 1010–8. pmid: 14744146.
  52. 52. Бертье А., Лемер-Юинг С., Пруне С., Монье С., Атиас А., Бесседе Г. и др. Участие кальций-зависимого дефосфорилирования BAD, связанного с локализацией Trpc-1 в липидных рафтах, в апоптозе клеток THP-1, индуцированном 7-кетохолестерином.Смерть клетки отличается. 2004. 11 (8): 897–905. pmid: 15105836
  53. 53. Оуэн Д.М., Рентеро С., Магенау А., Абу-Синия, А. Гаус, К. Количественная визуализация липидного порядка мембран в клетках и организмах. Протоколы природы. 2011; 7 (1): 24–35. pmid: 22157973
  54. 54. Рентеро С., Зеч Т., Куинн С.М., Энгельхардт К., Уильямсон Д., Гревал Т. и др. Функциональные последствия конденсации плазматической мембраны для активации Т-клеток. PLoS One. 2008; 3 (5): e2262. Epub 2008/05/30. pmid: 18509459; PubMed Central PMCID: PMC2384009.
  55. 55. Gaus K, Zech T, Harder T. Визуализация мембранных микродоменов с помощью 2-фотонной микроскопии Лаурдана. Mol Membr Biol. 2006. 23 (1): 41–8. Epub 2006/04/14. V843884976828123 [pii] pmid: 16611579.
  56. 56. Оуэн Д.М., Магенау А., Уильямсон Д., Гаус К. Пересмотр гипотезы о липидном плоту — новые сведения о составе и функции плотины от флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. BioEssays. 2012. 34 (9): 739–47. pmid: 22696155
  57. 57. Оуэн Д.М., Гаус К.Визуализация липидных доменов в клеточных мембранах: появление флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Границы растениеводства. 2013; 4.
  58. 58. Уильямсон Д. Д., Оуэн Д. М., Росси Дж., Магенау А., Верманн М., Гудинг Дж. Дж. И др. Ранее существовавшие кластеры адаптера Lat не участвуют в ранних сигнальных событиях Т-клеток. Иммунология природы. 2011. 12 (7): 655–62. pmid: 21642986.
  59. 59. Росси Дж., Оуэн Д.М., Уильямсон Д.Д., Ян З., Гаус К. Конформационные состояния киназы Lck регулируют кластеризацию в ранней передаче сигналов Т-клеток.Иммунология природы. 2012; 14 (1): 82–9. pmid: 23202272
  60. 60. Хан Б., Тивари А., Кенуорти А. К.. Стратегии мечения сильно влияют на судьбу сверхэкспрессированного кавеолина-1. Движение. 2015; 16 (4): 417–38. pmid: 25639341; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4440517.
  61. 61. Ле Лей С., Хайдух Э., Линдси М.Р., Ле Лиепвр Х, Тиле С., Ферре П. и др. Индуцированное холестерином нацеливание кавеолина на липидные капли в адипоцитах: роль в кавеолярном эндоцитозе. Движение. 2006. 7 (5): 549–61.Epub 2006/04/29. TRA406 [pii] pmid: 16643278.
  62. 62. Gelissen IC, Brown AJ, Mander EL, Kritharides L, Dean RT, Jessup W. Нарушается отток стерола из пенистых клеток макрофагов, селективно обогащенных 7-кетохолестерином. Журнал биологической химии. 1996. 271 (30): 17852–60. pmid: 8663356.
  63. 63. Оуэн Д.М., Рентеро С., Росси Дж., Магенау А., Уильямсон Д., Родригес М. и др. PALM-визуализация и кластерный анализ гетерогенности белков на поверхности клеток. Журнал биофотоники.2010. 3 (7): 446–54. pmid: 20148419.
  64. 64. Аннибале П., Ванни С., Скарселли М., Ротлисбергер Ю., Раденович А. Идентификация артефактов кластеризации в фотоактивированной локализационной микроскопии. Природные методы. 2011; 8 (7): 527. pmid: 21666669

Скольжение Брайана Эноса, 20z. (59ml) Tub

Эта политика конфиденциальности определяет, как мы используем и защищаем любую информацию, которую вы предоставляете нам при использовании этого веб-сайта.

Мы стремимся обеспечить защиту вашей конфиденциальности.Если мы попросим вас предоставить определенную информацию, с помощью которой вас можно будет идентифицировать при использовании этого веб-сайта, вы можете быть уверены, что она будет использоваться только в соответствии с настоящим заявлением о конфиденциальности.

Мы можем время от времени изменять эту политику, обновляя эту страницу. Вам следует время от времени проверять эту страницу, чтобы убедиться, что вас устраивают любые изменения.

Что собираем

Мы можем собирать следующую информацию:

  • ФИО и должность
  • Контактная информация
  • , включая адрес электронной почты
  • демографическая информация, такая как почтовый индекс, предпочтения и интересы
  • другая информация, относящаяся к опросам клиентов и / или предложениям

Что мы делаем с информацией, которую собираем

Нам нужна эта информация, чтобы понять ваши потребности и предоставить вам лучший сервис, в частности, по следующим причинам:

  • Ведение внутреннего учета.
  • Мы можем использовать информацию для улучшения наших продуктов и услуг.
  • Мы можем периодически отправлять рекламные сообщения о новых продуктах, специальных предложениях или другую информацию, которая, по нашему мнению, может вас заинтересовать, используя указанный вами адрес электронной почты.
  • Время от времени мы также можем использовать вашу информацию, чтобы связываться с вами в целях исследования рынка. Мы можем связаться с вами по электронной почте, телефону, факсу или почте. Мы можем использовать эту информацию для настройки веб-сайта в соответствии с вашими интересами.

Безопасность

Мы стремимся обеспечить безопасность вашей информации. Чтобы предотвратить несанкционированный доступ или раскрытие информации, мы внедрили соответствующие физические, электронные и управленческие процедуры для защиты и защиты информации, которую мы собираем в Интернете.

Как мы используем файлы cookie

Cookie — это небольшой файл, который запрашивает разрешение на размещение на жестком диске вашего компьютера. Как только вы соглашаетесь, файл добавляется, и cookie помогает анализировать веб-трафик или сообщает вам, когда вы посещаете определенный сайт.Файлы cookie позволяют веб-приложениям реагировать на вас как на человека. Веб-приложение может адаптировать свои операции к вашим потребностям, симпатиям и антипатиям, собирая и запоминая информацию о ваших предпочтениях.

Мы используем файлы cookie журнала трафика, чтобы определить, какие страницы используются. Это помогает нам анализировать данные о посещаемости веб-страниц и улучшать наш веб-сайт, чтобы адаптировать его к потребностям клиентов. Мы используем эту информацию только для целей статистического анализа, а затем данные удаляются из системы.
В целом, файлы cookie помогают нам улучшить веб-сайт, позволяя отслеживать, какие страницы вы считаете полезными, а какие нет. Файл cookie никоим образом не дает нам доступа к вашему компьютеру или какой-либо информации о вас, кроме данных, которыми вы хотите поделиться с нами.
Вы можете принять или отклонить файлы cookie. Большинство веб-браузеров автоматически принимают файлы cookie, но обычно вы можете изменить настройки своего браузера, чтобы отклонять файлы cookie, если хотите. Это может помешать вам в полной мере использовать возможности веб-сайта.

Ссылки на другие сайты

Наш веб-сайт может содержать ссылки на другие интересные веб-сайты. Однако, как только вы использовали эти ссылки, чтобы покинуть наш сайт, вы должны помнить, что мы не имеем никакого контроля над этим другим сайтом. Поэтому мы не можем нести ответственность за защиту и конфиденциальность любой информации, которую вы предоставляете при посещении таких сайтов, и такие сайты не регулируются данным заявлением о конфиденциальности. Вам следует проявлять осторожность и ознакомиться с заявлением о конфиденциальности, применимым к рассматриваемому веб-сайту.

Управление вашей личной информацией

Вы можете ограничить сбор или использование вашей личной информации следующими способами:

  • всякий раз, когда вас просят заполнить форму на веб-сайте, найдите поле, которое вы можете щелкнуть, чтобы указать, что вы не хотите, чтобы информация использовалась кем-либо в целях прямого маркетинга
  • , если вы ранее согласились с тем, чтобы мы использовали вашу личную информацию в целях прямого маркетинга, вы можете в любое время изменить свое решение, написав нам или отправив нам электронное письмо.

Мы не будем продавать, распространять или сдавать в аренду вашу личную информацию третьим лицам, если у нас нет вашего разрешения или если это не требуется по закону. Мы можем использовать вашу личную информацию для отправки вам рекламной информации о третьих лицах, которая, по нашему мнению, может вас заинтересовать, если вы сообщите нам о своем желании.

Если вы считаете, что какая-либо информация о вас, которую мы храним, неверна или неполна, напишите нам или напишите нам как можно скорее. Мы незамедлительно исправим любую информацию, которая окажется неверной.

Комплекс SWELL1-LRRC8 регулирует эндотелиальную передачу сигналов AKT-eNOS и функцию сосудов

Редакции для этого документа:

1) Авторы должны реагировать на опасения тщательным редактированием рукописи и воздерживаться от выводов, не полностью подтверждаемых текущими данными, таких как «SWELL1 регулирует передачу сигналов AKT-eNOS через сигнальный комплекс SWELL1-GRB2-Cav1», «SWELL1 отрицательно регулирует Сигнализация mTOR ». Кроме того, так же, как TRPV4, активируемый гипотонией, вопрос о том, является ли VRAC механочувствительным, также является предметом споров.

Мы согласны с этими комментариями и благодарим рецензентов за указание на это. Мы отредактировали рукопись, как описано выше.

2) Доказательства взаимодействия SWELL1 с Grb2, Cav1 и eNOS не обязательно раскрывают лежащий в основе механизм (ы) того, как SWELL1 регулирует базальную экспрессию eNOS и передачу сигналов AKT-eNOS. Что может активировать / регулировать SWELL1 при базальном состоянии? Требуется ли для эффектов активность канала SWELL1? Если да, то как проводимость канала регулирует передачу сигналов Grb2? Если нет, то как само межбелковое взаимодействие регулирует передачу сигналов Grb2.Сбивание с ног SWELL1 не снижает взаимодействия между Grb2 и Cav1 (рис. 3A). Таким образом, предположительно, SWELL1 не требуется для образования белкового комплекса как такового. Представленные данные не касаются механизма того, как SWELL1 регулирует экспрессию eNOS и базальную передачу сигналов AKT-eNOS.

Мы согласны с тем, что мы не очертили подробный молекулярный механизм, который лежит в основе того, как SWELL1 регулирует базальную экспрессию eNOS, или как он регулирует фосфорилирование eNOS (p-eNOS). В этой статье мы просто демонстрируем, что SWELL1 образует комплекс с GRB2, Cav1 и eNOS, демонстрируем, что истощение SWELL1 нарушает pAKT и peNOS, а затем выдвигаем гипотезу (теперь добавленную в Обсуждение), что эти сигнальные эффекты происходят через белок-белковые взаимодействия между SWELL1 , GRB2, Cav1 и eNOS — аналогично предложенной нами ранее рабочей модели передачи сигналов SWELL1-GRB2-AKT2 в адипоцитах (Zhang et al., 2017 и Gunasekar et al., 2019). Мы также предлагаем альтернативный механизм, который учитывает опосредованные каналом SWELL1 эффекты в мембране эндотелиальных клеток и приток кальция через другие механочувствительные (Piezo1) или механореактивные (TRPV4) — также добавлены в раздел «Обсуждение». Описание этих детальных молекулярных механизмов будет предметом будущих рукописей.

3) Напряжение сдвига жидкости — более значимая сила, испытываемая эндотелием. Хорошо известно, что напряжение сдвига стимулирует многократное увеличение фосфорилирования AKT и eNOS в HUVEC.Это один из признаков механочувствительности эндотелия. Однако авторы проводили эксперименты по растяжению клеток HUVEC и, соответственно, наблюдали очень слабый ответ AKT-eNOS. Таким образом, напряжение сдвига может быть более подходящей системой для проверки потенциальной роли SWELL1 в механотрансдукции эндотелия.

Эндотелий сосудов подвергается воздействию множества механических сил, включая ламинарный, непрерывный, турбулентный и пульсирующий сдвигающий поток, в дополнение к силам растяжения, которые возникают во время волн артериального давления при каждом сокращении сердца.Действительно, существуют десятки работ, в которых изучается реакция эндотелиальных клеток на осевое растяжение (Reviewed in Jufri et al., 2015), как и у нас, так что, по нашему мнению, это остается актуальным механическим стимулом для изучения. Однако мы согласны с тем, что сдвиговый поток также является важным стимулом для изучения в HUVECs при истощении SWELL1. Соответственно, мы включили новый эксперимент, показанный на новом рисунке 5 и новом рисунке 5 — видеоролики 1-4, в которых мы обнаружили, что способность HUVEC выстраиваться вдоль направления ламинарного сдвигового потока заметно нарушена в клетках SWELL1 KD, что предполагает что эти клетки либо имеют нарушенную способность ощущать, либо реагировать на ламинарный сдвигающий поток (или и то, и другое).С этим связано снижение индукции p-eNOS (оцениваемое по окрашиванию IF) в ответ на сдвиг потока в HUVEC, истощенных SWELL1. Эти данные согласуются с результатами p-eNOS, наблюдаемыми в базовых условиях и в ответ на осевое растяжение. Система сдвигового потока, доступная нам для этих исследований, была ограничена по количеству клеток, которые можно было высеять, и поэтому мы не смогли выполнить вестерн-блоттинг для оценки передачи сигналов, опосредованной сдвиговым потоком, как мы могли бы выполнять с системой FlexCell, несмотря на несколько недель усилий.По этой причине мы прибегли к количественной оценке peNOS с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, что возможно с гораздо меньшим количеством клеток. Тем не менее, мы благодарим рецензента за то, что он поднял этот вопрос, поскольку он позволил нам раскрыть клеточный фенотип, который мы иначе не наблюдали бы, а также побудил нас изучить другую физиологически значимую форму механической стимуляции.

До сих пор очень неясно, действительно ли SWELL1 является механочувствительным каналом.Активируется ли эндотелиальный канал SWELL1 под действием напряжения сдвига и / или растяжения? Как активация канала приводит к нижестоящим изменениям в передаче сигналов AKT-eNOS за счет изменений мембранного потенциала, вторичного массажа или изменений комплексов Grb2-Cav1-eNOS?

Это оба очень хорошие вопросы. Мы не ответили на эти конкретные вопросы в этой рукописи, но они остаются вопросами для следующей статьи или для исследований, так как в настоящее время мы разрабатываем методы для измерения активации эндотелиального канала SWELL1 в ответ на сдвигающий поток.Гипотезы, относящиеся ко второму вопросу о том, как «активация канала приводит к нижестоящим изменениям в передаче сигналов AKT-eNOS за счет изменений мембранного потенциала, вторичного массажа или изменений комплексов Grb2-Cav1-eNOS» теперь также рассматриваются в Обсуждении.

4) Авторы предположили, что SWELL1 регулирует AKT-eNOS, продукцию NO и, таким образом, играет роль в вазодилатации, что может объяснять фенотип KO мышей, такой как гипертензия и микрососудистые заболевания сетчатки на фоне диабета 2 типа.Более подробная биохимическая и клеточно-биологическая характеристика мышей eSWELL1 KO необходима для объединения данных в HUVEC с мышиной моделью. Например, точно установлено, что кровоток вызывает расширение сосудов брыжеечных артерий ex vivo. Обнаружены ли в артериях eSWELL1 KO дефект вазодилатации, вызванный кровотоком? Существует ли резкое подавление экспрессии eNOS у мышей KO? Нарушается ли вызванное потоком высвобождение NO в эндотелии КО?

Как упоминалось во вступительном абзаце выше, новые эксперименты с мышью eSWELL1 KO были невозможны в течение последних нескольких месяцев из-за временного отсутствия этой модели мыши из-за воздействия COVID19.Соответственно, мы обратились к этим комментариям, «чтобы связать данные в HUVEC с моделью мышей», используя образцы тканей, которые были ранее собраны у этих мышей. В частности, мы выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание на p-eNOS в эндотелии из аорт, собранных у мышей WT и eSWELL1 KO (рис. 7H и I), и обнаружили, что это также уменьшается, как и в случае HUVEC SWELL1 KD. Опять же, как только колония мышей WT и eSWELL1 KO снова станет доступной, мы изучим опосредованную потоком вазодилатацию и другие измерения индуцированного потоком высвобождения NO в эндотелии сосудов.

5) Общие изменения уровней eNOS и AKT интересны и не исследуются экспериментально и не обсуждаются. Авторы должны прокомментировать потенциальный механизм / значение этого в отношении фенотипических наблюдений.

Мы согласны с тем, что эти изменения в выражении eNOS интересны и требуют дальнейшего изучения. Мы можем только предполагать, что SWELL1 каким-то образом регулирует экспрессию гена eNOS. Учитывая, что считается, что NF-kappaB регулирует экспрессию eNOS в эндотелии, мы предполагаем, что этот путь может быть задействован.Более того, как было описано, пути передачи сигналов PI3K и ERK1 / 2 регулируют общую экспрессию eNOS (обзор Wu et al., 2002), и мы наблюдаем снижение передачи сигналов PI3K и ERK1 / 2 в HUVEC SWELL1 KD, поэтому снижение eNOS экспрессия определенно согласуется с нарушениями этих сигнальных путей. Действительно, в соответствии с этой консервативной биологией в отношении передачи сигналов SWELL1, мы также наблюдали значительное 2-кратное снижение экспрессии AKT2 при делеции SWELL1 как в адипоцитах 3T3-F442A, так и в мышечных трубках C2C12, в дополнение к снижению NOS2 (iNOS) в адипоцитах и NOS1 (нейрональная NOS) в C2C12.В совокупности эти данные по множеству типов клеток подтверждают опосредованный PI3K и ERK1 / 2 механизм регуляции экспрессии генов eNOS и AKT2. Эти механизмы теперь обсуждаются в Обсуждении.

6) Активен ли SWELL1 постоянно? Как авторы объясняют «базальный» (без растяжения) эффект SWELL1 KD?

Мы действительно полагаем, что SWELL1 обладает конститутивной активностью посредством передачи сигналов белок-белок, сдерживая ингибирование GRB2 пути PI3K-AKT-MAPK, или с помощью механизмов, опосредованных проводящими каналами, которые еще предстоит изучить.Действительно, другие проводили измерения базальной или конститутивной активности VRAC в нейронах (Zhang, H., et al., PLoS ONE 2011; Inoue, H., et al., J. Neurosci 2007) и β-клетках (Best, L и др. Pflug. Arch. 2002) и оценили его как NP = ~ 0,06, при 1 мМ глюкозы в β-клетках.

7) Обе животные модели кормления / HFHS с SWELL1 KO не были фенотипированы полностью. По крайней мере, следует сообщать основные характеристики, такие как вес, активность и т. Д., Чтобы исключить «метаболические» причины наблюдаемых сосудистых эффектов.Это особенно важно, поскольку ITT / GTT были проведены через 10 месяцев — продвинутый / старый этап, на котором трудно увидеть различия в ITT / GTT.

Теперь мы включаем дополнительные данные метаболического фенотипирования мышей WT и eSWELL1 KO, выращенных на диете HFHS, включая массу тела, массу жира, безжировую массу,% жировой массы и% безжировой массы на рис. 8 — приложение 4 к рисунку, дополняющее GTT и ITT. данные предоставлены в первом представлении. Эти данные показывают разницу в массе тела, которая вызвана повышенным ожирением у самок мышей, но не у самцов.Однако значительные различия в кровотоке в сосудах сетчатки у самок мышей наблюдаются в отсутствие измеримых различий в гликемическом контроле или системной чувствительности к инсулину.

8) Путь mTOR слишком слаб, чтобы делать какие-либо претензии в Резюме; Я думаю, что это простое наблюдение, которое могло быть связано с «неизвестными» сигналами, выходящими за рамки того, что описано в рукописи.

Мы полностью согласны с этим комментарием и, соответственно, удалили его из аннотации и в первую очередь описываем результаты пути mTOR как любопытное наблюдение.

9) Данные анализа эксплантата, представленные на рисунке 5, отвлекают, поскольку не соответствуют истории eNOS; Ожидается, что передача сигналов SWELL1 более сложна, чем сообщалось, как про, так и против ангиогенных.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2019 © Все права защищены. Карта сайта