Лада в приора: LADA Priora седан – Запись на ТО, Скачать руководство по эксплуатации – Официальный сайт LADA - Автозапчасти ВАЗ

Lada Priora — цены и характеристики, фотографии и обзоры

Конструктивные особенности. Лада Приора является глубокой модернизацией ВАЗ-2110, но при этом существенных изменений в конструкцию шасси разработчиками внесено не было. По этой причине автомобиль получил устаревший вариант подвески (которая хотя и хорошо адаптирована к качеству российских дорог, но не способна обеспечить должный уровень комфорта), выверенную управляемость и хорошую курсовую устойчивость.

Конструктивные недостатки. Lada Priora не отличается высоким качеством сборки, из-за чего отмечается низкий уровень точности подгонки кузовных элементов, что повышает уровень шума в салоне, а также способствует воздействию воздушных потоков на устойчивость автомобиля. Низкое качество сборки отмечается и в салоне «Приоры», из-за чего очень быстро элементы отделки начинают «гулять», наполняя салон посторонними звуками. Кроме того, габаритные характеристики автомобиля и параметры настройки его подвески способствуют возникновению эффекта парусности кузова при маневрировании в условиях бокового ветра, что приводит к излишним кренам и снижению управляемости.

Самые слабые места. В список наиболее часто ломающихся узлов и агрегатов автомобилей семейства «Priora» специалисты включают:

опорные подшипники,
ШРУСы,
амортизаторы,
сайлентблоки передней подвески,
передние ступицы,
помпу,
компоненты бортовой электросистемы,
штатную сигнализацию,
стеклоподъемники.

Коррозия кузовных элементов, в первую очередь, появляется на капоте и крышке багажника (в местах установки декоративных накладок).

Двигатель вибрирует на холостом ходу. Как правило, причиной вибрации двигателя является прослабление подушек двигателя. Для устранения дефекта необходимо проверить качество затяжки крепежных болтов и уровень износа подушек. Если подушки повреждены, то потребуется их замена.

Плавают обороты двигателя. Чаще всего причина проблемы кроется в некорректной работе дроссельного узла из-за засорения его полостей. Для нормализации работы двигателя в этом случае необходимо снять дроссельный узел и провести его очистку.

Двигатель «троит». Троение мотора на Ладе Приоре, как правило, вызывается подсосом воздуха через изношенные резиновые заглушки, установленные в левом верхнем углу двигателя. Для устранения проблемы необходимо заменить заглушки.

Неустойчивая работа двигателя. Основная причина данной проблемы – снижение давления в топливной рампе, вызванное засорением сетчатого фильтра бензонасоса. Для решения проблемы необходимо снять бензонасос и провести его очистку.
Также отметим, что причинами неустойчивой работы мотора могут быть подсос воздуха через шланги двигателя, износ ремня ГРМ или износ компонентов ЦПГ.

Стартер не выключается после пуска мотора. Чаще всего данный дефект проявляется в зимнее время и вызывается застыванием смазки во втягивающем реле, что приводит к его залипанию. В летнее время залипание может спровоцировать попавшая грязь и влага. Для устранения дефекта необходимо разобрать втягивающее реле, очистить его компоненты от грязи и нанести морозоустойчивую смазку.

Затрудненный ход рычага КПП или повышенная шумность работы КПП. Данная проблема считается конструктивной особенностью КПП ВАЗовской разработки. Как правило, чаще всего проблема проявляется в зимнее время, а для снижения её негативного воздействия на работоспособность КПП специалисты рекомендуют заменить заводское масло на синтетическое с параметрами не ниже 75w90. Кроме того, длительное использование заводского масла в КПП способствует ускоренному механическому износу подвижных компонентов коробки, что чревато появлением стружки, сколов и выходом КПП из строя.

Стук передних стоек. Данная проблема не считается дефектом, а является конструктивной особенностью стоек марки СААЗ, используемых при сборке автомобиля. Для устранения стучащих звуков потребуется замена стоек на более качественные аналоги от других производителей.

Стук с правой стороны подкапотного пространства. Если в работе подвески проблем не наблюдается, то причиной возникновения постороннего стука может стать бачок гидроусилителя руля, который, из-за ослабления крепления, опускается вниз и стучит о защиту колеса.

Печка дует некорректно. Проблемы в работе отопителя, как правило, связаны с выходом из строя моторедукторов, управляющих переключением заслонок. Для устранения проблемы необходимо заменить вышедшие из строя моторедукторы. Также следует проверить подвижность самих заслонок, которые могут подклинивать из-за попавшей грязи.

Быстрый выход из строя АКБ. На некоторых автомобилях Lada Priora АКБ служит один–полтора года. Данный дефект вызван некорректной работой регулятора напряжения. Для решения проблемы необходимо заменить регулятор.

Запотевание задних фонарей после дождя или мойки. Как правило, задние фонари начинают запотевать из-за засорения вентиляционных отверстий, имеющихся в их корпусе. Для решения проблемы необходимо очистить вентиляционные отверстия от попавшей в них грязи.

Ложное срабатывание сигнализации (а так же отказ открывать или закрывать двери). Данные симптомы указывают на выход из строя штатной сигнализации. Для устранения проблемы потребуется полная замена системы сигнализации.

Стуки и скрипы в салоне. Практически на всех автомобилях семейства «Priora» со временем появляются посторонние звуки в салоне. Для снижения уровня шума и устранения проблемы необходимо проклеить все съемные элементы отделки салона шумопоглащающими материалами или закрепить их 2-сторонним скотчем. Кроме того, рекомендуется смазать силиконовой смазкой дверные петли и замки, места крепления и салазки передних кресел.

Скопление воды в багажнике. Довольно часто после дождя или мойки в багажнике «Приоры» можно найти лужицы, образующиеся в нишах под задними фонарями. Для удаления воды необходимо вытащить резиновые заглушки, имеющиеся на дне данных водосборных ниш.

АвтоВАЗ объяснил прекращение выпуска Lada Priora :: Бизнес :: РБК

АвтоВАЗ в конце июля прекратит выпускать автомобиль Lada Priora. Решение было принято из-за низкого спроса на эти машины и растущего спроса на более новые модели компании

Фото: Андрей Холмов / РИА Новости

Выпуск автомобилей Lada Priora в Тольятти будет прекращен в конце июля.

Об этом говорится в сообщении компании, поступившем в РБК.

По словам исполнительного вице-президента по продажам и маркетингу АвтоВАЗа Яна Птачека, в последние три года из-за выпуска нового поколения автомобилей, таких как Lada Vesta, Lada XRAY, покупатели продукции компании воспринимают бренд иначе. «А это, в свою очередь, ведет к снижению спроса на Lada Priora», — пояснил он.

Lada Priora была хорошим автомобилем «для своего времени», выпуск этой модели позволил АвтоВАЗу выжить десять лет назад, добавил он.

Выпуск Lada Priora АвтоВАЗ начал в 2007 году, несколько раз с тех пор изменив кузов и двигатель модели. Пик популярности автомобиля пришелся на 2011-й, когда производителю удалось реализовать за год 138 тыс. машин. Всего за десять лет было выпущено более 860 тыс. автомобилей.

В 2015 году АвтоВАЗ решил максимально снизить стоимость этой модели, чтобы «продлить ей жизнь», говорил представитель компании Сергей Ильинский, хотя до этого обсуждалось, что производство Lada Priora прекратят, чтобы отдать мощности под сборку Lada Vesta.

Сборочная линия №3, где собирали Priora, продолжит работу: на этой линии с прошлого года собирают также универсалы Lada 4×4 («Нива»), уточнили в АвтоВАЗе.

Lada Priora уезжает в историю – Бизнес – Коммерсантъ

В конце июля на АвтоВАЗе завершится производство Lada Priora. На предприятии остановку выпуска связывают с новым восприятием бренда у потребителей, в который не вписывается морально устаревший автомобиль. Эксперты не исключают, что с уходом модели с конвейера на АвтоВАЗе могут последовать сокращения, а ряд производителей автокомпонентов потеряют рынок сбыта.

В конце июля завершится производство автомобилей Lada Priora, эту информацию 16 июля наконец официально подтвердили в автоконцерне. Решение было принято исходя из интереса потребителей к последним моделям АвтоВАЗа и снижающегося спроса на Priora.

В 2017 году, по данным «Автостата», Priora вошла в десятку самых популярных российских автомобилей, было продано 15 тыс. машин. В нынешнем году продажи снижались, и модель не попала в топ-25 самых популярных автомобилей на российском рынке по итогам первого полугодия. Другие модели АвтоВАЗа реализуются значительно лучше. Так, по данным Ассоциации европейского бизнеса, за первое полугодие продано 49,6 тыс. Lada Vesta и 45,7 тыс. Granta, модели заняли второе и третье места в рейтинге продаж, уступив лишь Kia Rio (51,6 тыс. автомобилей). На 11-м месте Lada XRAY — 16,3 тыс. проданных машин, на 16-м — Lada 4X4 (более 15 тыс. автомобилей). При этом Priora продолжает пользоваться популярностью в регионах Северо-Кавказского ФО, где модель находится на третьем месте по продажам, уступая лишь Vesta и Granta. При этом на рынке подержанных машин в регионе Priora лидирует и демонстрирует стабильный рост.

Lada Priora появилась в 2007 году, заменив на рынке ВАЗ 2110 («десятка»). Фактически Priora и является модифицированной «десяткой», в конструкцию было внесено около 1 тыс. изменений и внедрено порядка 2 тыс. новых деталей. Спустя год после дебюта появилась модификация «хэтчбек», еще через год — в кузове «универсал». Были и гоночные Priora, участвовавшие в международной гоночной серии WTCC. Всего было произведено более 850 тыс. автомобилей этой модели. Наибольшей популярности модель достигла в 2011 году, когда было продано 138 тыс. автомобилей. Автомобиль также выпускался в Чечне на заводе «Чеченавто».

«Для своего времени Lada Priora была очень хорошим автомобилем, который помог АвтоВАЗу выжить десять лет назад,— отметил исполнительный вице-президент по продажам и маркетингу концерна Ян Птачек.— В связи с кардинальными изменениями бренда Lada в течение последних трех лет и запуском нового поколения автомобилей 2015–2018 годов наши потребители меняют свое восприятие бренда, это ведет к снижению спроса на Priora». В АвтоВАЗе отмечают, что планируют открыть новые вакансии на производственных и автокомпонентных линиях. На сборочной линии №3, где собирали Priora, продолжится производство Lada 4X4.

Алексей Антонов из ГК «Алор» считает, что вероятность сокращения штатов АвтоВАЗа нельзя исключать, но до массовых сокращений не дойдет. «Производственные мощности будут востребованы как для производства моделей Lada, так и других автомобилей собственника предприятия (Renault-Nissan. — “Ъ”)»,— считает он. Гораздо больше опасений у аналитика вызывают перспективы производителей автокомпонентов. «При новом собственнике число независимых поставщиков АвтоВАЗа сократилось более чем в десять раз, при этом ряд поставщиков в связи со снижением объема закупок вовсе прекратил существование, в том числе и крупнейший “АвтоВАЗагрегат”,— замечает господин Антонов.— Понятно, что новые модели под маркой Lada будут создаваться с учетом уже производимых компонентов и агрегатов, так что, скорее всего, объем закупок у сторонних производителей может в очередной раз упасть».

Гендиректор ассоциации предприятий машиностроения «Кластер автомобильной промышленности Самарской области» Андрей Крайнов считает, что с автопромом расстанутся те производители компонентов, которые работали только для Priora и не развивались: «Мы сейчас работаем над развитием поставщиков, взаимодействуем с региональным правительством. Конечно, сложно подтянуть тех, кто не развивался последние годы, фактически с нуля до мирового уровня. Но сейчас все зависит от самих поставщиков, от того, насколько они хотят развиваться».

По информации господина Крайнова, в 2021 году у АвтоВАЗа появится новая платформа, конкурсы на определение поставщиков пройдут в ближайшее время, и уже сейчас можно заниматься модернизацией производства. На самом АвтоВАЗе информацию о новой платформе пока не подтверждают. По имеющимся данным, вскоре может появиться новая перспективная модель, которая заменит Priora.

Вячеслав Сорокин, Самара

Официальный Лада Приора Клуб | LADA Priora Club

	Раздел	Последнее сообщение	Тем	Сообщений
Общая информация
		10. 12.2019 21:26	5	80
	Раздел, где мы подробно рассказываем о форуме и о разделах. Особо рекомендуем к прочтению всем новичкам! РАЗДЕЛ ТОЛЬКО ДЛЯ ЧТЕНИЯ!	12.03.2010 20:05	6	9
	Совместный проект Официального Лада Клуба и ОАО «АВТОВАЗ» по вопросам качества автомобилей LADA.	19.08.2020 14:55	16	523
	Конкурсы, проводимые Лада Приора Клубом среди калиноводов с ценными призами и подарками!	07.12.2018 23:22	10	1,281
Новости и объявления
	АВТОВАЗ запускает акцию «Хороший. Плохой. Злой» и предлагает дать оценку тому или иному дилеру LADA, выразить претензию или похвалить. Для этого мы открываем на форуме два раздела: «Черный список» и «Белый список».	22.10.2020 14:15	7	531
	Новости об автомобилях Лада Приора ВАЗ 2170 (седан), ВАЗ 2172 (хэтчбек), ВАЗ 2171 (универсал) и дорестайлинговом, десятом семействе (ВАЗ-2110, 2111, 2112), собранные на бескрайних просторах интернета.	24.11.2020 18:45	365	19,783
	Новости АВТОВАЗа и других российских производителей, собранные на бескрайних просторах интернета.	01.11.2020 08:18	926	14,213
	Новости об автомобилях зарубежных производителей, собранные на бескрайних просторах интернета.	16.02.2021 13:30	84	4,776
	Автомобильное законодательство. Обсуждение по вопросам административных правонарушений, прохождения техосмотра, регистрации ТС, получения ВУ взаимоотношений с ГИБДД, страховыми компаниями	09.02.2021 01:04	198	20,887
	Новости, анонсы, вопросы и пожелания по информационному телевизионному Интернет-каналу ВАЗ ТВ. Раздел ведут специалисты ВАЗ ТВ.	08.12.2018 10:21	26	735
	Специальный проект Лада Приора Клуба. Прямая связь с специалистами АВТОВАЗ. Задавайте свой вопрос, получайте ответ из первоисточника.	08.12.2018 19:02	3	115
Обсуждение автомобилей
	Отзывы владельцев о своих автомобилях Lada Priora седан, хэтчбек и универсал. Ощущения и опыт, полученный в условиях реальной эксплуатации. Плюсы и минусы автомобилей Лада Приора.	Вчера 02:06	84	55,468
	Результаты различных тестов автомобилей Lada Priora, сравнения с конкурентами, а также бесконечные споры о том, стоит ли покупать Ладу Приору или лучше взять что-то другое. ..	31.12.2020 02:27	218	144,527
	Обсуждение процедуры покупки автомобиля Lada Priora: на что обратить особое внимание и что делать сразу после покупки.	30.04.2020 17:23	47	11,063
	Обсуждение других автомобилей, как иностранного, так и отечественного производства. Разговоры о любых автомобилях, кроме Лада Приора (Lada Priora).	16.01.2021 02:25	122	35,661
Технические вопросы по Ладе Приоре
	Полезная информация о обслуживании и ремонте автомобилей Лада Приора седан, хетчбек и универсал и ВАЗ-2110, 2111, 2112 в различных автоцентрах, отзывы о качестве проведения ТО и т. п.	10.04.2020 01:09	163	14,488
	Обсуждение общих вопросов по эксплуатации автомобилей Lada Priora ВАЗ 2170 (седан), ВАЗ 2172 (хэтчбек) и ВАЗ 2171 (универсал). Здесь можно задавать вопросы по автомобилю в целом, не относящиеся к другим техническим разделам форума.	23.02.2021 20:53	124	39,528
	Обсуждение вопросов по двигателям автомобилей Лада Приора (Lada Priora) 1,6 и 1,8 л., системам охлаждения, питания, зажигания и управления двигателем, системе выпуска отработавших газов.	27.02.2021 21:21	293	144,535
	Обсуждение вопросов по сцеплению и коробке передач автомобилей Lada Priora 2170 (седан), ВАЗ 2171 (универсал) и Лада Приора 2172 (хетчбек).	27.02.2021 22:10	140	21,479
	Обсуждение вопросов по передней и задней подвеске, рулевому управлению и тормозной системе автомобилей Лада Приора седан, хэтчбэк, универсал и купе (Lada Priora Coupe).	Сегодня 01:05	351	83,983
	Обсуждение вопросов по электрооборудованию автомобилей Лада Приора (Lada Priora): аккумулятор, генератор, стартер, освещение и световая сигнализация, бортовой компьютер и т.д. Подразделы: АКБ, стартер, генератор, замок зажигания, ЭУР, Штатная сигнализация, центральный замок, иммобилайзер, блок электропакета, Стеклоочиститель, стеклоподъёмники, обогрев заднего стекла и зеркал,подогрев сидений, Проводка, блоки предохранителей, СНПБ, парктроник, датчик дождя и света, звуковой сигнал, Фары, фонари, лампы, освещение салона, Комбинация приборов. Датчики и указатели., ВАЗ-2110, 2111, 2112, Архив старых и закрытых тем	27.02.2021 11:32	576	89,765
	Обсуждение вопросов по антикоррозийной обработке и шумоизоляции кузова автомобилей Лада Приора норма и люкс, системе отопления и вентиляции, сидениям и чехлам на них и т.д.	14.02.2021 21:29	318	69,077
	Обсуждение вопросов по бензинам, маслам, охлаждающим, тормозным и другим эксплуатационным жидкостям для автомобилей Лада Приора (Lada Priora) и ВАЗ-2110, 2111, 2112.	27.02.2021 11:04	129	52,423
	Обсуждение вопросов внешнего и внутреннего тюнинга автомобиля Лада Приора ВАЗ-2170, 2171 и 2172, выбора и установки дополнительного оборудования: сигнализаций, парктроников, зеркал, багажников и т. п.	16.01.2021 12:18	735	179,130
	Раздел об оригинальных запасных частях для автомобилей Лада. Официальный поставщик — ЗАО «ЛАДА Имидж».	13.03.2019 18:44	2	56
Лада Приора Клуб
	Обсуждаем и выбираем: рамки под номера, наклейки, футболки, кружки и многое другое.	31.08.2019 17:36	16	1,497
	Все клубные встречи, выезды, путешествия, походы на выставки и т. д.	10.01.2020 17:53	101	12,747
	Здесь можно обсуждать общие вопросы и размещать заявки на создание филиалов Лада Приора Клуба в вашем городе (районе, области, республике, стране).	05.11.2020 14:37	12	729
	Авто-спортивная команда клубов Лада Калина и Лада Приора. Обучение основным принципам безаварийного вождения, теории движения автомобиля; обсуждение авто-спортивных мероприятий.	29.05.2019 18:25	135	24,792
	Планирование и организация автопробегов и прочих совместных мероприятий владельцев автомобилей Лада Приора. Отчеты о путешествиях.	02.10.2020 21:07	128	12,605
	Представительства Лада Приора Клуба в центральной части России. Подразделы: Белгород, Брянск, Владимир, Воронеж, Иваново, Калуга, Кострома, Курск, Липецк, Москва, Орёл, Рязань, Смоленск, Тамбов, Тверь, Тула, Ярославль	Вчера 22:47	967	122,973
	Представительства Лада Приора Клуба на северо-западе России.	06.09.2020 15:44	305	26,791
	Представительства Лада Приора Клуба на родине Лады Приоры и в ближайших окрестностях. Подразделы: Чебоксары, Пенза, Ижевск, Республика Татарстан, Киров, Самарская область, Мордовия, Пермь, Уфа, Нижний Новгород, Йошкар-Ола, Саратов, Ульяновск, Оренбург	27.02.2021 09:29	1,100	204,630
	Представительства Лада Приора Клуба на юге России.	15.02.2021 07:58	211	26,596
	Представительства Лада Приора Клуба на Дальнем Востоке России.	08.10.2020 12:38	21	10,541
	Представительства Лада Приора Клуба на Урале.	13.05.2020 21:52	303	51,639
	Представительства Лада Приора Клуба в Сибири.	18.11.2020 09:00	505	100,290
	Представительства Лада Приора Клуба на Северном Кавказе.	28.05.2020 20:28	102	39,343
	Обсуждение локальных вопросов, встречи Лада Приора Клуба в Крыму.	14.01.2021 15:58	16	1,470
	Представительство Лада Приора Клуба в Украине!	03. 01.2021 22:18	146	7,895
	Обсуждение локальных вопросов, встречи Лада Приора Клуба в Казахстане.	01.11.2018 19:28	10	447
	Представительства Лада Приора Клуба в странах СНГ и других зарубежных странах.	17.09.2019 22:45	4	145
Административный раздел
	Обсуждение форума Лада Приора Клуба. Ждем от вас сообщений об ошибках, предложений по улучшению структуры и функционала форума.	27.02.2021 21:58	27	5,219
Общение на свободные темы
	Обсуждение спорта и спортивных мероприятий в жизни Приороводов!	Сегодня 01:03	47	19,964
	Место для общения на любые темы. Здесь можно (и нужно) рассказывать различные истории, байки, тащить сюда все самое интересное отовсюду. Подразделы: Дамский клуб, Компьютеры, КПК, телефоны, навигаторы, аудио, видео, фото техника и аксессуары, Художественные фото, Наши интересы, Игры, Архив Свободного общения (закрытые темы)	Сегодня 03:16	786	446,850
	Место для купли, продажи, обмена и бесплатной раздачи автомобилей Лада Приора, ВАЗ-2110, 2111, 2112 и их частей.	14.02.2021 21:56	677	6,222
	Все перемещенные модераторами сообщения находятся здесь.	07.02.2020 14:13	8	38

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов. Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше, чем размер типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли ученики в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же районе, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Визуализация флуоресценции с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применив методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже. Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденных состояний между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами. Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привела к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие средства контроля и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптического визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, циклическая эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C omplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция, названный cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP (названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка. Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных N и C концов и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на протонировании нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производный от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, которые имеют пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут регистрировать активность киназы в режиме реального времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать сенсор во время индукции апоптоза. За последние несколько лет было сообщено о большом количестве новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергообмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 — Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Ферстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 — Эффективность FRET

E _FRET = 1 / [1 + (r / R ₀ ) ⁶ ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно вычислить для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на Рисунок 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET может эффективно использоваться в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерения часто могут различать только high-FRET и low-FRET , или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или буферном) растворе определяется по довольно простому уравнению с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 — R (0)

R ₀ = [2,8 x 10 ¹⁷ × Κ ² × Q _D _D × Дж (λ)] ^1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может повлиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Практически для любой реальной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам). Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другие параметры, которые могут влиять на FRET, — это квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 — Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений во взаимодействиях белок-белок, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, выходящая за пределы диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET. В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия фиксирована и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозных помех (также называемых перекрестными помехами и кроссоверами ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (а) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие ( Рисунок 5 (b) ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, хорошо разделенных спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, рисунок 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, рисунок 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, поскольку каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать самые простые подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
Spectral Imaging — возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
Fluorescence Polarization Imaging — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — это самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереалистичном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, с помощью этого подхода сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рисунок 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля при ферментативном расщеплении пептидного линкера. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или уменьшение гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, ограничивая его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-тестов сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцепторов с использованием визуализации живых клеток. На Фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированные с B-субъединицей холерного токсина и нацеленные на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рисунке , рис. 6 (e), ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале Только.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в наносекундной области жизни сложны, а оборудование дорого в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Кроме того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных по двум отдельным каналам, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но превосходные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рисунок 7 (a) — это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль излучения от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (примерно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и становится очень похожим на спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивности на 475 и 529 нм этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображения поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом отбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, тогда излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 — Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображения, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку оно может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET должны быть ограничены визуализацией с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (а) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы обеспечить профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), таким образом заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. в каждом цветовом классе. Недавние достижения в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы инженерии белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и светостойкостью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как превосходный донор FRET для белков зеленого спектрального класса. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко отображены в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и намного более фотостабилен. Высокий квантовый выход излучения mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки голубого спектрального класса. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP под названием CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ) был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого цвета. и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных меток слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нм соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET 905 905 90522

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный из кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нм и эмиссию при 505 нм. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из наиболее универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), был также получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом из когда-либо созданных и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Венеру и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще предстоит установить. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с помощью мутации A206K, которая так хорошо работала с другими вариантами Aequorea (хотя это, очевидно, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка с дальним красным излучением.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (области, заштрихованные красным и синим цветом соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Однако mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) со значительно увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве конструкций биосенсоров. Самым ярким флуоресцентным белком в любом спектральном классе является тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования в биосенсорах FRET.Тандемно-димерная версия (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является его больший размер (вдвое больше, чем у мономерного белка), который может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также факта что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают от некоторой степени обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генно-инженерных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые дополнительно снижают тенденцию этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рис. 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих разную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум эмиссии 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к образованию мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок показывает яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для экспериментов по локализации и FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET с использованием флуоресцентных белков должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут в дальнейшем революционизировать этот новый подход к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Frontiers | FRET в биофизике мембран: обзор

Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это фотофизический процесс, при котором первоначально электронно возбужденный флуорофор, называемый донором (D), передает свою энергию возбуждения (и, таким образом, гасится) другому хромофору, называемому акцептором (A), электронный спектр поглощения которого перекрывает эмиссию D.Последний, первоначально находящийся в основном электронном состоянии, возбуждается при переносе и может (а может и не) флуоресцировать. FRET не включает ни эмиссию фотонов, ни молекулярный контакт между двумя видами, но сильно зависит от расстояния между ними. Для изолированной донорно-акцепторной пары коэффициент скорости (первого порядка) для взаимодействия FRET пропорционален обратной шестой степени этого расстояния (Förster, 1949). Характерная длина для FRET — это радиус Ферстера, R ₀, определяемый как расстояние донор / акцептор, при котором FRET в данной паре D / A эффективен на 50% (то есть так же вероятен, как и другие процессы D затухание возбуждения).На практике диапазон расстояний, для которого чувствителен FRET, составляет от 0,5 R ₀ до 2 R ₀, поскольку эффективность FRET в этом интервале изменяется от 98,5 до 1,5%. Значение R ₀ характерно для каждой пары D / A в данной среде, но обычно находится в диапазоне от 1,5 до 6 нм. Это означает, что FRET в основном чувствителен к расстояниям в масштабе от 1 до 10 нм, что недостижимо для традиционных методов оптической микроскопии, но полностью соответствует изучению важных вопросов биофизики мембран, таких как обнаружение и определение характеристик. нанодоменов / рафтов и взаимодействия липид-белок или белок-белок (рис. 1).

Рис. 1. Схематическое изображение применения FRET в биофизике мембран . Изображена только одна двухслойная листовка. (А) неоднородность мембраны; (B) определение поперечного расположения флуоресцентного остатка / метки; (C) селективность белок / липид; (D) олигомеризация белка.

Могут быть предусмотрены различные подходы, начиная от качественных исследований изменения эффективности FRET в установившемся режиме без учета лежащей в основе кинетики, до анализа данных флуоресценции с временным разрешением с соответствующими формализмами, позволяющими количественно восстанавливать топологическую информацию о системе под изучать.До недавнего времени эти последние сложные приложения в основном ограничивались простыми системами (обычно одно- или двухкомпонентными модельными мембранами), в то время как FRET изучает сложные системы, такие как мембраны живых клеток (для которых получение качественных данных флуоресценции с временным разрешением было технически невыполнимо) полагались на более качественные обработки. В настоящее время, с огромным развитием методов, основанных на флуоресцентной микроскопии, пространственное и временное разрешение могут быть эффективно объединены с изучением реальных биологических мембран.В этом обзоре описываются основные формализмы FRET в мембранах и указываются важные иллюстративные приложения FRET к множеству проблем в мембранных системах (Таблица 1).

Таблица 1 . Избранные примеры исследований мембран FRET .

Феноменологические применения FRET в мембранах

Даже если FRET используется в качестве качественного индикатора близости хромофора, без учета его реальной кинетики, все еще существует широкий спектр приложений в биофизике мембран.Кроме того, сложность некоторых систем является серьезным сдерживающим фактором для применения сложных формализмов, и более феноменологический подход может быть единственным доступным вариантом.

Классическим применением FRET является мониторинг липидного обмена или смешивания и слияния мембран, как, например, описано Struck et al. (1981). Эти авторы проследили слияние пузырьков фосфатидилсерина (PS), индуцированное ионами кальция. Смешивали две популяции везикул, одна из которых содержала зонды D и A, а другая — только немеченый фосфолипид.Выбранная пара FRET состояла из меченых фосфолипидов N — (7-нитро-2,2,3-бензоксадиазол-4-ил) фосфатидилэтаноламин (NBD-PE, D) и N — (лиссамин Родамин B сульфонил ) -диолеоилфосфатидилтаноламин (Rh-PE, A), и с тех пор, вероятно, стала наиболее часто используемой парой в исследованиях мембран FRET. При добавлении иона кальция слияние вызывает смешивание меченых и немеченых везикул. После перераспределения липидов за счет боковой диффузии поверхностная концентрация акцепторных зондов, окружающих каждого донора, уменьшается.Это приводит к уменьшению степени тушения донора с помощью FRET, эффективность передачи энергии снижается и, следовательно, увеличивается интенсивность излучения донора. Другая возможность состоит в том, чтобы отслеживать повышение эффективности FRET (уменьшение флуоресценции D) при смешивании популяции везикул, меченных только D, с другими, только меченными A, как показано в недавнем исследовании SNARE-опосредованного слияния (van den Bogaart et al. ., 2010).

При изучении латерального распределения липидов FRET между зондами с идентичными характеристиками распределения станет более эффективным вследствие разделения фаз (и, наоборот, для зондов, демонстрирующих предпочтение комплементарной фазы).Однако разделение зонда — не единственное явление, которое может повлиять на эффективность FRET. При изменении состава мембраны могут происходить вариации площади / липида и фотофизических параметров зонда (и, следовательно, R ₀), что потенциально может привести либо к ошибочной идентификации, либо к маскировке образования домена. С этой целью могут быть разработаны оригинальные схемы для более точного обнаружения начала образования домена, такие как предложенная Сильвиусом (2003), в которой эффективности FRET получены с акцептором, имеющим сродство к одной из липидных фаз и двум различным донорам. которые распределяются по разным мембранным доменам.Пока мембрана является гомогенной, вариации липидного состава будут одинаково влиять на эффективность FRET обеих пар D / A. Однако, если домены образуются, два донора разделяются на разные фазы, и эффективность тушения для каждой из них будет затронута противоположным образом.

Как упомянуто ниже, разделение D или A можно количественно оценить по параметрам разрешенной во времени флуоресценции D в присутствии A (анализируется глобально вместе с флуоресценцией в отсутствие A).FRET также можно использовать более простым способом в качестве индикатора предпочтения домена, как это продемонстрировано недавно предложенным «FRET анализом ассоциации рафта» (Nelson et al., 2010). Эффективность FRET между исследуемым белком (D) и одним из двух акцепторов, пирен-ДОФЭ (предпочитает фазу ld) и LcTMADPH (предпочитает фазу lo), измеряется и сравнивается с таковой с использованием других доноров, пептида LW (тип трансмембранной спирали). пептид с высоким сродством к доменам ld) и холерный токсин-B (белок, который связывается с связывающим рафт липидным ганглиозидом GM1 и имеет очень высокое сродство к доменам lo) в смеси липидов сосуществования в фазах ld / lo.Таким образом, в примерах этих авторов показано, что перфринголизин O имеет промежуточное сродство к рафту между пептидом LW и холерным токсином-B в везикулах, содержащих упорядоченные домены, богатые сфингомиелином головного мозга или 1,2-дистеароил- sn -3-глицерофосфохолин ( DSPC).

При исследовании взаимодействия липид / белок FRET между, например, мембранным пептидом или белком D и акцепторами липидов различных классов / ацильных цепей может указывать на предпочтительную ассоциацию или селективность для конкретного типа липидов, а FRET между D-несущими и А-несущие мембранные белки можно использовать для обнаружения образования гетеро- или гомоолигомеров белка.В этом случае количественные модели необходимы для дальнейшей характеристики этих взаимодействий (см. Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок ниже).

Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

Фёрстеровский резонансный перенос энергии между парами D / A, для которых расстояние D – A одинаково, например, подтвержденный в растворе двух хромофорных частиц, часто называют «внутримолекулярным» FRET. Количественную оценку степени FRET дает эффективность FRET, E , которая рассчитывается как

в этом уравнении, i _D ( t ) и i _DA ( t ) — распады D в отсутствие и в присутствии A (соответственно).Эффект FRET на флуоресценцию D заключается в уменьшении его времени жизни и квантового выхода. В этом простом случае закон затухания D остается экспоненциальным, хотя и быстрее, чем в отсутствие акцептора. Связь между временем жизни D в отсутствие и в присутствии A (τ ₀ и τ соответственно) определяется выражением

, где R — разделение D – A. Выражение, идентичное уравнению. 2 можно записать для квантового выхода флуоресценции или для стационарной интенсивности флуоресценции. R ₀ рассчитывается независимо от спектроскопических данных,

, где κ ² — фактор ориентации (подробное обсуждение см. В Van Der Meer et al., 1994), Φ _D — квантовый выход D в отсутствие A, n — показатель преломления, λ — длина волны (в единицах нм), I (λ) — это нормализованный спектр излучения D, а ε (λ) — молярный спектр поглощения. Таким образом, R легко вычисляется как из установившегося состояния, так и из времени. -решенные данные.Это основа использования внутримолекулярного FRET в качестве «спектроскопической линейки» (Страйер, 1978).

В контексте мембранной биофизики внутримолекулярный FRET все еще используется для получения структурной и динамической информации о мембранных белках. Это особенно важно, учитывая, что структуры с высоким разрешением многих мембранных белков (традиционно получаемых с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР-спектроскопии) все еще отсутствуют. Сайт-направленное мечение позволяет включать подходящие донорные и акцепторные группы FRET, и, исходя из измерения эффективности FRET, можно изучать белковое картирование и / или кинетику конформационных изменений.Последние приложения перечислены и кратко описаны в таблице 1.

Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

В мембранах каждая молекула D обычно окружена распределением молекул A. Следовательно, измерение одиночных расстояний D / A не имеет смысла и неосуществимо. Затухание излучения D становится сложным и зависит от топологии исследуемой системы, а также от концентрации A. Аналитические растворы все еще могут быть получены для равномерного распределения хромофоров.Для плоских распределений D и A распад D в присутствии A дан Фангом и Страйером (1978), Волбером и Хадсоном (1979):

В этом уравнении γ — неполная гамма-функция, R _e — минимальное расстояние D / A (расстояние исключения), а n — числовая концентрация A (молекул на единицу площади). Хотя он был первоначально получен для плоскости акцепторов, содержащей донор ( цис- перенос), он также действителен, если молекула D отделена от плоскости A расстоянием R _e, что является обычным для мембран, поскольку D и A часто находятся на разной глубине бислоя.

При приготовлении липидных пузырьков молекулы D и A часто с равной вероятностью вставляются в любой из двухслойных листочков. В этом случае необходимо рассматривать две плоскости A для данного D, одна из которых соответствует акцепторам, лежащим в той же двухслойной листке, что и донор, а другая — тем, которые расположены в противоположной листке. Закон распада в этом случае получается простым умножением собственного D-распада на члены FRET, соответствующие каждой плоскости A.

Еще одно обычное явление в мембранных системах — сложное затухание D даже в отсутствие A, при котором для правильного описания требуется сумма двух или трех экспонент.В этом случае приведенные выше уравнения все еще могут быть использованы при условии, что экспоненциальный член собственного распада D заменен этой функцией, а τ ₀ заменено средним по интенсивности (Lakowicz, 2006) временем распада. Это так, потому что каждый компонент срока службы характеризуется различным значением R ₀, пропорциональным обратной шестой степени соответствующего квантового выхода флуоресценции Φ _D (уравнение 3). Если все эти компоненты имеют одинаковые константы радиационного распада (обычно хорошее приближение), их значения Φ _D, в свою очередь, пропорциональны значениям τ ₀.Это означает, что скорости FRET для данного A, расположенного на расстоянии R [заданного как (1 / τ ₀) ( R ₀/ R ) ⁶], одинаковы независимо от D Компонент времени жизни учитывается, потому что он инвариантен (Loura et al., 1996, 2000b). Из-за этого постоянства уравнение. 4 можно использовать со средними значениями R ₀ и τ ₀. Здесь можно использовать спектроскопический R ₀ (рассчитанный с экспериментальным усредненным значением Φ _D) и истинное статистическое среднее значение τ ₀, которое является средним по интенсивности.

Для стационарных приложений уравнение. 4 можно интегрировать численно (в программе или электронной таблице) для получения кривых эффективности FRET E (рассчитанных с использованием уравнения 1) как функции концентрации акцепторов n с R _e в качестве параметра. В качестве альтернативы фиксируется R _e, и экспериментальные спады / эффективности FRET сравниваются с теоретическими ожиданиями. Возможная неспособность проанализировать кинетику FRET с помощью формализма равномерного распределения зондов может иметь значение (например,g., добавление нового компонента к данной однофазной двухслойной системе липидов может вызвать компартментализацию и / или разделение фаз и, следовательно, отклонения от теоретического ожидаемого однородного распределения).

Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

Неравномерное распределение компонентов и разделение фаз — обычное явление в липидных смесях. Молекулы, несущие флуорофоры D и A в эксперименте FRET в такой системе, естественно, будут иметь неоднородное распределение после их разделения между сосуществующими фазовыми доменами.Будем считать, что присутствуют только две фазы или типы доменов (наиболее частая экспериментальная ситуация). Если они достаточно велики, чтобы быть бесконечным в масштабе FRET (т. Е. Осложнения, возникающие в результате FRET с участием молекул в разных доменах или граничные эффекты, пренебрежимо малы; это имеет место, если размер доменов превышает ~ 5–10 R ₀), то закон распада донора представляет собой просто линейную комбинацию гипотетических законов распада в каждой фазе i _DA, _{фазе i} (заданной уравнением.4), взвешенное по относительному количеству D в каждой фазе A _i (Loura et al., 2000a, 2001):

Обратите внимание, что времена жизни D обычно различны в двух фазах, как и поверхностные концентрации A (и, возможно, также расстояния исключения D – A). Это вводит большое количество подгоночных параметров в уравнение. 5. Чтобы гарантировать значимое восстановление этих параметров, распад D в присутствии A анализируется глобально вместе с распадом в отсутствие A,

, где τ ₁ и τ ₂ — времена жизни D в каждой фазе.Восстановленные параметры обычно равны τ ₁, τ ₂, A ₂/ A ₁ (из чего получается коэффициент распределения D K _pD), а концентрации A в две фазы: C ₁ и C ₂ (из которых получается коэффициент распределения A K _pA; Loura et al., 2000a). Частным случаем этого формализма является ситуация так называемых «изолированных доноров», которая соответствует C ₂ = 0.

Будучи строго верной для бесконечного разделения фаз, эта модель может быть применена к образованию наноразмерных доменов; в этом случае восстановленный коэффициент распределения A («FRET» K _pA) не будет равен истинному коэффициенту, полученному из независимых измерений (интенсивность флуоресценции, анизотропия или время жизни A) («без FRET» K _pA), и на него влияет (ближе к единице, чем значение «без FRET») тот факт, что доноры в одной фазе чувствительны к акцепторам в другой.Степень этого отклонения отражает размер нанодоменов. В пределе очень малого размера домена (< R ₀) «FRET» K _pA по существу равно единице. Следовательно, этот вид анализа может дать представление о размере доменов и в случае бесконечного разделения фаз (что может быть подтверждено, если значения «FRET» и «non-FRET» K _pA неразличимы) было показано, что фазовая диаграмма бинарной смеси может быть получена из параметров распада (Loura et al., 2001). Бубольц (2007) предложил экспериментальный метод характеристики фазового разделения в липидных мембранах (и определение бинарных и тройных фазовых диаграмм в пределе бесконечной фазы), основанный на этом формализме, но полагающийся исключительно на акцепторную стационарную сенсибилизированную эмиссию. кто назвал это «FRET с постоянным разделением зонда» или SP-FRET. Применения этих методологий перечислены в Таблице 1.

Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

Не было получено точного решения скорости или эффективности FRET для случая неполного разделения фаз с доменами нанометрового размера данного типа, диспергированными в непрерывной фазе.Это происходит из-за очевидной потери симметрии, вызванной наличием доменов. Один из способов справиться с этой сложностью — рассчитать D-распад с помощью численного моделирования. По сути, процесс начинается с построения топологии липидной матрицы (т. Е. Определения размера моделируемой системы, формы домена, среднего размера и распределения размеров, а затем размещения доменов на матрице, гарантируя, что общая доля каждой фазы равна как предполагалось) и размещение молекул D и A с учетом их предпочтения в домене.Затем выбирается заданный D и вычисляется его взаимодействие со всеми акцепторами (или теми, которые находятся в пределах отсечения нескольких длин R ₀). Затем этот шаг повторяется для всех доноров, чтобы получить среднее значение по ансамблю для всей системы. Можно получить средний распад D, и, используя уравнение. 1 — значение КПД FRET.

Этот вид численного моделирования уже был описан Wolber и Hudson (1979) для равномерного распределения в плоской геометрии для проверки их аналитической теории.Первое численное решение FRET для неравномерного распределения мембранных зондов было дано Снайдером и Фрейре (1982). В этой работе неоднородность распределения зондов была введена путем включения эвристической потенциальной функции в случайное размещение зондов. Таким образом, домены фактически не моделируются, и хотя уравнения авторов подходят для анализа агрегации зондов в однофазной системе, они бесполезны в отношении разделения фаз. Моделирование, в котором неоднородность распределения зонда вводится путем построения двухфазной системы и с учетом разделения зонда, было представлено авторами для проверки их аналитических формализмов (Loura and Prieto, 2000; Loura et al., 2001; Тоулз и Дэн, 2007; Towles et al., 2007).

Другой подход к моделированию состоит в воссоздании процессов возбуждения и снятия возбуждения каждой молекулы D или A путем выполнения стохастического моделирования. Эти расчеты учитывают вероятности возбуждения донора, распада донора не-FRET процессами, FRET на данный акцептор и девозбуждение акцептора. Эффективность FRET просто рассчитывается как отношение общего количества передач к общему количеству D-возбуждений.Этот тип моделирования был применен к случаю FRET в плоской геометрии с дисковыми доменами (Кишковски и Кенуорти, 2007).

Все предыдущие работы характеризуются предварительной фиксацией лежащей в основе липидной матрицы, включая размер и форму домена, а моделирование касается исключительно расчета скоростей и вероятностей FRET. Другой подход был недавно предпринят Frazier et al. (2007), которые объединили моделирование статистической механической решетки методом Монте-Карло (для описания липидной матрицы и генерации положений хромофоров в ней) с упрощенной ступенчатой зависимостью FRET от расстояния (FRET считался возникающим тогда и только тогда, когда расстояние D – A в данной паре были менее R ₀) для анализа экспериментальных данных FRET в тройной смеси плот-модель.Эта работа демонстрирует, что FRET и вычислительные методы могут быть объединены, чтобы создать мощную комбинацию, подходящую для изучения разделения липидных фаз.

В глобальном масштабе численное моделирование имеет то преимущество, что позволяет рассчитывать FRET в системах, точное решение которых невозможно из-за их сложности. Однако до сих пор они не предоставляют возможности для прямого анализа экспериментальных данных, поскольку в реальном эксперименте ожидается много степеней свободы. Для каждого моделирования значения для R ₀, время жизни D, расстояние исключения D / A (все они, возможно, различаются в каждой сосуществующей фазе), форма и размер домена, а также коэффициенты разделения D и A должны быть фиксированы.Такое множество переменных исключает возможность подбора простых эмпирических функций, которые могли бы описать, например, изменение эффективности FRET в зависимости от концентрации A в общем виде, что было бы удобно для большинства исследователей. Изучение конкретной системы требует индивидуальной настройки и процедур моделирования.

Альтернативой численному моделированию FRET в наногетерогенных бислоях является использование упрощенных аналитических методов, которые, в отличие от первого, потенциально могут быть использованы для прямого анализа экспериментальных данных, позволяющих восстановить интересующие параметры.Однако этот вид формализмов характеризовался либо жесткими упрощающими приближениями (Gutierrez-Merino, 1981; Brown et al., 2007a, b), либо в некоторой степени полагающимися на численные результаты (Towles et al., 2007; см. Loura et al. ., 2010а для подробного обсуждения), что исключает их широкое использование.

Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок

Относительно простым применением FRET в мембранных системах, содержащих пептиды / белки, несущие флуоресцентные остатки (триптофан и тирозин), является определение их поперечного расположения.Триптофан и тирозин действуют как доноры передачи энергии, поскольку они поглощают на коротких длинах волн, поэтому следует использовать подходящие акцепторы с известным положением в мембране (см. Таблицу 1). Поскольку эффективность передачи зависит от расстояния исключения D – A, значение R _e (и, следовательно, поперечное расположение) может быть получено путем подгонки уравнений 1 и 4 к экспериментальным данным. Доступен ряд стеариновых кислот, дериватизированных антроилхромофором, которые подробно описаны в литературе (см. E.г., Blatt et al., 1984). Поскольку существует почти неизменность спектров поглощения различных акцепторов, радиус Фёрстера постоянен для всех из них, а для триптофана как D он близок к R ₀ = 25 Å. Можно показать, что, когда R _e> приблизительно 1,7 R ₀, получается зависимость типа Штерна-Фольмера (Shaklai et al., 1977; Dewey and Hammes, 1980), выраженная очень простое уравнение

, где I _DA и I _D обозначают интенсивность стационарного излучения D в присутствии и отсутствии A, соответственно.Принимая во внимание, что уравнения 4 и 7 предполагают осевое распределение хромофоров A вокруг остатка D, Yguerabide (1994) обобщил теорию, включив в нее случай, когда D не находится на оси симметрии меченого белка, и распространил ее применимость на случаи, когда R _e < R ₀, что неизбежно с некоторой дополнительной сложностью.

Белки, включенные в модельные мембраны, содержащие липиды с разными электростатическими свойствами или гидрофобной длиной, могут проявлять селективность к одному липидному компоненту на границе раздела белок-липид, что традиционно рассматривалось с помощью спектроскопии электронного спинового резонанса (Marsh and Horváth, 1998).Однако практически идентичную информацию можно получить с помощью FRET. Качественную информацию легко получить, сравнивая степень FRET от белка к флуоресцентно меченным липидам различных классов / ацильных цепей, как упомянуто выше. Было предложено несколько количественных моделей, которые недавно подверглись критическому анализу (Loura et al., 2010b). В таблице 1 перечислены применения этих формализмов к экспериментальным данным FRET.

Характеристика белок-белкового взаимодействия с использованием FRET с участием двух различных меченых производных белков или пептидов была описана более 30 лет назад.В уже исторической статье, используя простой формализм, в котором не учитывается межмолекулярный FRET, но учитываются различные схемы олигомеризации (димеры / тримеры / тетрамеры), Вич и Страйер (1977) подтвердили, что гипотеза образования димеров грамицидина (D: дансил-грамицидин) C; A: 4- (диэтиламино) -фенилазобензол-4-сульфонилхлоридное производное грамицидина C) привело к лучшему соответствию модели, чем сценарии образования как тримеров, так и тетрамеров. Агрегация белков мембраны хромаффинных гранул, меченных малеимид-йодоаминонафтилсульфонатом (D) и флуоресцеин-ацетатом ртути или флуоресцеин-5-малеимидом (A), была качественно подтверждена Morris et al.(1982) при добавлении иона кальция. После этих ранних исследований FRET стал важным инструментом для характеристики агрегации белков / пептидов. Необходимо тщательно выбирать формализм, который будет использоваться для анализа данных, поскольку ранние модели фокусируются на внутриагрегатном переносе энергии, игнорируя межмолекулярный FRET «стороннего наблюдателя» (например, Adair and Engelman, 1994; Li et al., 1999). Это приближение обычно справедливо только в пределе очень разбавленного меченого белка и обычно используется в недавних работах по применению FRET или биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET, см.g., James et al., 2006) к исследованию олигомеризации мембранных белков, перечисленных в таблице 1. Другие методы лечения стремятся вычислить чистый внутриагрегированный член (см. Raicu, 2007 для недавнего примера). Следует отметить, что сочетание внутриагрегатных и межмолекулярных терминов следует проводить осторожно. В частности, неточно вычитать чистую межмолекулярную эффективность из комбинированной межагрегатной и межмолекулярной FRET (You et al., 2005). Если популяция доноров подвергается тушению двумя разными типами акцепторов (например,g., связанных и несвязанных с данным донором), правильный способ вычисления эффективности FRET состоит в умножении членов FRET, соответствующих всем вкладам в тушение, для получения i _DA ( t ) и интегрирования в конец (уравнение 1). Это подтверждается недавним исследованием, в котором сделан вывод, что N-концевой домен N-BAR образует антипараллельные димеры в 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3- [фосфорац- (1-глицерин)] (POPG) везикулы (Fernandes et al., 2008).

FRET с улучшенной диффузией

В предыдущих разделах предполагалось, что поступательная диффузия как D, так и A была незначительной в течение времени существования возбужденного состояния D, то есть при условии D _DA τ ₀/ s ² ≪ 1 (где D _DA — это сумма коэффициентов боковой диффузии D и A, а s — среднее расстояние D – A).В противном случае быстрая диффузия хромофора приводит к увеличению скорости FRET, что может быть интуитивно понятно, если учесть, что пара D / A, изначально разделенная большим расстоянием, которое препятствовало бы FRET, может стать достаточно близкой для возникновения FRET с высоким вероятность в течение жизни возбужденного состояния D как следствие диффузии.

Общая теория усиленного диффузией FRET была создана Стейнбергом и Катчальски (1968) и экспериментально подтверждена Томасом и др.(1978). Особый интерес представляет так называемый предел быстрой диффузии, характеризуемый величиной D _DA τ ₀/ s ² ≪ 1, что приводит к чрезвычайно упрощенным уравнениям для скорости FRET. Это условие требует времени жизни D в диапазоне от микросекунд до миллисекунды, что обычно достижимо с использованием подходящих хелатов лантаноидов в качестве D-частиц. Для равномерного двумерного распределения незаряженных сферических хромофоров можно показать, что получается экспоненциальный D-распад со временем жизни

где

Последнее уравнение (которое, что довольно любопытно, формально идентично уравнению7, который представляет собой приблизительное решение совсем другой проблемы) показывает, что скорость FRET в этом режиме сильно зависит от R _e. Это причина того, почему предел быстрой диффузии FRET нашел применение в измерении расстояния ближайшего подхода D – A (где тип A обычно является белком) в 1980-х годах (см. Примеры в таблице 1). Кроме того, усиленная FRET диффузия заряженных частиц D / A чувствительна к электростатическому потенциалу и поэтому может использоваться для определения мембранных потенциалов (Meltzer et al., 2006). Удивительно, но недавних применений в мембранах было очень мало, что привело к оживленному комментарию: «С середины 1980-х годов метод [FRET, усиленный диффузией], кажется, бездействовал, ожидая подходящей возможности вернуться к жизни» (Fairclough, 2006 г.).

Homo-FRET против Hetero-FRET

В предыдущих разделах предполагалось, что хромофоры D и A различны (гетеро-FRET). Это подразумевало необратимость процесса переноса, который можно было контролировать, измеряя либо степень тушения D, либо сенсибилизированную флуоресценцию A.Напротив, FRET между идентичными флуорофорами (гомо-FRET) не приводит к снижению интенсивности или времени жизни донора флуоресценции, поскольку популяция возбужденного состояния донора не уменьшается во время акта переноса. На практике единственной наблюдаемой, которая отражает это явление, является анизотропия флуоресценции (Lakowicz, 2006), которая уменьшается в результате гомотрансфера. Для измерения анизотропии флуоресценции требуются поляризаторы, и, поскольку они приводят к значительному снижению детектируемого излучения, часто требуется большее количество флуорофора (по сравнению с тем, которое использовалось бы при измерении интенсивности) для заданной точности.Если прибор не является проблемой, уменьшение анизотропии совершенно очевидно: если две молекулы разделены расстоянием R = R ₀, измеренная анизотропия будет только ~ 2/3 от анизотропии мономера, что является значительным уменьшением.

Несмотря на очевидное преимущество, заключающееся в том, что требуется только один флуорофор, использование гомо-FRET более ограничено, чем гетеро-FRET. Рационализация степени деполяризации из-за гомо-FRET более сложна, чем тушение из-за гетеро-FRET, потому что: (i) существует возможность обратного переноса на непосредственно возбужденный донор или передачи любому донору, в конечном итоге включает в себя большое количество этапов переноса и (ii) из-за анизотропии флуоресценции, соответствующей наблюдаемой, в дополнение к RET, другим источником деполяризации является вращение флуорофора.Если вращение и RET происходят в одном и том же масштабе времени, эти два явления взаимосвязаны, что представляет собой главное препятствие для количественного анализа данных гомотрансфера. К теоретическим описаниям, которые не учитывают эти особенности должным образом (например, Yeow and Clayton, 2007), следует относиться с осторожностью. Несмотря на эту сложность, гомо-FRET по-прежнему регулярно используется в исследованиях мембран, в последнее время в сочетании с флуоресцентной микроскопией (см. Раздел ниже и таблицу 1; Bader et al., 2011) для обнаружения и характеристики хромофора (например,g., меченый белок) удержание или агрегация. В этой связи следует отметить, что использование объективов с высокой числовой апертурой приводит к уменьшению наблюдаемой анизотропии (Axelrod, 1979). Этот артефакт можно свести к минимуму, используя более низкую числовую апертуру (≤0,8), с потерей разрешения и чувствительности, или скорректировать, например, с помощью стандартной молекулы (Tramier and Coppey-Moisan, 2008).

FRET под микроскопом

Последние разработки в области формирования изображений с многоволновым и поляризационным разрешением привели к широкому использованию изображений FRET в исследованиях функциональных узлов в клеточных мембранах.Экспериментальные методы визуализации микродоменов мембран и количественной оценки эффективности FRET в микроскопии FRET с акцентом на новые стратегии были рассмотрены в других работах (Rao and Mayor, 2005; Jares-Erijman and Jovin, 2006; Owen et al., 2007; Padilla-Parra et al. ., 2008). Было разработано несколько подходов для исследования в наноразмерном диапазоне специфических взаимодействий белок-белок, липид-липид или липид-белок в живых клетках, как с использованием гомо-, так и гетеро-FRET.

Клеточные мембраны характеризуются большим количеством липидных и белковых компонентов в неравновесном состоянии.Одним из распространенных упрощений является предположение о двух типах доменов, например, плотный / неплотный или упорядоченный / неупорядоченный. Затем результаты можно сравнить, например, с сосуществованием ld / lo на фазовой диаграмме липидов в тройной модельной системе. Из-за внутренних ограничений, таких как стабильность клеток, и поскольку обычно в клетках проводятся микроскопические исследования (чтобы контролировать состояние клеток, знать локализацию флуорофора и использовать сигнал, поступающий только от интересующей мембраны) интенсивность флуоресценции спадает с большое количество фотонов и низкий фоновый сигнал (необходимые для приложений большинства описанных выше формализмов), как правило, недопустимы.Обычно получают стационарные данные и сравнивают с интегрированным формализмом FRET. Даже когда визуализирующая микроскопия времени жизни флуоресценции (FLIM; см. Stöckl and Herrmann, 2010 для обзора ее приложений к неоднородности мембран) получены данные о времени жизни (FRET – FLIM), часто получается относительно небольшое число отсчетов, что означает, что затухание традиционно используется для расчета эффективности FRET по формуле. 1, а не непосредственно анализировать с помощью лежащей в основе кинетической модели FRET. Однако с инструментальными улучшениями, а также с развитием новых подходов к анализу (Grecco et al., 2009) эта тенденция меняется на противоположную. Избранные работы, сочетающие FRET и микроскопию, перечислены в таблице 1, в которой кратко описаны иллюстративные литературные отчеты, в которых FRET использовался (по крайней мере) в одном из описанных выше приложений.

Заключение

В этом обзоре описаны применения FRET в биофизике мембран, включая исследования картирования мембранных белков, латеральной гетерогенности (мембранные домены), определения поперечного расположения (глубины) флуоресцентных остатков / меток внутри мембраны, селективности белков / липидов ( предпочтение конкретного липида по отношению к белку) и олигомеризация мембранного белка.

Была рассмотрена сложность FRET в мембранах, представлена оценка гетеро и гомо-FRET, и подробная топологическая информация может быть получена с помощью этой методологии, если адекватное моделирование будет принято во внимание. Критически рассмотрены примеры соответствующих работ в этой области, и упомянуты недавние применения FRET под микроскопом, а именно на основе данных с временным разрешением (FRET – FLIM). В целом подчеркивается мощь FRET как инструмента мембранной биофизики.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы признают финансирование FEDER через программу COMPETE и FCT, ссылки на проекты FCOMP-01-0124-FEDER-010787 (FCT PTDC / QUI-QUI / 098198/2008), PTDC / QUI-BIQ / 099947/2008 и PTDC / QUI-BIQ / 112067/2009.

Список литературы

Acasandrei, M.A., Dale, R.E., VandeVen, M., and Ameloot, M. (2006). Двумерный резонансный перенос энергии Ферстера (2D FRET) и гипотеза мембранного плота. Chem. Phys. Lett. 419, 469–473.

CrossRef Полный текст

Аниковский, М., Дейл, Л., Фергюсон, С., Петерсен, Н. (2008). Резонансный перенос энергии в клетках: новый взгляд на эффект фиксации и агрегации рецепторов на клеточной мембране. Biophys. J. 95, 1349–1359.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Антоллини, С. С., и Баррантес, Ф. Дж. (1998). Выявление дискретных сайтов для фосфолипидов и стеринов на границе раздела белок-липид в мембране, богатой нативными рецепторами ацетилхолина. Биохимия 37, 16653–16662.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Бадер, А.Н., Хетцл, С., Хофман, Э.Г., Воортман, Дж., Ван Берген и Хенегувен, П. М. П., ван Меер, Г., и Герритсен, Х. К. (2011). Визуализация Homo-FRET как инструмент для количественной оценки кластеризации белков и липидов. Chemphyschem 12, 475–483.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Blatt, E., Chatelier, R.C., and Sawyer, W.H. (1984). Поперечное расположение флуорофоров в липидных бислоях и мицеллах, определяемое методами флуоресценции. Photochem. Photobiol. 39, 477–483.

CrossRef Полный текст

Браун А.С., Тоулз К.Б. и Ренн С.П. (2007a). Измерение размера плота в зависимости от состава мембраны в системах на базе ПК: часть I — бинарные системы. Langmuir 23, 11180–11187.

CrossRef Полный текст

Браун, А. К., Тоулз, К. Б., и Ренн, С. П. (2007b). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на базе ПК: часть II — тройные системы. Langmuir 23, 11188–11196.

CrossRef Полный текст

Бубольц, Дж. Т., Бваля, К., Уильямс, К., и Шутцер, М. (2007). Картирование с высоким разрешением фазового поведения в тройной липидной смеси: зависят ли фазовые границы липид-рафт от процедуры подготовки образца? Langmuir 23, 11968–11971.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Capeta, R.C., Poveda, J. A., and Loura, L.М. С. (2006). Неравномерное распределение мембранных зондов при резонансном переносе энергии: приложение к белково-липидной селективности. J. Fluoresc. 16, 161–172.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ча А., Снайдер Г. Э., Селвин П. Р. и Безанилла Ф. (1999). Движение в атомном масштабе области измерения напряжения в калиевом канале, измеренное с помощью спектроскопии. Природа 402, 809–813.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Роговица, R.Л., Ниту, Ф., Грубер, С., Колер, К., Зацер, М., Томас, Д. Д., и Фруен, Б. Р. (2009). Картирование на основе FRET кальмодулина, связанного с каналом высвобождения RyR1 Ca2 ⁺. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106, 6128–6133.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Роговица, Р. Л., Ниту, Ф., Самсо, М., Томас, Д. Д., и Фруен, Б. Р. (2010). Картирование субъединицы белка, связывающего FK506 рецептора рианодина, с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Biol. Chem. 285, 19219–19226.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Коутиньо, А., Лора, Л.М.С., Федоров, А., Прието, М. (2008). Выявлена защемленная многослойная структура агрегатов лизоцимных и фосфатидилсеринсодержащих мембран методом FRET. Biophys. J. 95, 4726–4736.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

де Алмейда, Р. Ф. М., Лора, Л.М. С., Федоров А., Прието М. (2005). Липидные рафты имеют разные размеры в зависимости от состава мембраны: исследование резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением. J. Mol. Биол. 346, 1109–1120.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Доманов Ю.А., Молотковский Ю.Г., Горбенко Г.П. (2005). Зависимые от покрытия изменения поперечного расположения цитохрома с в фосфолипидных мембранах, выявленные FRET. Biochim.Биофиз. Acta 1716, 49–58.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Чичон, Ф. Дж., Карраскоса, Дж. Л., Федоров А. и Прието, М. (2008). Роль спирали 0 домена N-BAR в формировании кривизны мембраны. Biophys. J. 94, 3065–3073.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес Ф., Лора Л.М.С., Федоров А. и Прието М.(2006). Отсутствие кластеризации фосфатидилинозитол- (4,5) -бисфосфата в жидком фосфатидилхолине. J. Lipid Res. 47, 1521–1525.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Кохорст, Р., Спруайт, Р. Б., Хемминга, М. А., Федоров, А., Прието, М. (2004). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET: приложение к основному белку оболочки M13. Biophys. J. 87, 344–352.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Прието, М., Кохорст, Р., Спруайт, Р. Б., и Хемминга, М. А. (2003). Зависимость олигомеризации и латеральной сегрегации основного белка оболочки М13 от состава бислоя. Biophys. J. 85, 2430–2441.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Förster, T. (1949). Experimentelle und Theoretische Untersuchung des Zwischenmolekularen übergangs von Elektrinenanregungsenergie. Z. Naturforsch. 4а, 321–327.

Фрейзер, М. Л., Райт, Дж. Р., Покорный, А., и Алмейда, П. Ф. Ф. (2007). Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин / холестерин / POPC с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии и моделирования Монте-Карло. Biophys. J. 92, 2422–2433.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фунг, Дж. Дж., Деупи, X., Пардо, Л., Яо, X. Дж., Велес-Руис, Г. А., Деври, Б. Т., Сунахара, Р. К., и Кобилка, Б.К. (2009). Лиганд-регулируемая олигомеризация бета (2) -адренорецепторов в модельном липидном бислое. EMBO J. 28, 3315–3328.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гамбхир А., Хангьяс-Михалине Г., Зайцева И., Кафисо Д. С., Ван Дж., Мюррей Д., Пентяла С. Н., Смит С. О. и Маклафлин С. (2004). Электростатическая секвестрация PIP2 на фосфолипидных мембранах основными / ароматическими областями белков. Biophys. J. 86, 2188–2207.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Госвами, Д., Гоуришанкар, К., Билграми, С., Гош, С., Рагхупати, Р., Чадда, Р., Вишвакарма, Р., Рао, М., и мэр, С. (2008). Нанокластеры GPI-заякоренных белков формируются кортикальной активностью, управляемой актином. Cell 135, 1085–1097.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гутиеррес-Мерино, К. (1981). Количественное определение переноса энергии Ферстера для двумерных систем.I. Боковое разделение фаз в однослойных везикулах, образованных бинарными смесями фосфолипидов. Biophys. Chem. 14, 247–257.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гутьеррес-Мерино, К., Мунконге, Ф., Мата, А. М., Ист, Дж. М., Левинсон, Б. Л., Напье, Р. М., и Ли, А. Г. (1987). Положение сайта связывания АТФ на (Ca ²⁺ + Mg ²⁺) -АТФазе. Biochim. Биофиз. Acta 897, 207–216.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Хардинг П.J., Attrill, H., Boehringer, J., Ross, S., Wadhams, G.H., Smith, E., Armitage, J.P., and Watts, A. (2009). Конститутивная димеризация рецептора, сопряженного с G-белком, рецептора нейротензина 1, воссозданного в фосфолипидные бислои. Biophys. J. 96, 964–973.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Харикумар, К. Г., Хаппс, Р. М., и Миллер, Л. Дж. (2008). Димеризация в отсутствие олигомеризации высшего порядка рецептора секретина, связанного с G-белком. Biochim. Биофиз. Acta 1778, 2555–2563.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Heberle, F. A., Wu, J., Goh, S. L., Petruzielo, R. S., and Feigenson, G. W. (2010). Сравнение трех смесей тройных липидных бислоев: FRET и ESR выявляют нанодомены. Biophys. J. 99, 3309–3318.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Херрерос, Дж., Нг, Т., и Скьяво, Г.(2001). Липидные рафты действуют как специализированные домены для связывания столбнячного токсина и интернализации в нейроны. Мол. Биол. Cell 12, 2947–2960.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

Хофман, Э. Г., Руонала, М. О., Бадер, А. Н., ван ден Хеувель, Д., Воортман, Дж., Руверс, Р. К., Верклей, А. Дж., Герритсен, Х. К., и ван Берген ан Хенегувен, П. М. П. (2008). EGF вызывает слияние различных липидных рафтов. J. Cell. Sci. 121, 2519–2528.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Джеймс, Дж. Р., Оливейра, М. И., Кармо, А. М., Ябони, А., и Дэвис, С. Дж. (2006). Строгая экспериментальная основа для обнаружения олигомеризации белков с использованием биолюминесцентного резонансного переноса энергии. Nat. Методы 3, 1001–1006.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Джонсон, Д. А., и Нусс, Дж. М. (1994). Чувствительный к гистрионикотоксину сайт связывания этидия расположен за пределами трансмембранного домена никотинового ацетилхолинового рецептора: исследование флуоресценции. Биохимия 33, 9070–9077.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кенуорти, А. К., и Эдидин, М. (1998). Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK, исследованных с разрешением <100 Å с использованием визуализации переноса энергии резонанса флуоресценции. J. Cell Biol. 142, 69–84.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кусба, Ю., Ли, Л., Грычинский, И., Пищек, Г., Джонсон, М., и Лакович, Дж. Р. (2002). Коэффициенты боковой диффузии в мембранах, измеренные с помощью резонансной передачи энергии и нового алгоритма диффузии в двух измерениях. Biophys. J. 82, 1358–1372.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лакович, Дж. Р. (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии , 3-е изд. Нью-Йорк: Спрингер.

Ледер, Р.О., Хелгерсон, С. Л., и Томас, Д. Д. (1989). Поперечное расположение хромофора сетчатки в пурпурной мембране за счет передачи энергии, усиленной диффузией. J. Mol. Биол. 209, 683–701.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Кастелло П. Р. и Флеча Ф. Л. Г. (2003). Количественный анализ мембранных белок-амфифильных взаимодействий с использованием резонансной передачи энергии. Анал. Biochem. 317, 171–179.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Эшарт М. М., Кастелло П. Р. и Флеша Ф. Л. Г. (2000). Термическая стабильность кальциевого насоса плазматической мембраны. Количественный анализ его зависимости от липид-белковых взаимодействий. J. Membr. Биол. 173, 215–225.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ли, М., Редди, Л. Г., Беннет, Р., Сильва, Н.Д. мл., Джонс, Л. Р., и Томас, Д. Д. (1999). Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану. Biophys. J. 76, 2587–2599.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Коутиньо, А., Сильва, А., Федоров, А., Прието, М. (2006). Структурные эффекты основного пептида на организацию мембран дипальмитоилфосфатидилхолин / дипальмитоилфосфатидилсерин: исследование флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys. Chem. B 110, 8130–8141.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л. М. С., Федоров, А., Прието, М. (1996). Резонансный перенос энергии в модельной системе мембран: приложение к гелевой и жидкокристаллической фазам. Biophys. J. 71, 1823–1836.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л. М. С., Федоров, А., Прието, М. (2000a).Разделение мембранных зондов в двухкомпонентной липидной системе гель / жидкость: исследование флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biochim. Биофиз. Acta 1467, 101–112.

CrossRef Полный текст

Лора, Л. М. С., Федоров, А., Прието, М. (2000b). Неоднородность распределения мембранного зонда: исследование резонансной передачи энергии. J. Phys. Chem. B 104, 6920–6931.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Фернандес, Ф., и Прието, М. (2010a). Микрогетерогенность мембраны: резонансная характеристика переноса энергии Фёрстера латеральных мембранных доменов. Eur. Биофиз. J. 39, 589–607.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Прието, М., и Фернандес, Ф. (2010b). Количественная оценка белково-липидной селективности с помощью FRET. Eur. Биофиз. J. 39, 565–578.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., и Прието, М. (2000). Резонансный перенос энергии в гетерогенных плоских и двухслойных системах: теория и моделирование. J. Phys. Chem. B 104, 6911–6919.

CrossRef Полный текст

Марш Д. и Хорват Л. И. (1998). Структура, динамика и состав липид-белковой границы. Перспективы спин-этикетирования. Biochim. Биофиз. Acta 1376, 267–296.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

Мельцер, Р. Х., Лурц, М. М., Венсель, Т. Г., и Педерсен, С. Е. (2006). Электростатика никотинового ацетилхолинового рецепторного канала определяется усиленной диффузией передачей энергии люминесценции. Biophys. J. 91, 1315–1324.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Мерсье, Дж. Ф., Салахпур, А., Анже, С., Брейт, А., и Бувье, М. (2002). Количественная оценка гомо- и гетеродимеризации бета-1- и бета-2-адренорецепторов по биолюминесцентному резонансному переносу энергии. J. Biol. Chem. 277, 44925–44931.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Мейер, Б.Х., Сегура, Ж.-М., Мартинес, К. Л., Ховиус, Р., Джордж, Н., Джонссон, К., и Фогель, Х. (2006). Визуализация FRET показывает, что функциональные рецепторы нейрокинина-1 являются мономерными и находятся в микродоменах мембран живых клеток. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 2138–2143.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Моррис, С. Дж., Судхоф, Т. К., и Хейнс, Д. Х. (1982). Резонансный перенос энергии, стимулируемый кальцием, между флуоресцентно меченными белками во время агрегации мембран хромаффинных гранул. Biochim. Биофиз. Acta 693, 425–436.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нараянасвами В. и МакНэми М. Г. (1993). Белок-липидные взаимодействия и функция никотинового ацетилхолинового рецептора Torpedo californica . 2. Текучесть мембраны и лиганд-опосредованное изменение доступности остатков цистеина гамма-субъединицы для холестерина. Биохимия 32, 12420–12427.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нельсон, Л.Д., Чейнтия, С., Лондон, Э. (2010). Ассоциация перфринголизина O с упорядоченными липидными доменами: влияние на сродство трансмембранного белка к рафту. Biophys. J. 99, 3255–3263.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Номикос М., Малгрю-Несбитт А., Паллави П., Михалин Г., Зайцева И., Суонн К., Лай Ф.А., Мюррей Д. и Маклафлин С. (2007) . Связывание фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C-ξ (PLC-ξ) с фосфолипидными мембранами. J. Biol. Chem. 282, 16644–16653.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Падилья-Парра, С., Одуж, Н., Коппи-Мойзан, М., и Трамье, М. (2008). Количественный FRET-анализ с помощью быстрого сбора данных FLIM во временной области с высоким пространственным разрешением в живых клетках. Biophys. J. 95, 2976–2988.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Пап, Э. Х. У., Бастианс, П.И. Х., Борст, Дж. У., ван ден Берг, П. А. У., ван Хук, А., Снук, Г. Т., Вирц, К. В. А. и Виссер, А. Дж. У. Г. (1993). Количественное определение взаимодействия протеинкиназы C с диацилглицерином и фосфоинозитидами с помощью детектирования резонансной передачи энергии с временным разрешением. Биохимия 32, 13310–13317.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Picas, L., Suárez-Germà, C., Montero, M. T., Vázquez-Ibar, J. L., Hernández-Borrell, J., Прието, М., и Лора, Л.М.С. (2010). Селективность липидов лактозопермеазы с использованием резонансного переноса энергии Ферстера. Biochim. Биофиз. Acta 1798, 1707–1713.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Поведа, Дж. А., Энсинар, Дж. А., Фернандес, А. М., Матео, К. Р., Феррагут, Дж. А., и Гонсалес-Рос, Дж. М. (2002). Сегрегация доменов, богатых фосфатидной кислотой, в восстановленных мембранах рецепторов ацетилхолина. Биохимия 41, 12253–12262.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Шарма П., Варма Р., Сарасидж Р. К., Ира, Гуссет К., Кришнамурти Г., Рао М. и мэр С. (2004). Наноразмерная организация множественных GPI-заякоренных белков в мембранах живых клеток. Cell 116, 577–589.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Сильвиус, Дж. Р. (2003). Передача энергии флуоресценции выявляет образование микродоменов при физиологических температурах в липидных смесях, моделирующих внешний листок плазматической мембраны. Biophys. J. 85, 1034–1045.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Steinberg, I.Z., и Katchalski, E. (1968). Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательном переносе энергии. J. Chem. Phys. 48, 2404–2410.

CrossRef Полный текст

Страйер, Л. (1978). Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Annu. Rev. Biochem. 47, 829–846.

CrossRef Полный текст

Валенсуэла, К. Ф., Вайн, П., Игерабид, Дж., И Джонсон, Д. А. (1994). Поперечное расстояние между мембраной и сайтами связывания агонистов на рецепторе ацетилхолина Torpedo: исследование флуоресценции. Biophys. J. 66, 674–682.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

ван ден Богаарт, Г., Холт, М.Г., Бунт, Г., Ридель, Д., Воутерс, Ф. С., и Ян, Р. (2010). Для слияния мембран достаточно одного комплекса SNARE. Nat. Struct. Мол. Биол. 17, 358–364.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Van Der Meer, B. W., Coker, G. III, and Chen, S.-Y. С. (1994). Резонансный перенос энергии: теория и данные . Нью-Йорк: ВЧ.

Витч В. и Страйер Л. (1977). Димерная природа трансмембранного канала грамицидина А: исследования проводимости и передачи энергии флуоресценции гибридных каналов. J. Mol. Биол. 113, 89–102.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фон Арним, CAF, Kinoshita, A., Peltan, ID, Tangredi, MM, Herl, L., Lee, BM, Spoelgen, R., Hshieh, TT, Ranganathan, S., Battey, FD, Liu, CX, Бакскай, Б.Дж., Север, С., Иризарри, М.К., Стрикленд, Д.К., и Хайман, Б.Т. (2005). Белок, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP), представляет собой новый субстрат бета-секретазы (BACE1). Дж.Биол. Chem. 280, 17777–17785.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Егнесваран, С., Вуд, Г. М., Эсмон, К. Т., и Джонсон, А. Э. (1997). Белок S изменяет расположение активного центра активированного протеина C над поверхностью мембраны. Исследование топографии с флуоресцентным резонансным переносом энергии. J. Biol. Chem. 272, 25013–25021.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Йеу, Э.К. Л. и Клейтон А. Х. А. (2007). Подсчет состояний олигомеризации мембранных белков в живых клетках методами гомо-FRET-спектроскопии и микроскопии: теория и применение. Biophys. J. 92, 3098–3104.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ю, М., Ли, Э., Вимли, В. К., и Христова, К. (2005). Фёрстеровский резонансный перенос энергии в липосомах: измерения димеризации трансмембранной спирали в естественной двухслойной среде. Анал. Biochem. 340, 154–164.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Наблюдается аномальная передача избыточной энергии с помощью нескольких приемников FRET

Абстрактные

Фон

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это механизм, при котором энергия передается от возбужденного донорного флуорофора соседним хромофорам через безызлучательные диполь-дипольные взаимодействия. Теория FRET в первую очередь рассматривает взаимодействия одной пары донор-акцептор.К сожалению, редко известно, присутствует ли в молекулярном комплексе только один акцептор. Таким образом, использование FRET в качестве инструмента для измерения белок-белковых взаимодействий внутри живых клеток требует понимания того, как FRET изменяется с множеством акцепторов. Когда присутствует несколько акцепторов FRET, предполагается, что квант энергии либо высвобождается от донора, либо передается в сумме только одному из присутствующих акцепторов. Скорость передачи энергии между донором и конкретным акцептором ( k _{D → A} ) можно измерить в отсутствие других акцепторов, и эти отдельные скорости передачи FRET можно использовать для прогнозирования эффективности FRET ансамбля с помощью простого кинетическая модель, в которой сумма всех скоростей переноса FRET делится на сумму всех скоростей переноса излучения и без излучения.

Методология / основные выводы

Общность этого подхода была проверена путем измерения эффективности ансамбля FRET в двух конструкциях, каждая из которых содержит один донор флуоресцентного белка (Cerulean) и два или три акцептора FRET (Venus). Скорости передачи FRET между отдельными парами донор-акцептор в этих конструкциях были рассчитаны на основе эффективности FRET, измеренной после систематического введения точечных мутаций для устранения всех других акцепторов. Мы обнаружили, что количество передачи энергии, наблюдаемое в конструкциях, имеющих несколько акцепторов, значительно больше, чем эффективность FRET, предсказанная из суммы скоростей передачи от отдельного донора к акцептору.

Выводы / Значение

Мы пришли к выводу, что либо существует дополнительный путь передачи энергии, когда присутствует несколько акцепторов, либо теоретическое предположение, на котором основывается прогноз кинетической модели, неверно.

Образец цитирования: Кушик С.В., Бланк П.С., Фогель С.С. (2009) Аномальный перенос избыточной энергии, наблюдаемый с помощью нескольких приемников FRET. PLoS ONE 4 (11): e8031. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031

Редактор: Владимир Брезина, Медицинская школа Маунт Синай, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 1 октября 2009 г .; Принята к печати: 2 ноября 2009 г .; Опубликовано: , 25 ноября 2009 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями декларации Creative Commons Public Domain, которая предусматривает, что после размещения в общественном достоянии эта работа может свободно воспроизводиться, распространяться, передаваться, модифицированы, созданы на основе или иным образом использованы кем-либо в любых законных целях.

Финансирование: Это исследование было поддержано внутренней исследовательской программой NIH, NIAAA. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это механизм ближнего поля, с помощью которого энергия передается от донорного флуорофора на соседний хромофор посредством безызлучательных диполь-дипольных взаимодействий [1], [2], [3], [4] ], [5], [6].Теория FRET применима только к флуорофорам, которые имеют очень слабую связь [7], и в первую очередь рассматривает взаимодействия одной пары донор-акцептор, когда они разделены расстоянием 1–10 нм [5], [6], но могут быть расширены. чтобы охватить ситуацию, когда присутствует более одного акцептора, если предположить, что донор взаимодействует с каждым акцептором независимо . Несмотря на то, что независимость параллельно действующих путей дезактивации флуоресценции является одним из краеугольных камней, на которых построена спектроскопия [5], справедливость этого предположения в применении к передаче энергии в ближнем поле не проверялась напрямую.Очевидно, что использование FRET в качестве всеобъемлющего инструмента для измерения белок-белковых взаимодействий требует понимания того, как значения FRET меняются, когда присутствует более одного акцептора [6], [8].

Эффективность FRET донорно-акцепторной пары определяется как доля энергии фотонов, поглощенная флуоресцентной молекулой, которая передается акцептору [ 4 ] , [ 5 ] , [ 6 ]. Если k _{D → A} — это скорость передачи энергии от донора к акцептору в присутствии одного акцептора, а τ _D — время жизни флуоресценции донорного флуорофора в отсутствие акцепторов, тогда E, эффективность FRET равна [4], [6]:

Этот кинетический формализм был изменен для расчета эффективности FRET между донором и множественными акцепторами.Например, эффективность FRET при наличии двух акцепторов считается равной [4], [6] 🙁 1)

Эта модель позволяет передавать энергию от донора дискретно к двум акцепторам, а предполагает , что каждый ведет себя независимо в параллельных путях деактивации. Общая форма уравнения 1 при наличии акцепторов и : (2)

Результаты

Чтобы проверить универсальность кинетической модели FRET с несколькими акцепторами, мы разработали набор генетических конструкций, состоящих из различных смесей и расположений трех спектральных вариантов зеленого флуоресцентного белка (FP), используя Cerulean [9] (в качестве Донор FRET), Венера [10] (в качестве акцептора) и Amber [11] «подобная Венере» молекула, которая имеет точечную мутацию, предотвращающую образование флуорофора, и предположительно не может действовать как акцептор FRET.Amber-Cerulean-Amber (ACA) был создан для измерения времени жизни флуоресценции Cerulean в отсутствие FRET при присоединении к FP как на его C-, так и на N-конце. Церулеан в ACA имел время жизни 2,95 ± 0,02 нс (среднее ± SEM, n = 5 клеток) при измерении в живых клетках коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (TCSPC) [12] (рис. 1A). На рисунке 1B мы сравниваем спектр излучения Cerulean, Cerulean, прикрепленного к Amber (C5A), и Cerulean, прикрепленного к Венере (C5V), при возбуждении двухфотонным возбуждением 820 нм.Спектр излучения C5A был неотличим от спектра Cerulean, и оба они отличались от спектра излучения C5V, что указывает на то, что Amber не является флуоресцентным. Разрешенное во времени затухание флуоресцентной анизотропии флуоресцентного белка в комплексе чувствительно к массе и форме белка, а также к количеству флуорофоров и скорости миграции энергии в комплексе [13]. Флуоресценцию Венеры возбуждали двухфотонным возбуждением с длиной волны 950 нм и измеряли затухание анизотропии флуоресценции Венеры с временным разрешением для трех структурно связанных конструкций: Янтарь-Янтарь-Венера (AAV), Венера-Церулеан-Венера (VCV) и Венера-Янтарь-Венера. Венера (VAV) (рис.1С). Поскольку конструкция AAV имеет только один флуорофор, его кривая затухания анизотропии будет отражать вращение флуорофора Венеры в этом комплексе в зависимости от массы и формы. Напротив, и VCV, и VAV имеют два флуорофора Венеры, присоединенные либо молекулой Cerulean, либо молекулой Amber. Таким образом, помимо деполяризации, вызванной вращением молекул, эти конструкции должны также иметь компонент быстрого спада анизотропии из-за гомо-FRET. Если структура янтаря и церулеана по существу одинакова, расстояние между двумя флуорофорами Венеры в VCV и VAV также должно быть одинаковым, и, следовательно, передача гомо-FRET между этими флуорофорами должна иметь одинаковую скорость.Кривые затухания анизотропии VCV и VAV были практически идентичны, что согласуется с тем, что Amber имеет такую же структуру складывания β-ствола, что и Cerulean [14]. Более того, компонент медленного распада, наблюдаемый в AAV, был подобен компоненту медленного распада как VCV, так и VAV, что еще раз указывает на то, что Amber имеет подобную складчатую структуру, как Cerulean [14] и Venus [15]. Таким образом, мы заключаем, что Янтарь не поглотитель темноты, не флуоресцентный, но имеет аналогичную трехмерную структуру, как Церулеан и Венера.

Рисунок 1.Время жизни Церулеана в окружении двух молекул янтаря.

A. Время жизни флуоресценции Cerulean в конструкции ACA измеряли коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (КРАСНАЯ кривая представляет собой среднее значение следов, наблюдаемых в 5 различных клетках, экспрессирующих ACA). Флуоресцеин при pH 10 использовался в качестве стандарта на время жизни для проверки точности нашего оборудования, и его спад времени жизни флуоресценции показан на вставке (ЗЕЛЕНЫЙ след, среднее значение трех измерений). Функция отклика прибора нашей системы FLIM также изображена на вставке (ЧЕРНАЯ линия).B. Нормализованный спектр излучения клеток, трансфицированных церулеаном (синяя линия), церулеаном, прикрепленным к янтарному (красный пунктирный график), или церулеаном, прикрепленным к Венере (зеленая пунктирная кривая). Каждая кривая представляет собой среднее значение для 3 ячеек, и все образцы возбуждали двухфотонным возбуждением на длине волны 820 нм. Следы были нормализованы к пику эмиссии Cerulean при 481 нм. C. Разрешенное во времени затухание анизотропии флуоресценции Венеры в клетках, трансфицированных AAV (ЗЕЛЕНЫЕ кружки), VAV (КРАСНЫЕ квадраты) или VCV (СИНИЕ треугольники).Каждая точка представляет собой среднее значение 10 клеток, возбужденных на длине волны 950 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g001

Янтарь-Церулеан-Венера (ACV) и Венера-Церулеан-Янтарь (VCA) — это структурно связанные конструкции, созданные для измерения эффективности FRET (и скорости передачи ) между Церулеанами и С- или N-концевой Венерой (рис. 2). В ACV линкер, разделяющий Cerulean и Venus, состоит из 6 аминокислот, тогда как в VCA только 5. Эффективность FRET составляет 0,36 ± 0,09 (среднее ± SD, n = 26) и 0.44 ± 0,08 (n = 26) соответственно, как определено sRET-анализом [16] спектральных изображений двухфотонного возбуждения [17]. Скорости передачи энергии ACV и VCA были рассчитаны с использованием их эффективности FRET и времени жизни Cerulean в ACA и оказались равными 0,19 ± 0,01 и 0,26 ± 0,02 нс ^-1 (среднее ± стандартная ошибка среднего распространения). VCV, конструкция FRET с 1 донором и 2 акцепторами, имела эффективность переноса 0,64 ± 0,05 (n = 16). Это значение было аналогично эффективности FRET, измеренной для VCV в предыдущем исследовании [16] (0.70 ± 0,06 по sRET, 0,65 ± 0,03 по FLIM-FRET), но было больше и статистически отличалось от значения, предсказанного с использованием скоростей передачи ACV и VCA в уравнении 1 (0,58 ± 0,01, среднее ± стандартная ошибка среднего, p <0,01).

Рис. 2. Прогнозирование эффективности FRET конструкции с двумя акцепторами.

A. Конструкции, используемые для изучения эффектов наличия двух акцепторов в комплексе FRET. Синие «банки» изображают донора Церулеана, желтые — акцепторов Венеры, а серые — янтаря, у которого есть единственная точечная мутация на Венере, которая не позволяет ему образовывать флуорофор.Стрелки, ведущие от Церулеана, обозначают как радиационные, так и неизлучающие пути излучения. Синие стрелки показывают излучение, когда Cerulean испускает фотон. Красные стрелки показывают безызлучательные пути высвобождения энергии возбуждения с участием FRET. B. Таблица, в которой сравниваются FRET-эффективности VCA, ACV и VCV, измеренные с помощью sRET или E-FRET, а также измеренное соотношение акцепторов и доноров (A / D) для каждой конструкции. C. Скорости передачи энергии и их ошибка распространения рассчитывались из измеренного Cerulean времени жизни ACA и эффективности FRET, измеренной с помощью E-FRET отдельных конструкций.Столбец Сумма представляет собой арифметическую сумму скоростей передачи VCA и ACV с распространяемой ошибкой и теоретически должен равняться скорости передачи, измеренной для VCV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g002

Хотя разница между измеренной эффективностью VCV FRET и эффективностью передачи, предсказанной кинетической моделью, была статистически различной, она также была относительно небольшой (6%). . Соответственно, мы хотели подтвердить это наблюдение, используя другой метод FRET, который не полагался ни на двухфотонное, ни на лазерное возбуждение.E-FRET [18], [19], метод измерения эффективности FRET, основанный на десенсибилизации акцептора, был выбран, потому что он использует дуговую лампу в качестве источника однофотонного возбуждения. Дополнительным преимуществом подхода E-FRET является то, что он может точно измерить соотношение акцепторов и доноров [18], [19]. Затем это можно было бы использовать для проверки того, генерируют ли молекулы Cerulean и Venus свои флуорофоры, и присутствуют ли они в стехиометрии, предсказанной последовательностью конкретной конструкции. Анализ E-FRET показал, что ACV имеет эффективность FRET 0.38 ± 0,03 (среднее ± стандартное отклонение, n = 52) и выражали при ожидаемом соотношении акцептора к донору, равному 1 для молекулы с одним акцептором и одним донором (0,95 ± 0,07). VCA имел эффективность FRET 0,45 ± 0,04 (n = 82) и соотношение акцептора к донору 0,96 ± 0,09. Скорости передачи энергии, рассчитанные с использованием этих значений эффективности FRET, составили 0,21 ± 0,00 (обратите внимание, что ошибки 0,00 указывают на усеченную ошибку, которая была ≤0,005.) И 0,27 ± 0,00 нс ^-1 (среднее ± SEM распространения). Анализ E-FRET показал, что соотношение акцепторов и доноров VCV равно 1.96 ± 0,17 (n = 59), как и ожидалось для молекулы с двумя акцепторами и одним донором. Измеренная эффективность FRET для VCV составила 0,69 ± 0,01 (среднее значение ± SEM). Опять таки. это значение было больше, чем значение, предсказанное с помощью уравнения 1 (0,59 ± 0,01, среднее ± стандартная ошибка среднего). Разница между прогнозируемыми и измеренными значениями составляет 0,10 ± 0,02 (разница ± 99% достоверности). Поскольку разница не включает ноль при уровне достоверности 99%, мы отвергаем гипотезу о том, что экспериментально измеренные значения VCV согласуются с прогнозируемыми значениями, полученными на основе индивидуальных значений эффективности FRET.

Чтобы проверить, является ли наблюдаемая передача избыточной энергии уникальной для конструкции VCV с двумя акцепторами или представляет собой более общий случай, когда присутствует несколько акцепторов, был создан набор конструкций для исследования FRET между одним донором и 3 акцепторами (рис. 3). Янтарь-Церулеан-Венера-Янтарь (ACVA) имел эффективность FRET 0,41 ± 0,05 (среднее ± стандартное отклонение, n = 72) и отношение акцептора к донору 0,96 ± 0,10, как измерено с помощью E-FRET. Венера-Церулеан-Янтарь-Янтарь (VCAA) имела эффективность FRET 0.42 ± 0,06 (n = 74) и отношение акцептора к донору 0,98 ± 0,15, а Amber-Cerulean-Amber-Venus (ACAV) имеет эффективность FRET 0,29 ± 0,03 (n = 64) и отношение акцептора к донору, равное 1,15 ± 0,12. Рассчитанные скорости переноса донора на акцептор для этих трех донорно-акцепторных пар составили 0,23 ± 0,00, 0,24 ± 0,01 и 0,14 ± 0,00 нс ^-1 соответственно (среднее ± стандартное отклонение среднего значения) и предсказали эффективность FRET ансамбля 0,65 ± 0,01. (среднее ± стандартная ошибка среднего) для конструкции Венера-Церулеан-Венера-Венера (VCVV). Эффективность FRET, измеренная для VCVV, составляла 0.76 ± 0,01 (среднее ± стандартная ошибка среднего, n = 71), и соотношение акцептора к донору составляло 2,87 ± 0,35 (среднее ± стандартное отклонение), как ожидалось для комплекса с одним донором и тремя акцепторами. Разница между предсказанными и измеренными значениями VCVV составляет 0,11 ± 0,02 (разница ± 99% достоверности). Поскольку разница не включает ноль при уровне достоверности 99%, мы отвергаем гипотезу о том, что экспериментально измеренные значения VCVV согласуются с прогнозируемыми значениями, полученными на основе индивидуальных значений эффективности FRET.

Рисунок 3.Прогнозирование эффективности FRET конструкции с тремя акцепторами.

A. Конструкции, используемые для изучения эффектов наличия трех акцепторов в комплексе FRET. Синие «банки» изображают донора Церулеана, желтые — акцепторов Венеры, а серые — янтаря. B. Таблица, показывающая FRET-эффективности VCAA, ACVA, ACAV и VCVV, измеренные с помощью E-FRET, а также измеренное соотношение акцепторов и доноров (A / D) для каждой конструкции. C. Скорости передачи энергии и их ошибка распространения были рассчитаны из измеренного Cerulean времени жизни ACA и эффективности FRET, измеренной с помощью E-FRET.Столбец Сумма представляет собой арифметическую сумму скоростей передачи VCAA, ACVA и ACAV с распространяемой ошибкой, и теоретически она должна равняться скорости передачи, измеренной для VCVV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g003

Молекулярный FRET внутри — это перенос энергии, который происходит между донором и акцепторами внутри молекулярного комплекса, а межмолекулярный FRET — это перенос энергии. это может происходить между донором в одном комплексе и акцептором в другом в результате молекулярного краудинга.Если межмолекулярный FRET возникает и не учитывается, измеренная эффективность FRET ансамбля может быть переоценкой истинной внутримолекулярной эффективности FRET. Для ковалентно связанных цитоплазматических комплексов, подобных таковым в сериях VCV и VCVV, значительные уровни межмолекулярного FRET должны возникать только в том случае, если эти конструкции экспрессируются в очень высокой концентрации (в диапазоне мМ [8]). Экспериментально межмолекулярный FRET может быть обнаружен как увеличение эффективности FRET с увеличением концентрации акцептора.В случае обнаружения истинная внутримолекулярная эффективность FRET может быть оценена из экстраполированного значения эффективности FRET при бесконечно разбавленных концентрациях акцепторов; Y-пересечение. В экспериментах E-FRET, помимо измерения эффективности FRET и отношения акцептора к донору, также измеряется интенсивность непосредственно возбужденного акцептора Венеры, нормированная на время воздействия. Интенсивность непосредственно возбужденного акцептора должна быть пропорциональна концентрации акцептора. Чтобы проверить и контролировать любой межмолекулярный FRET, измеренные эффективности FRET каждой клетки, которая экспрессировала конструкции либо в серии VCV (фиг. 4A), либо в серии VCVV (фиг. 4B), были нанесены на график в зависимости от концентрации акцептора.Лишь незначительное увеличение эффективности FRET наблюдалось с увеличением интенсивности Венеры в диапазоне 1-2 порядка величины. Тем не менее, каждый набор данных хорошо соответствовал линейной регрессии, и поэтому пересечения по оси Y использовались для оценки экстраполированной эффективности FRET ± 95% доверительный интервал (VCA = 0,45 ± 0,01, ACV = 0,37 ± 0,01, VCV = 0,66 ± 0,02). , VCAA = 0,40 ± 0,02, ACVA = 0,39 ± 0,01, ACAV = 0,27 ± 0,01, VCVV = 0,73 ± 0,02). Эти значения были приняты за внутримолекулярную эффективность FRET без межмолекулярного FRET.Как и ожидалось, экстраполированные эффективности FRET для любой конкретной конструкции были либо статистически неразличимы, либо лишь незначительно снижены по сравнению с эффективностями FRET, измеренными ранее как среднее значение ансамбля. Независимо от этого, используя эти экстраполированные значения эффективности FRET, кинетическая модель предсказывает эффективность VCV FRET 0,58 ± 0,01 и эффективность FRET VCVV 0,63 ± 0,02 (эффективность FRET ± распространенный 95% доверительный уровень). Различия между предсказанием кинетической модели и измеренными значениями VCV составили 0.08 ± 0,03, а для VCVV было 0,10 ± 0,03 (разница ± 99% достоверности). Поскольку эти различия не включают ноль при уровне достоверности 99%, мы отвергаем гипотезу о том, что экспериментально измеренные значения для VCV и VCVV, даже с поправкой на межмолекулярный FRET, согласуются с предсказанными значениями, полученными на основе индивидуальных эффективностей FRET.

Рис. 4. Оценка внутримолекулярной эффективности FRET.

E-FRET использовался для измерения эффективности FRET и интенсивности акцептора (Венера) для каждой клетки, экспрессирующей члены серии VCV (A; VCV, ACV и VCA) или серии VCVV (B; VCVV, ACVA, VCAA). , ACAV), и эти значения нанесены на график как функция интенсивности Венеры, нормализованной по экспозиции.Пунктирными линиями показана аппроксимация линейной регрессии для каждого набора данных для расчета точки пересечения по оси Y как оценки количества внутримолекулярного FRET в отсутствие межмолекулярного FRET. Обратите внимание, что данные построены в полулогарифмическом масштабе, чтобы легче было выявить полный диапазон интенсивности Венеры, но при этом линейные графики выглядят изогнутыми.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g004

Обсуждение

Цель этого исследования заключалась в экспериментальной проверке универсальности использования суммы индивидуальных скоростей передачи FRET от донора до акцептора ( k _{D → A} ) для прогнозирования эффективности ансамбля FRET комплекса донора с множественные акцепторы (уравнение 2).Мы специально хотели провести этот тест с использованием спектральных вариантов GFP в живых клетках, поскольку это общий подход, используемый для изучения межбелковых взаимодействий в физиологических условиях. Этот кинетический формализм постоянно не позволял предсказать измеренную эффективность FRET ансамбля. Это наблюдалось как при однофотонном, так и при двухфотонном возбуждении, при возбуждении как от лазера, так и от дуговых ламп, а также с использованием двух разных методов измерения FRET, одного на основе спектрального изображения [16], а другого на основе акцепторной десенсибилизации [18], [ 19].В чем причина несоответствия между эффективностями ансамбля FRET, измеренными при наличии нескольких акцепторов, по сравнению со значениями, предсказанными теорией? Стоит рассмотреть шесть возможных объяснений: 1. Время жизни флуоресценции Cerulean в отсутствие акцепторов, которое использовалось для наших расчетов, неточно, 2. Янтарь ведет себя аномально, 3. Cerulean и / или Venus имеют разную эффективность сворачивания в разных конструкциях. , 4. Дополнительная передача энергии происходит за счет межмолекулярного FRET, 5.Существует дополнительный скрытый путь передачи энергии от донора, который необходимо учитывать, и 6. Одно из теоретических предположений, на которых основан кинетический формализм, неверно.

Время жизни церулеана в ACA составило 2,95 ± 0,02 нс (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 5 клеток). Этот срок службы был измерен на системе FLIM, которая имела длительность импульса возбуждающего лазера менее 200 фс, и была получена с помощью фотоумножителя с микроканальной пластиной (Hammamatsu R3809U-52), у которой измеренная функция отклика системы составляла <40 пс (FWHM; Инжир.1А). Измерение продолжительности жизни проводили на пяти повторностях клеток, трансфицированных ДНК, кодирующей АСА. Каждая кривая затухания имела минимум 5000 пиковых отсчетов фотонов и была подобрана с использованием модели двойного экспоненциального затухания, деконволюционной из измеренной функции отклика прибора для дополнительной точности. Кроме того, точность нашей системы TCSPC была подтверждена с использованием сертифицированного NIST стандарта флуоресцеина (Invitrogen) при pH 10 и дала значение срока службы 4,08 ± 0,00 (среднее ± стандартное отклонение, n = 3; рис. 1A). Ожидаемое время жизни флуоресценции флуоресцеина при pH 10 составляет 4.1 нс [11]. Наиболее важно то, что время жизни ACA было аналогично ранее измеренному времени жизни Cerulean, когда он экспрессировался отдельно в клетках (2,94 ± 0,11 нс, среднее ± стандартное отклонение) [11], что указывает на то, что время жизни Cerulean не изменилось заметно, когда молекулы Amber были добавлены к обеим его молекулам. C- и N-концы. Таким образом, очень маловероятно, что измеренное время жизни ACA отклонялось более чем на 100 пс, а фактическая стандартная ошибка времени жизни Cerulean для среднего значения ACA составляла 20 пс. Более того, можно показать, что время жизни донора в отсутствие акцепторов не требуется для прогнозирования эффективности ансамбля FRET; он может быть рассчитан с использованием только эффективности FRET для эффективности переноса отдельных доноров-акцепторов (см. Материалы и методы Прогнозы кинетической модели и распространение ошибок ).Следовательно, ошибки в сроке службы ACA не могут объяснить это несоответствие.

В этом исследовании единственная точечная мутация в последовательности, которая формирует флуорофор Венеры, Y ₆₇ C, была использована для образования янтаря, по сути, белка Венеры, лишенного внутреннего хромофора. Спектроскопия использовалась, чтобы показать, что добавление янтаря к церулеану не изменяет профиль эмиссии флуоресценции церулеанцев, подтверждая отсутствие флуорофора Венеры в янтаре (рис. 1B). В предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что лигирование Amber только с C-концом Cerulean незначительно изменяет его время жизни (на ~ 200 пс).Этот результат отличался от результата, приведенного выше для ACA. Тем не менее этот небольшой сдвиг в продолжительности жизни Cerulean не изменился в зависимости от длины линкера [11], как это наблюдалось в гомологичных конструкциях, где Венера была присоединена к C-концу Cerulean. В этом случае время жизни Cerulean резко сократилось, по крайней мере, на 1 нс, и постоянно становилось еще короче, поскольку количество аминокислот в линкере, разделяющем два флуорофора, уменьшалось с 32 до 17, а затем до 5 [11]. Соответственно, был сделан вывод, что точечная мутация Amber не создала новый хромофор, который мог бы действовать как темный поглотитель для Cerulean флуоресценции.

В этом исследовании предполагается, что систематическое введение точечных мутаций Amber в VCV и в VCVV не изменило расстояние разделения или фактор дипольной ориентации (κ ²) оставшихся пар Cerulean-Venus FRET в этих конструкциях. Это кажется разумным предположением, поскольку известно, что тирозин ₆₇ находится внутри структуры β-бочки Венеры, а не на ее поверхности [15]. Более того, разница в массе между тирозином и цистеином составляет 60 г / моль, таким образом, в худшем случае с двумя заменами янтаря разница в массе между конструкцией VCVV и массой ACVA, VCAA или ACAV составляет всего 0 .1%. Мы также отмечаем, что если введение янтаря должно было вызвать сдвиг в расстоянии разделения или коэффициенте дипольной ориентации оставшихся пар Церулеан-Венера FRET, мы могли бы ожидать как положительные, так и отрицательные изменения в оставшихся скоростях передачи FRET. Однако результаты, представленные здесь, были бы возможны только в том случае, если введение мутации Amber всегда приводило к значительному чистому снижению оставшейся скорости передачи FRET (~ 36% для ACV и VCA и ~ 41% для ACVA, VCAA и ACAV).Тем не менее, для дальнейшего исследования этой возможности был использован анализ затухания флуоресцентной анизотропии для сравнения трехмерной структуры янтаря с известными β-цилиндрическими структурами Церулеана [14] и Венеры [15] (рис. 1C). Сходство между затуханием анизотропии флуоресценции VCV и VAV указывает на то, что как скорости передачи гомо-FRET между двумя молекулами Венеры в этих конструкциях, так и время корреляции вращения для этих флуорофоров были почти идентичными [13]. Мы пришли к выводу, что трехмерная структура янтаря, вероятно, представляет собой β-бочку, подобную Церулеану и Венере, и что крайне маловероятно, что введение янтаря вызвало изменение расстояния разделения или фактора ориентации диполя оставшихся Церулеан-Венеры. FRET пары.Следует также отметить, что, поскольку время корреляции вращения Венеры и Церулеана намного больше, чем время их жизни флуоресценции [20], движение этих флуорофоров во время установившегося измерения FRET будет незначительным, если вообще будет. Таким образом, маловероятно, что наблюдаемые в данном исследовании расхождения можно объяснить изменениями расстояния разделения пар FRET или значения κ ² в результате вращения молекул между возбуждением и излучением.

Было высказано предположение, что большая часть флуоресцентных белков не может сворачиваться и образовывать хромофоры при экспрессии в клетках [21].Если это так, интерпретация измерений FRET флуоресцентного белка потребует учета доли неправильно свернутых доноров и акцепторов. Этот крайний вывод был основан на зависимой от модели интерпретации отсутствия единственного экспоненциального спада при анализе спада времени жизни флуоресценции тандемных флуоресцентных белковых конструкций с одним донором и одним акцептором. Альтернативное объяснение этого наблюдения, однако, состоит в том, что тандемные конструкции флуоресцентных белков имеют распределение расстояний разделения между донорами и акцепторами, а не одно дискретное расстояние разделения.Это тоже приведет к многоэкспоненциальному распаду, даже если оба флуорофора складываются нормально и эффективно. Чтобы различать эти возможности, мы использовали анализ E-FRET [18], [19], который в дополнение к эффективности ансамбля FRET также дает соотношение акцепторов и доноров в клетке. Мы обнаружили, что в наших условиях культивирования прогнозируемое соотношение акцепторов и доноров для конкретной конструкции соответствовало соотношению, измеренному экспериментально. Таким образом, маловероятно, что значительная часть флуорофоров в этих конструкциях не может образоваться в результате неправильной укладки белка.

Одним из возможных объяснений избыточного переноса энергии, наблюдаемого в клетках, экспрессирующих VCV или VCVV, является то, что клетки, экспрессирующие эти конструкции, имели значительно более высокие уровни межмолекулярного FRET, чем наблюдаемые в клетках, экспрессирующих контрольные конструкции (например, ACV, VCA для серии VCV и ACVA, VCAA и ACAV для серии VCVV). На рисунке 4 измеренные эффективности FRET были нанесены на график как функция концентрации акцептора. Лишь небольшое увеличение эффективности FRET в зависимости от интенсивности Венеры наблюдалось в диапазоне интенсивности акцепторов, охватывающем по крайней мере 1 порядок величины для каждой конструкции.Линейный регрессионный анализ набора данных для каждой конструкции использовали для оценки внутримолекулярной эффективности FRET в отсутствие межмолекулярного FRET. Эти экстраполированные внутримолекулярные эффективности FRET затем использовались для прогнозирования эффективности VCV и VCVV FRET с использованием кинетической модели. Даже при использовании этих скорректированных значений эффективности FRET кинетическая модель не смогла точно предсказать измеренную эффективность VCV или VCVV FRET. Мы пришли к выводу, что наличие межмолекулярного FRET в наших образцах, если таковое имеется, не является причиной наблюдаемого переноса избыточной энергии.

Если существует дополнительный путь скрытой передачи энергии, который удаляет энергию возбуждения от донора, эффективность передачи ансамбля будет:

Где k _{D → X} — скорость передачи энергии этого нового гипотетического пути. Соответственно, это уравнение также можно использовать для оценки скорости передачи k _{D → X} (и эффективности передачи, E _X ) этого дополнительного пути передачи энергии, если эффективность ансамбля FRET и отдельные скорости передачи FRET известны.Для эксперимента VCV E-FRET с двумя акцепторами Венеры, описанного выше, используя средние значения эффективности E-FRET из рисунков 2B и 3B, мы вычисляем, что E _X = 0,45 ± 0,02 ( k _{D → X} = 0,28 ± 0,02 нс ⁻¹, среднее ± стандартная ошибка среднего распространения), а для VCVV с тремя акцепторами Венеры мы вычисляем, что E _X = 0,56 ± 0,03 ( k _{D → X} = 0,43 ± 0,05 нс ^{— 1}). Концептуально k _{D → X} для VCV можно рассматривать как разницу между скоростью передачи VCV и суммой на рисунке 2C, а k _{D → X} для VCVV можно рассматривать как разницу между VCVV и Суммарная скорость передачи на рисунке 3C.Эти скорости передачи не совпадают. Удивительно, но k _{D → X} увеличивалось с увеличением количества акцепторов и, по-видимому, масштабировалось с количеством молекул Венеры, присутствующих в конструкции (~ 0,14 нс ^-1 / акцептор Венеры). Это предполагает, что дополнительный путь, если он существует, физически включает взаимодействия между Cerulean и этими молекулами Венеры. Также стоит отметить, что скорость передачи k _{D → X} , предсказанная для VCVV (0,43 нс ^-1), значительно выше, чем три скорости передачи FRET, измеренные между церулеанским донором и отдельными акцепторами Венеры (0.23, 0,24 и 0,14 нс ⁻¹). Один из способов объяснить расхождение между измеренной эффективностью FRET VCVV, равной 0,76, с эффективностью FRET, предсказанной кинетической моделью (0,65), состоит в том, чтобы предположить, что измерения эффективности FRET для ACVA, VCAA и ACAV занижают « истинную » эффективность FRET на примерно 0,12–0,13. По трансферным ставкам пришлось бы занижать их на 41%. Это кажется маловероятным, поскольку мы ранее показали, что измерения E-FRET статистически неотличимы от измерений FLIM-FRET [11], и что оба метода могут различать изменения эффективности FRET всего на 5% [11].Кроме того, система E-FRET, используемая в этом исследовании, была откалибрована с помощью эталонных стандартов FRET [11], [19], а соотношение акцептор / донор, измеренное одновременно с помощью E-FRET для всех этих конструкций, было правильным до ближайшего целого числа (1 для ACVA, VCAA, ACAV, 3 для VCVV). Мы пришли к выводу, что в VCVV доминирующим путем передачи энергии от возбужденного церулеанского флуорофора является не радиационная эмиссия или классический перенос FRET к какой-либо из трех присоединенных молекул Венеры, а скорее является результатом плохо изученного дополнительного пути передачи энергии.

Какой физический процесс может объяснить передачу энергии с такой высокой скоростью? И Церулеан, и Венера представляют собой флуорофоры, заключенные в белковой оболочке β-ствола. Таким образом, маловероятно, что механизм обмена электронов Декстера возможен, потому что самое близкое, что эти флуорофоры могут сблизиться друг с другом, составляет ∼2–3 нм [7], [22]. Точно так же на таких расстояниях, и особенно при физиологически значимых температурах [23], также кажется маловероятным, что флуорофоры могут быть сильно связаны [7].Также маловероятно, что этот дополнительный путь является результатом присутствия эндогенного клеточного тушителя, поскольку: 1. Время жизни Cerulean, когда он присоединен к другим белкам как на его C-, так и на N-конце, в отсутствие акцепторов (ACA) также измеряли у живых организмов. клетки; таким образом, если бы тушители присутствовали в этих клетках, они были бы учтены в наших расчетах. 2. Время жизни Cerulean в клетках [11] было аналогично времени жизни очищенного Cerulean в буферах, показатель преломления которых был подобен таковому у цитоплазмы [24]. ; таким образом, маловероятно, что гипотетические эндогенные тушители существенно повлияли на наши измерения времени жизни ACA, 3.И Церулеан, и Венера не тушатся низкомолекулярными тушителями, такими как акриламид или йодид калия [20], и 4. Как упоминалось выше, скорость передачи энергии k _{D → X} увеличивается с увеличением количества акцепторов Венеры, присутствующих в конструкция. Это говорит о том, что хромофор Венеры является «гасителем», ответственным за передачу избыточной энергии. Хотя мы не можем исключить дополнительный механизм передачи энергии от Cerulean, облегченный физическим контактом между стенками соседних белковых оболочек β-бочки, такой механизм все же требует присутствия хромофоров Венеры внутри β-бочки, так как время жизни Cerulean в ACA был подобен времени жизни только Cerulean, и оба были намного дольше, чем ранее измеренное время жизни флуоресценции Cerulean в VCV [16].Более того, такой механизм кажется маловероятным, поскольку все молекулы Cerulean, Venus и Amber, использованные в этом исследовании, содержали мутацию A ₂₀₆ K, которая предотвращает агрегацию флуоресцентных белков [25].

Без убедительного объяснения переноса избыточной энергии, наблюдаемого при наличии нескольких акцепторов Венеры, мы должны сделать вывод, что существует необъяснимый новый механизм передачи от донора Церулеана акцепторам Венеры, или рассмотреть возможность того, что одно из наших предположений о применении кинетический формализм для расчета эффективности ансамбля FRET для VCV или VCVV неверен.Предположения, связанные с передачей энергии FRET, были ясно объяснены Фёрстером [1]. Более того, многие предсказания для FRET были соблюдены, что подтвердило теорию, и полезность этого подхода выдержала испытание временем [2], [26], [27], [28], [29], [ 30], [31]. Это будет менее ясно, если мы можем просто предположить, что представители семейства зеленых флуоресцентных белков (GFP) [32], такие как Cerulean и Venus, будут вести себя как «типичные» флуорофоры. DsRed представляет собой красный флуоресцентный белок, структурно связанный с GFP [33], который, как полагают, образует комплекс из четырех тесно связанных флуорофоров, каждый из которых заключен в свои белковые оболочки β-бочонка [34].Эксперименты по отбеливанию одиночных молекул [35], [36], а также сравнение кругового дихроизма и абсорбционной спектроскопии [37] предполагают существование экситонного поведения в этой тетрамерной сборке DsRed. Как заметил Фёрстер [1], в этих условиях «процесс возбуждения по существу разделяется с соседними молекулами, и правильнее приписывать энергию возбуждения всей системе молекул, чем отдельным молекулам». По сути, доноры и акцепторы будут вести себя как единое целое, а не как отдельные флуорофоры.Если бы экситонное поведение происходило в VCV или VCVV, теория FRET и кинетический формализм для передачи энергии нескольким акцепторам не действовали бы. Как упоминалось ранее, экситонное поведение или даже слабая связь не возникает при физиологических температурах, особенно для флуорофоров, которым препятствуют сближение друг с другом в результате стерических препятствий [32]. Хотя такой неортодоксальный квантово-механический механизм переноса кажется маловероятным в биологическом контексте [38], отсутствие других объяснений заставляет нас предположить, что, возможно, структура β-бочонка флуоресцентных белков была эволюционно выбрана, чтобы допускать либо экситонное поведение, либо слабую связь. возбуждение, или дополнительный путь передачи энергии.

Независимо от фактических причин более высоких количеств передачи энергии, которые мы наблюдали в конструкциях, имеющих несколько акцепторов FRET Венеры, наше исследование показывает: 1. Следует проявлять осторожность при интерпретации количественных экспериментов FRET, где может присутствовать несколько акцепторов FRET, и 2. Использование нашей экспериментальной системы, в которой мы можем создавать белки с любым произвольным числом доноров и акцепторов, может быть использовано для создания более эффективных путей передачи энергии. Это, в свою очередь, можно использовать для оптимизации захвата и воронки энергии в приложениях нанотехнологий.Мы предполагаем, что β-цилиндрическая структура флуоресцентных белков может быть ответственна за более высокую скорость переноса при наличии нескольких акцепторов. Даже отдаленная возможность того, что флуоресцентные белки в физиологических условиях могут передавать энергию вне режима Ферстера, указывает на необходимость дальнейших экспериментов.

Материалы и методы

Конструкция клона

Эндонуклеазы рестрикции были получены от New England Biolabs (NEB, США) или Roche (США). Pfu Ultra (Stratagene, США) использовали во всех полимеразных цепных реакциях (ПЦР). Все спектральные варианты зеленого флуоресцентного белка (FP) [39], использованные в данном исследовании, содержали мономерную мутацию A ₂₀₆ K [25]. Клонирование и конструирование Cerulean C1; голубой ФП с одним экспоненциальным спадом времени жизни [9], Венера C1; желтый FP, который быстро сворачивается [10], 6 × His-меченый Cerulean, 6 × His-меченный Venus, Cerulean-5-Venus (C5V), а также гетеротримерная конструкция FP VCV; Венера-5-Церулеан-6-Венера (где числа обозначают количество аминокислот, разделяющих флуорофоры) описаны в другом месте, как указано [11], [16].Янтарный C1; «подобный» Венере FP, лишенный хромофора в результате единственной точечной мутации (Y ₆₇ C), был получен путем мутации тирозина ₆₇ Венеры-C1 в цистеин с использованием смыслового праймера 5′-ACCCTCGTGACCACCCTCGGCTGCGCCTGCAGTGCT 3 ‘и антисмысловой праймер 5′-GCGGGCGAAGCACTGCAGGCCGCAGCCGAGGGTGGTCACGAGGGT-3’. Полученный клон Amber C1 подтверждали секвенированием. Двойные конструкции FP C5A, V5A, A5C, V5C, V5V, A5V и A5A были сконструированы путем первой амплификации кДНК Amber, Cerulean или Venus без стартового кодона с использованием смыслового праймера с сайтом BglII (подчеркнутым) 5′-GCAGATCTGTGAGCAAGGCGACCAGCTG-3 ‘И антисмысловой праймер с сайтом EcoRI (подчеркнутым) сайтом 5′-GCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG-3’ из любого мономерного вектора Amber-C1, Cerulean-C1 или Venus-C1.Полученные фрагменты клонировали в Zero Blunt II Topo (Invitrogen, США) и секвенировали. Полноразмерную кДНК Amber вырезали с использованием BglII и EcoRI и клонировали в Cerulean C1 или Venus C1 для образования C5A и V5A соответственно. Аналогичным образом полноразмерную кДНК Cerulean клонировали в сайт BglII / EcoRI Amber C1 для генерации A5C или в Venus C1 для генерации V5C. Полноразмерную кДНК Венеры клонировали в сайт BglII / EcoRI Amber C1 для получения A5V и Venus C1 для генерации V5V. Конструкции были проверены по размеру с использованием рестрикционных дайджестов.Полноразмерную кДНК Amber клонировали в сайт BglII / EcoRI Amber C1 для получения A5A.

Для создания гетеротримерных конструкций FP: Amber-5-Cerulean-6-Amber (ACA), Venus-5-Cerulean-6-Amber (VCA), Amber-5-Cerulean-6-Venus (ACV), Amber -5-Венера-6-Янтарь (AVA), Венера-5-Янтарь-6-Янтарь (VAA), Янтарь-5-Янтарь-6-Венера (AAV) и Венера-5-Венера-6-Венера-Янтарь, Открытая рамка считывания (ORF) Cerulean или Venus была амплифицирована с использованием смыслового праймера с сайтом SalI (подчеркнутым), 5′-GCGTCGACGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG-3 ‘и антисмысловым праймером с сайтом BamHI (подчеркнутым) TTAT’-AGTCTCGGATGCCCCGTCTG-3TAT’-AGTCTCGGATGCCCCTGTCGACCCCGCCTG-3TAT’-AGTCTCGGATGCCCTG.Полученный фрагмент клонировали и секвенировали, как описано ранее. Фрагмент Венеры был клонирован в AC, расщепленный SalI / BamHI, для генерации ACV, AA для генерации AAV и VV для генерации VVV. Amber ORF аналогичным образом клонировали в VC для генерации VCA и AC для генерации ACA.

Для создания гетеротетрамерных конструкций FP: Венера-5-Церулеан-5-Венера-6-Венера (VCVV), Янтарь-5-Церулеан-5-Венера-6-Янтарь (ACVA), Янтарь-5-Церулеан- 5-Янтарь-6-Венера (ACAV) и Венера-5-Церулеан-5-Янтарь-6-Янтарь (VCAA) были построены из VVV, AVA, VAA и AAA соответственно.Смысловой праймер с сайтом BspE1 (подчеркнутый), 5′-AGTCTCCGGAGGAGGTGGAAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3 ‘и антисмысловой праймер с сайтом BglII (подчеркнутый) 5′-AGTCAGATCTTCCACCTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ были использованы для амплификации Cerulean из вектора Cerulean из Cerulean. Фрагмент ДНК клонировали в Zero Blunt II-TOPO, и вставку секвенировали. Вставку вырезали с помощью BspE1 и BglII и клонировали в VVV для генерации VCVV, в AAV для генерации ACAV, в VAA для генерации VCAA и в AVA для генерации ACVA.

Культура клеток и трансфекция

Клетки

HEK 293 (ATCC, США) культивировали в виде монослоя в колбе Т-75 (Corning, США) в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ на воздухе при 37 ° C в среде, содержащей DMEM с Hi-глюкозой, пируват натрия, 10% эмбриональная бычья сыворотка, 1 × NEAA, 1 × Pen-Strep и 1 × Glutamax (все закуплено в Invitrogen, США). За два дня до визуализации клетки ресуспендировали с использованием TrypLE Express (Invitrogen, США) и высевали на чашки со стеклянным дном 35 мм (Fluorodish, World Precision Instruments, США).На следующий день 1 мг кДНК плазмиды трансфицировали в клетки с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) и инкубировали в течение ночи, а на следующий день проводили визуализацию в PBS (Media Tech, США).

Многофотонная микроскопия

Ti: сапфировый лазер с синхронизацией мод (Coherent Chameleon, США), работающий на частоте 80 МГц и настраиваемый в диапазоне 710–950 нм, был присоединен к вертикальному микроскопу Zeiss Axioplan-2 со сканирующей головкой Zeiss 510 META / NLO и использовался для получать спектральные изображения с двухфотонным возбуждением [40] для анализа sRET [16], [17].После блокировки возбуждающего света с помощью фильтра BG39, помещенного на световом пути, спектральные изображения со всеми 32 каналами внутреннего детектора META были использованы для получения спектров излучения (охватывающих диапазон 388–719 нм).

sRET Анализ

Спектральные изображения для анализа sRET были получены, как описано ранее [16]. Вкратце, пары спектральных изображений 1. капилляров, содержащих 7,8 мкМ Cerulean или Venus, и 2. Клетки, трансфицированные конкретной конструкцией FRET, собирали при возбуждении 860 и 900 нм с использованием 20 × NA 0.5 водный объектив. Затем этот набор из 4 спектральных изображений был загружен в Igor Pro (Wavemetrics, США) и обработан с помощью макроса, реализующего алгоритм sRET. Измеряли эффективность FRET для отдельных ячеек. Средняя эффективность FRET и статистический анализ выполняли с использованием Prism 5.0 (GraphPad software Inc., США).

Анализ E-FRET

Измерения

E-FRET были выполнены, как описано в [19]. Вкратце, инвертированный микроскоп IX-71 (Olympus, Япония), оснащенный ксеноновой дуговой лампой мощностью 75 Вт, механическим затвором UNIBLITZ (Vincent Associates, США), масляным объективом 60 × (NA 1.4), набор донорных фильтров (куб IDD, донорный канал; возбуждение: 436 ± 10 нм, эмиттер: 480 ± 20 нм, дихроичный: 455LP), набор акцепторных фильтров (куб IAA, акцепторный канал; возбуждение: 500 ± 10 нм, излучатель: 540 ± 15 нм, дихроичный: 520LP) и набор фильтров FRET (куб IDA, канал FRET; возбуждение: 436 ± 10 нм, излучатель: 540 ± 15 нм, дихроичный: 455LP). Для сбора данных использовалась 12-битная охлаждаемая ПЗС-камера (Retiga Exi, Qimaging, Канада). Эффективность FRET и линейный регрессионный анализ межмолекулярного FRET рассчитывались с помощью Igor Pro (Wavemetrics), а статистический анализ выполнялся с помощью Graph Pad Prism 5.0.

Флуоресцентная пожизненная микроскопия

Анализ затухания времени жизни флуоресценции проводился с использованием коррелированного по времени счета одиночных фотонов [12], как описано ранее [11], [16]. Лазер с синхронизацией мод, настроенный на 820 нм, был использован для возбуждения Cerulean в конструкциях. Излучаемые фотоны фильтровались через фильтр BG39, полосовой фильтр 460–490 нм, поляризатор, настроенный на условия магического угла (54,7 °, Medowlark Optics, США), фильтр короткого прохода 700 нм (e700sp-2p; Chroma Optical, США). ) и обнаруживается на микроканальном пластинчатом фотоумножителе (R3809U-52; Hamamatsu, Япония), подключенном к нерассканированному порту детектора Zeiss 510, расположенному на пути проходящего света.Подсчет фотонов и их корреляция с возбуждающими лазерными импульсами производились с помощью модуля SPC830 (Becker and Hickl, Германия). Кривые затухания времени жизни флуоресценции собирали и обрабатывали, как описано ранее [11], [16]. Кривые были скорректированы по темноте. Сигнал второй гармоники, генерируемый одноосновными кристаллами фосфата натрия, облученными светом 940 нм, был использован для измерения функции отклика прибора (IRF) нашей системы. Как и ожидалось, для сигнала, генерируемого лазером с синхронизацией мод менее 200 фемтосекунд, и детектором MCP, измеренная полная ширина на половине максимального отклика была менее 40 пс.Этот измеренный IRF также использовался SPCImage (Becker and Hickle Gmbh, Германия) для более точного расчета среднего спада времени жизни ACA (с использованием двойной экспоненциальной модели) и флуоресцеина (с использованием одной экспоненциальной модели).

Спектр излучения

Спектральные изображения клеток, трансфицированных Cerulean, Cerulean-Amber или Cerulean-Venus, получали на лазерном сканирующем микроскопе Zeiss 510 META / NLO с использованием водяного объектива 40 × NA 0,8. Спектры от трех разных ячеек загружали в Igor Pro (Wavemetrics, США).После вычитания фона каждый спектр был нормализован к пику Cerulean при 481 нм и усреднен.

Измерения затухания анизотропии многофотонной флуоресценции

Измерения затухания анизотропии были выполнены, как описано ранее [41]. Вкратце, для получения измерений затухания анизотропии с временным разрешением использовался лазерный сканирующий микроскоп Zeiss 510 META / NLO, модифицированный для коррелированного по времени однофотонного счета [12]. Трансфицированные клетки визуализировали с использованием водяного объектива 40 × NA 0,8.Конструкции возбуждали лазером с синхронизацией мод, настроенным на 950 нм. Излученные фотоны фильтровались через фильтр BG39, полосовой фильтр 535 ± 15 нм, короткопроходный фильтр 700 нм (Chroma Optical, США), поляризационный светоделитель (Linos AG, Германия), дополненный двумя линейными поляризаторами (Medowlark Optics). , США), установленный на каждом пути излучения от кубического делителя, и обнаруженный на двух микроканальных пластинчатых фотоумножителях (Hamamatsu R3809U-52, Япония), расположенных на параллельной (I _VV) и перпендикулярной (I _VH) поляризации. пути.Фотоны, обнаруженные параллельными или перпендикулярными детекторами, мультиплексировались с помощью четырехканального маршрутизатора HR-41 (Becker and Hickl, Германия) и подсчитывались (и коррелировались с импульсами лазера возбуждения) с помощью модуля SPC830 (Becker and Hickl, Германия). Кривые затухания анизотропии флуоресценции с временным разрешением были построены на основе кривых затухания времени жизни флуоресценции, полученных от фотонов, детектируемых каждым фотоумножителем, с использованием следующего уравнения [13] для анизотропии ( r ): G — это константа, специфичная для микроскопа, которая учитывает различную эффективность для обнаружение фотонов в путях I _VV и I _VH . G был измерен с помощью подгонки хвоста I _VV и I _VH кривых спада времени жизни флуоресцеина, образца, который, как известно, быстро деполяризуется [42], и оказалось, что он составляет ~ 1,2.

FRET скорость передачи и вычисления ошибок

скорости FRET ( k _{D → A} ) были рассчитаны на основе индивидуальных значений эффективности FRET, как определено анализом E-FRET, с использованием следующего уравнения: где τ _D — время жизни конструкции ACA (2.95 нс). Ошибки в этих кинетических скоростях были рассчитаны с использованием распространения ошибок [43] с помощью программного обеспечения Maple (Maplesoft, Ватерлоо, Канада): где — измеренная ошибка в измерениях эффективности FRET, а — измеренная ошибка во времени жизни донора в отсутствие акцепторов. .

Прогнозы кинетической модели и распространение ошибок

Кинетическая модель с несколькими акцепторами (уравнение 2) может быть выражена в терминах наблюдаемой эффективности FRET, E _i , для передачи энергии от одного донора к акцептору i как: где n = 2 , 3 при наличии двух или трех акцепторов.Обратите внимание, что время жизни донора, τ _D , отсутствует в этом уравнении, и поэтому время жизни донора (а также неопределенность его значения) не влияет на значение или ошибку в прогнозировании эффективности ансамбля FRET.

Ошибка в прогнозируемой эффективности FRET ансамбля с использованием кинетической модели, была получена с использованием распространения ошибок [43] с программным обеспечением Maple (Maplesoft, Ватерлоо, Канада). Ошибка в прогнозе эффективности FRET для VCV составляет:

Расчет, используемый для оценки ошибки в прогнозе эффективности FRET для донора с тремя акцепторами, например для VCVV, значительно сложнее, чем расчет для донора только с двумя акцепторами: где выполняются следующие замены:

Благодарности

Авторы благодарят докторов наук.Кристоферу Талеру, Стивену Икеде и Туану Нгуену за критическое прочтение нашей рукописи и благодарность за многочисленные стимулирующие обсуждения и переписку, относящиеся к этому исследованию, от множества коллег, которых слишком много, чтобы их можно было упомянуть.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SSV. Проведены эксперименты: СВК. Проанализированы данные: СВК ПСБ ССВ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SVK. Написал статью: SSV.

Ссылки

1.Förster T (1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция. Annalen der Physik 2: 55–75.
2. Стейнберг И. З. (1971) Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения на большие расстояния в белках и полипептидах. Анну Рев Биохим 40: 83–114.
3. Страйер Л. (1978) Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Анну Рев Биохим 47: 819–846.
4. Cantor CR, Schimmel PR (1980) Биофизическая химия, часть II: Методы изучения биологической структуры и функции.Сан-Франциско: W.H. Freeman & Co. 846 с.
5. Клегг Р.М. (1996) Перенос энергии резонанса флуоресценции. В: Ван XF, Герман Б., редакторы. Флуоресцентная визуализация, спектроскопия и микроскопия. Чичестер: John Wiley & Sons, Inc., стр. 179–252.
6. Лакович Дж. Р. (1999) Принципы флуоресцентной спектроскопии. Нью-Йорк: Kluwer Academic / Plenum Publishers. 698 с.
7. Valeur B (2002) Молекулярная флуоресценция. Вайнхайм: Wiley-VCH. 387 с.
8. Фогель С.С., Талер С., Кушик С.В. (2006) Причудливый FRET. Sci STKE 2006: re2.
9. Rizzo MA, Springer GH, Granada B, Piston DW (2004) Улучшенный вариант голубого флуоресцентного белка, полезный для FRET. Nat Biotechnol 22: 445–449.
10. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Nat Biotechnol 20: 87–90.
11. Koushik SV, Chen H, Thaler C, Puhl HL 3rd, Vogel SS (2006) Эталонные стандарты Cerulean, Venus и VenusY67C FRET. Biophys J 91: L99 – L101.
12. Беккер В. (2005) Продвинутые методы коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов ;. В: Castleman AW, Toennies JP, Zinth W, редакторы. Берлин, Гейдельберг, Нью-Йорк: Springer. 401 с.
13. Фогель С.С., Талер С., Бланк П.С., Кушик С.В. (2009) Анизотропия флуоресценции с временным разрешением. В: Periasamy A, Clegg RM, редакторы.FLIM-микроскопия в биологии и медицине. 1 изд. Лондон: Тейлор и Фрэнсис (CRC Group). С. 245–288.
14. Malo GD, Pouwels LJ, Wang M, Weichsel A, Montfort WR, et al. (2007) Рентгеновская структура Cerulean GFP: хромофор на основе триптофана, полезный для визуализации времени жизни флуоресценции. Биохимия 46: 9865–9873.
15. Rekas A, Alattia JR, Nagai T., Miyawaki A, Ikura M (2002) Кристаллическая структура венеры, желтый флуоресцентный белок с улучшенным созреванием и пониженной чувствительностью к окружающей среде.J Biol Chem 277: 50573–50578.
16. Талер С., Кушик С.В., Бланк П.С., Фогель С.С. (2005) Количественная многофотонная спектральная визуализация и ее использование для измерения резонансной передачи энергии. Biophys J 89: 2736–2749.
17. Фогель С.С., Бланк П.С., Кушик С.В., Талер С. (2009) Спектральная визуализация и ее использование для измерения резонансной передачи энергии Ферстера в живых клетках. В: Гадела TWJ, редактор. Технологии FRET и FLIM. ПЕРВОЕ изд. Амстердам: Эльзевир. С. 351–394.
18. Зал Т., Гаскойн Н.Р. (2004) Визуализация живых клеток с поправкой на фотообесцвечивание FRET. Biophys J 86: 3923–3939.
19. Chen H, Puhl HL 3rd, Koushik SV, Vogel SS, Ikeda SR (2006) Измерение эффективности FRET и отношения концентрации донора к акцептору в живых клетках. Biophys J 91: L39–41.
20. Sarkar P, Koushik SV, Vogel SS, Gryczynski I, Gryczynski Z (2009) Фотофизические свойства флуоресцентных белков Cerulean и Venus.J Biomed Opt 14: 034047.
21. Ясуда Р., Харви С.Д., Чжонг Х., Собчик А., ван Элст Л. и др. (2006) Сверхчувствительная активация Ras в дендритах и шипах, выявленная с помощью визуализации времени жизни двухфотонной флуоресценции. Nat Neurosci 9: 283–291.
22. Клегг Р. (2009) Резонансная передача энергии Форстера -FRET, что это такое, зачем это делать и как это делается. В: TWJ G, редактор. Методы FRET и FLIM. 1 изд. Амстердам: Эльзевир. С. 1–57.
23. Hettich C, Schmitt C, Zitzmann J, Kuhn S, Gerhardt I и др.(2002) Нанометровое разрешение и когерентное оптическое дипольное взаимодействие двух отдельных молекул. Наука 298: 385–389.
24. Кушик С.В., Фогель С.С. (2008) Миграция энергии изменяет время жизни флуоресценции Cerulean: последствия для визуализации времени жизни флуоресценции Измерения резонансного переноса энергии Форстера. J Biomed Opt 13: 031204.
25. Zacharias DA, Violin JD, Newton AC, Tsien RY (2002) Разделение липид-модифицированных мономерных GFP на мембранные микродомены живых клеток.Наука 296: 913–916.
26. Эндрюс Д.Л., Демидов А.А., ред. (1999) Резонансная передача энергии. 1-е изд. Чичестер: Джон Уайли и сыновья. 468 с.
27. Страйер Л., Хаугланд Р.П. (1967) Передача энергии: спектроскопическая линейка. Proc Natl Acad Sci U S A 58: 719–726.
28. Ву П, Брэнд Л. (1994) Резонансный перенос энергии: методы и приложения. Аналитическая биохимия 218: 1–13.
29. Jares-Erijman EA, Jovin TM (2006) Визуализация молекулярных взаимодействий в живых клетках с помощью микроскопии FRET.Curr Opin Chem Biol 10: 409–416.
30. Периасамы А, Дэй Р.Н., ред. (2005) Молекулярная визуализация: FRET-микроскопия и спектроскопия. 1-е изд. Оксфорд, Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. 312 с.
31. Gadella TWJ (2009) FRET и FLIM Techniques ;. В: Pillai S, van der Vliet PC, редакторы. Амстердам: Эльзевир. 534 с.
32. Ормо М., Кубитт А.Б., Каллио К., Гросс Л.А., Цзянь Р.Й. и др. (1996) Кристаллическая структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria.Наука 273: 1392–1395.
33. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г. и др. (1999) Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Nat Biotechnol 17: 969–973.
34. Heikal AA, Hess ST, Baird GS, Tsien RY, Webb WW (2000) Молекулярная спектроскопия и динамика внутренне флуоресцентных белков: кораллово-красный (dsRed) и желтый (цитрин). Proc Natl Acad Sci U S A 97: 11996–12001.
35. Garcia-Parajo MF, Koopman M, van Dijk EM, Subramaniam V, van Hulst NF (2001) Природа эмиссии флуоресценции в красном флуоресцентном белке DsRed, выявленная с помощью детектирования одной молекулы.Proc Natl Acad Sci U S A 98: 14392–14397.
36. Лунис Б., Дейч Дж., Розелл Ф.И., Боксер С.Г., Мёрнер В.Е. (2001) Фотофизика DsRed, красного флуоресцентного белка, от ансамбля до уровня одной молекулы. J. Phys Chem B 105: 5048–5054.
37. Visser NV, Hink MA, Borst JW, van der Krogt GN, Visser AJ (2002) Спектроскопия кругового дихроизма флуоресцентных белков. FEBS Lett 521: 31–35.
38. Гилмор Дж, Маккензи Р.Х. (2008) Квантовая динамика электронных возбуждений в биомолекулярных хромофорах: роль белкового окружения и растворителя.J. Phys Chem. A 112: 2162–2176.
39. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) Руководство по выбору флуоресцентных белков. Нат методы 2: 905–909.
40. Денк В., Стриклер Дж. Х., Уэбб В. В. (1990) Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия. Наука 248: 73–76.
41. Thaler C, Koushik SV, Puhl HL 3rd, Blank PS, Vogel SS (2009) Структурная перестройка каталитических доменов CaMKIIα кодирует активацию. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 6369–6374.
42. Hess ST, Sheets ED, Wagenknecht-Wiesner A, Heikal AA (2003) Количественный анализ флуоресцентных свойств внутренне флуоресцентных белков в живых клетках. Biophys J 85: 2566–2580.
43. Bevington PR, Robinson DK (1992) Обработка данных и анализ ошибок для физических наук Нью-Йорк: McGraw-Hill, Inc. 328.

Зафиксированные датчики FRET обнаруживают локальную активацию каспаз до дегенерации нейронов | Молекулярная нейродегенерация

Raff MC, Whitmore AV, Finn JT: Самоуничтожение аксонов и нейродегенерация. Наука. 2002, 296: 868-871. 10.1126 / science.1068613.

PubMed CAS Статья Google ученый

Williams DW, Kondo S, Krzyzanowska A, Hiromi Y, Truman JW: Локальная активность каспаз направляет поглощение дендритов во время обрезки. Nat Neurosci. 2006, 9: 1234-1236. 10.1038 / nn1774.

PubMed CAS Статья Google ученый

Николаев А., Маклафлин Т., О’Лири Д.Д., Тесье-Лавин М.: APP связывает DR6, чтобы вызвать отсечение аксонов и гибель нейронов через отдельные каспазы. Природа. 2009, 457: 981-989. 10.1038 / природа07767.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

Альбрехт С., Богданович Н., Гетти Б., Винблад Б., Леблан А.С.: Активация каспазы-6 в головном мозге семейной болезни Альцгеймера, несущей белок-предшественник амилоида или пресенилин I или мутации пресенилина II.J Neuropathol Exp Neurol. 2009, 68: 1282-1293. 10.1097 / NEN.0b013e3181c1da10.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

Guo H, Albrecht S, Bourdeau M, Petzke T., Bergeron C, LeBlanc AC: Активный тау-белок, расщепленный каспазой-6 и каспазой-6, в нитях нейропила, нейритных бляшках и нейрофибриллярных клубках при болезни Альцгеймера. Am J Pathol. 2004, 165: 523-531. 10.1016 / S0002-9440 (10) 63317-2.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

Lazebnik YA, Takahashi A, Moir RD, Goldman RD, Poirier GG, Kaufmann SH, Earnshaw WC: Исследования ламинной протеиназы выявляют множественные параллельные биохимические пути во время апоптоза. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92: 9042-9046. 10.1073 / pnas.92.20.9042.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

Mattson MP: Пути к болезни Альцгеймера и от нее. Природа. 2004, 430: 631-639.10.1038 / природа02621.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

Takahashi A, Alnemri ES, Lazebnik YA, Fernandes-Alnemri T, Litwack G, Moir RD, Goldman RD, Poirier GG, Kaufmann SH, Earnshaw WC: расщепление ламината A по Mch3 alpha, но не CPP32: множественное Связанные с бета-превращающим ферментом интерлейкин 1 протеазы с отчетливыми свойствами распознавания субстрата активны в апоптозе. Proc Natl Acad Sci USA.1996, 93: 8395-8400. 10.1073 / pnas.93.16.8395.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

Takemoto K, Nagai T, Miyawaki A, Miura M: Пространственно-временная активация каспазы, выявленная индикатором, нечувствительным к воздействию окружающей среды. J Cell Biol. 2003, 160: 235-243. 10.1083 / jcb.200207111.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

10.

Юань А., Кумар А., Петерхофф С., Дафф К., Никсон Р.А.: На скорость транспорта аксонов in vivo не влияет делеция или сверхэкспрессия тау-белка у мышей. J Neurosci. 2008, 28: 1682-1687. 10.1523 / JNEUROSCI.5242-07.2008.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

11.

Buee L, Bussiere T, Buee-Scherrer V, Delacourte A, Hof PR: Изоформы тау-белка, фосфорилирование и роль в нейродегенеративных расстройствах. Brain Res Brain Res Rev.2000, 33: 95-130.

PubMed CAS Статья Google ученый

12.

Булина М.Е., Чудаков Д.М., Британова О.В., Янушевич Ю.Г., Староверов Д.Б., Чепурных Т.В., Мерзляк Е.М., Шкроб М.А., Лукьянов С., Лукьянов К.А.: Генетически закодированный фотосенсибилизатор. Nat Biotechnol. 2006, 24: 95-99. 10.1038 / nbt1175.

PubMed CAS Статья Google ученый

13.

Керр Дж. Ф., Уилли А. Х., Карри А. Р.: Апоптоз: основной биологический феномен с широким спектром влияния на кинетику тканей.Br J Рак. 1972, 26: 239-257. 10.1038 / bjc.1972.33.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

14.

Тейлор Р.К., Каллен С.П., Мартин С.Дж .: Апоптоз: контролируемое разрушение на клеточном уровне. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008, 9: 231-241.

PubMed CAS Статья Google ученый

15.

Lu DC, Rabizadeh S, Chandra S, Shayya RF, Ellerby LM, Ye X, Salvesen GS, Koo EH, Bredesen DE: второй цитотоксический протеолитический пептид, полученный из предшественника амилоидного бета-белка.Nat Med. 2000, 6: 397-404. 10.1038 / 74656.

PubMed CAS Статья Google ученый

16.

Диксон Т.С., Кинг К.Э., Маккормак Г.Х., Виккерс Дж.К .: Нейрохимическое разнообразие дистрофических нейритов на ранних и поздних стадиях болезни Альцгеймера. Exp Neurol. 1999, 156: 100-110. 10.1006 / exnr.1998.7010.

PubMed CAS Статья Google ученый

17.

Цай Дж., Грутцендлер Дж., Дафф К., Ган У. Б.: Отложение фибриллярного амилоида приводит к локальным синаптическим аномалиям и разрыву нейрональных ветвей. Nat Neurosci. 2004, 7: 1181-1183. 10.1038 / nn1335.

PubMed CAS Статья Google ученый

18.

Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X: цитохром c и dATP-зависимое образование комплекса Apaf-1 / каспаза-9 инициирует каскад апоптотических протеаз.Клетка. 1997, 91: 479-489. 10.1016 / S0092-8674 (00) 80434-1.

PubMed CAS Статья Google ученый

19.

Hakem R, Hakem A, Duncan GS, Henderson JT, Woo M, Soengas MS, Elia A, de la Pompa JL, Kagi D, Khoo W. и др.: Дифференциальная потребность в каспазе 9 в путях апоптоза в естественным образом. Клетка. 1998, 94: 339-352. 10.1016 / S0092-8674 (00) 81477-4.

PubMed CAS Статья Google ученый

20.

Kuida K, Haydar TF, Kuan CY, Gu Y, Taya C, Karasuyama H, Su MS, Rakic P, Flavell RA: Снижение апоптоза и опосредованной цитохромом активации каспазы у мышей, лишенных каспазы 9. Клетка. 1998, 94: 325-337. 10.1016 / S0092-8674 (00) 81476-2.

PubMed CAS Статья Google ученый

21.

Моришима Н., Наканиси К., Такенучи Х., Шибата Т., Ясухико Ю.: Каскад каспаз, специфичных для стресса эндоплазматического ретикулума, при апоптозе.Цитохром c-независимая активация каспазы-9 каспазой-12. J Biol Chem. 2002, 277: 34287-34294. 10.1074 / jbc.M204973200.

PubMed CAS Статья Google ученый

22.

Рао Р.В., Кастро-Обрегон С., Франковски Х., Шулер М., Сток В., дель Рио Дж., Бредесен Д.Э., Эллерби Х.М.: Связь стресса эндоплазматического ретикулума с программой гибели клеток. Внутренний путь, независимый от Apaf-1. J Biol Chem. 2002, 277: 21836-21842. 10.1074 / jbc.M202726200.

PubMed CAS Статья Google ученый

23.

Накагава Т., Чжу Х., Моришима Н., Ли Э, Сю Дж., Янкнер Б.А., Юань Дж .: Каспаза-12 опосредует апоптоз эндоплазматического ретикулума и цитотоксичность с помощью бета-амилоида. Природа. 2000, 403: 98-103. 10.1038 / 47513.

PubMed CAS Статья Google ученый

24.

Rohn TT, Rissman RA, Davis MC, Kim YE, Cotman CW, Head E: Активация каспазы-9 и расщепление каспазы тау в мозге при болезни Альцгеймера.Neurobiol Dis. 2002, 11: 341-354. 10.1006 / nbdi.2002.0549.

PubMed CAS Статья Google ученый

25.

D’Amelio M, Cavallucci V, Middei S, Marchetti C, Pacioni S, Ferri A, Diamantini A, De Zio D, Carrara P, Battistini L, Moreno S, Bacci A, Ammassari-Teule M, Marie H, Cecconi F: каспаза-3 запускает раннюю синаптическую дисфункцию на мышиной модели болезни Альцгеймера. Nat Neurosci. 2011, 14: 69-76. 10.1038 / № 2709.

PubMed Статья Google ученый

26.

Klaiman G, Petzke TL, Hammond J, Leblanc AC: цели активности каспазы-6 в человеческих нейронах и болезнь Альцгеймера. Протеомика клеток Mol. 2008, 7: 1541-1555. 10.1074 / mcp.M800007-MCP200.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

27.

Boix J, Llecha N, Yuste VJ, Comella JX: характеристика процесса гибели клеток, индуцированного стауроспорином в клеточных линиях нейробластомы человека. Нейрофармакология.1997, 36: 811-821. 10.1016 / S0028-3908 (97) 00030-0.

PubMed CAS Статья Google ученый

28.

Deshmukh M, Johnson EM: смерть нейронов, вызванная стауроспорином: множественные механизмы и методологические последствия. Смерть клетки отличается. 2000, 7: 250-261. 10.1038 / sj.cdd.4400641.

PubMed CAS Статья Google ученый

29.

Li K, Li Y, Shelton JM, Richardson JA, Spencer E, Chen ZJ, Wang X, Williams RS: Дефицит цитохрома c вызывает гибель эмбрионов и ослабляет вызванный стрессом апоптоз.Клетка. 2000, 101: 389-399. 10.1016 / S0092-8674 (00) 80849-1.

PubMed CAS Статья Google ученый

30.

Wei MC, Zong WX, Cheng EH, Lindsten T, Panoutsakopoulou V, Ross AJ, Roth KA, MacGregor GR, Thompson CB, Korsmeyer SJ: Proapoptotic BAX и BAK: необходимые ворота к митохондриальной дисфункции и смерти. Наука. 2001, 292: 727-730. 10.1126 / science.1059108.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

31.

Yuste VJ, Sanchez-Lopez I, Sole C, Encinas M, Bayascas JR, Boix J, Comella JX: предотвращение апоптоза, вызванного стауроспорином, с помощью Bcl-X (L), но не с помощью Bcl-2 или ингибиторов каспаз, позволяет обширную дифференциацию клеток нейробластомы человека. J Neurochem. 2002, 80: 126-139. 10.1046 / j.0022-3042.2001.00695.x.

PubMed CAS Статья Google ученый

32.

Котман CW, Андерсон AJ: Потенциальная роль апоптоза в нейродегенерации и болезни Альцгеймера.Mol Neurobiol. 1995, 10: 19-45. 10.1007 / BF02740836.

PubMed CAS Статья Google ученый

33.

Biswas SC, Shi Y, Vonsattel JP, Leung CL, Troy CM, Greene LA: Bim повышен в нейронах болезни Альцгеймера и необходим для индуцированного бета-амилоидом апоптоза нейронов. J Neurosci. 2007, 27: 893-900. 10.1523 / JNEUROSCI.3524-06.2007.

PubMed CAS Статья Google ученый

34.

Гонг Y, Чанг Л., Виола К.Л., Лакор П.Н., Ламберт М.П., Финч С.Е., Краффт Г.А., Кляйн В.Л.: Мозг, пораженный болезнью Альцгеймера: присутствие олигомерных бета-лигандов (ADDL) предполагает молекулярную основу обратимой потери памяти. Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100: 10417-10422. 10.1073 / pnas.1834302100.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

35.

Хаасс С., Селкое Д.Д.: Растворимые белковые олигомеры в нейродегенерации: уроки бета-пептида амилоида Альцгеймера.Nat Rev Mol Cell Biol. 2007, 8: 101-112. 10.1038 / nrm2101.

PubMed CAS Статья Google ученый

36.

Lacor PN, Buniel MC, Chang L, Fernandez SJ, Gong Y, Viola KL, Lambert MP, Velasco PT, Bigio EH, Finch CE и др.: Синаптическое нацеливание с помощью связанных с болезнью Альцгеймера амилоидных бета-олигомеров. J Neurosci. 2004, 24: 10191-10200. 10.1523 / JNEUROSCI.3432-04.2004.

PubMed CAS Статья Google ученый

37.

Walsh DM, Selkoe DJ: Бета-олигомеры — десятилетие открытий. J Neurochem. 2007, 101: 1172-1184. 10.1111 / j.1471-4159.2006.04426.x.

PubMed CAS Статья Google ученый

38.

Ivins KJ, Bui ET, Cotman CW: Бета-амилоид вызывает локальную дегенерацию нейритов в культивируемых нейронах гиппокампа: доказательства нейритного апоптоза. Neurobiol Dis. 1998, 5: 365-378. 10.1006 / NBDI.1998.0228.

PubMed CAS Статья Google ученый

39.

de Calignon A, Fox LM, Pitstick R, Carlson GA, Bacskai BJ, Spiers-Jones TL, Hyman BT: активация каспазы предшествует и приводит к путанице. Природа. 2010, 464: 1201-1204. 10.1038 / природа08890.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

40.

Stine WB, Dahlgren KN, Krafft GA, LaDu MJ: характеристика условий для олигомеризации и фибриллогенеза амилоид-бета-пептида in vitro. J Biol Chem.2003, 278: 11612-11622. 10.1074 / jbc.M210207200.

PubMed CAS Статья Google ученый

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка

РЕФЕРАТ

Размеры, которые развернутые и внутренне неупорядоченные белки (IDP) принимают при низком уровне денатуранта или без него, остаются спорными. Недавно мы разработали инновационную процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и обнаружили, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными, как и химически денатурированный ансамбль, что делает их значительно более расширенными, чем можно предположить из многих резонансных передач энергии флуоресценции. (FRET) учеба.Здесь мы показываем, что флюорфоры, типичные для тех, которые добавляются к IDP для исследований FRET, вносят вклад в это несоответствие. В частности, мы обнаружили, что маркировка сильно расширенного IDP с помощью Alexa488 приводит к значительному сокращению его совокупности.

Мы также проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованы, если для развернутых белков (и в отличие от случая идеальных гомополимеров со случайным полетом) радиус вращения (R _g) может изменяться независимо от расстояние от конца до конца цепи (R _ee).Однако наш анализ показывает, что SAXS способен точно извлекать R _g, ν и R _ee даже для гетерополимерных белковых последовательностей. Из этих исследований мы пришли к выводу, что мягкое сокращение цепи и взаимодействия на основе флуорофора при более низких концентрациях денатуранта, наряду с улучшенными процедурами анализа как для SAXS, так и для FRET, могут объяснить преобладание существующих данных относительно природы полипептидных цепей, развернутых в отсутствие денатуранта.

Заявление о значимости Белки могут принимать неупорядоченный ансамбль либо до сворачивания, либо как часть своей функции.Моделирование и исследования резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) часто описывают эти неупорядоченные конформации как более компактные, чем состояние полностью случайной катушки, в то время как исследования малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) указывают на расширенный ансамбль, близко приближающийся к размерам, ожидаемым для случайных катушек. катушка. Устранение этого несоответствия позволит более точно прогнозировать фолдинг и функцию белка. Здесь мы согласовываем эти взгляды, показывая, что добавление обычных флуорофоров FRET уменьшает видимые размеры неупорядоченного белка.Подробный анализ обоих методов, наряду с учетом умеренного количества индуцированного флуорофором сокращения, демонстрирует, что неупорядоченные и развернутые белки часто остаются хорошо сольватированными и в значительной степени расширяются в отсутствие денатуранта, свойства, которые предположительно минимизируют неправильное свертывание и агрегацию.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1–4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, внутренне неупорядоченные белки (IDP) и регионы (IDR) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3–9) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить.Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ подвергаются уплотнению в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое уплотнение будет иметь большое значение для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ. Более того, понимание степени коллапса в неупорядоченных ансамблях имеет глубокие последствия для разработки реалистичного моделирования сворачивания белков и интерпретации измерений SAXS и FRET (10, 11).

Наше текущее понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли данная полипептидная цепь складываться, принимать свернутый, но неупорядоченный ансамбль или вести себя как расширенное, полностью сольватированное случайное блуждание с самоизбеганием (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных. . Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями химических денатурантов, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях все согласны с тем, что белки ведут себя как SARW, что соответствует показателю Флори (ν), равному 0.60 в соотношении R _g ∝N ^ν (где R _g = радиус инерции и N = длина полипептидной цепи). Напротив, консенсус отсутствует в отношении поведения неупорядоченных полипептидных цепей при более низком денатуранте или без него. В частности, в то время как многочисленные FRET (18–21, 25–35) и вычислительные исследования (18–24, 36) утверждали, что расширенный неупорядоченный ансамбль, наблюдаемый при высоком денатуранте, разрушается при низком денатуранте или без него (ν <0,5) (12– 24), почти столь же многочисленные исследования SAXS сообщают об отсутствии или лишь незначительном коллапсе в тех же условиях (11, 37–42).

Разнообразные недавние исследования пытались примирить это широко признанное и, казалось бы, важное несоответствие ( Fig. 1A ). Например, применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей уменьшило денатурантную зависимость полученных FRET расстояний ( Рис. 1A, нижний ) (41, 43–45). Аналогичным образом улучшенный анализ данных SAXS свидетельствует о незначительном сокращении, когда концентрация гидрохлорида гуанидина (Gdn) падает ниже 2 M ( рис.1A, нижний ), что еще больше снижает очевидное несоответствие между двумя методами (46, 47). Тем не менее, значительные расхождения между этими двумя методами сохраняются, даже когда одни и те же процедуры используются для анализа одного белка с помощью SAXS и FRET ( Figs. 1A-B, S1 – S2; Movie S1 ).

Рис. 1. Новый анализ уменьшает, но не устраняет несоответствие между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET.

На всех панелях результаты SAXS показаны черным цветом; Результаты FRET показаны красным.( A ) Данные R17 SAXS и FRET (из (44)). Вверху, сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. Дно, данные SAXS и FRET соответствуют с использованием нашего нового метода анализа MFF (46). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы. ( B ) Профили SAXS для R17 (слева, взяты из (44)) и N98 (справа, взяты из (43)), согласованные с MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений v, взятых из аналогичного анализа FRET данные.( C ) Тенденции гидрофобности (Кайт-Дулиттл) в зависимости от ν в воде для данных SAXS для складываемых последовательностей белков подбираются путем применения MFF к опубликованным данным (43, 46, 52–67). Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в (31) для опубликованных данных (31, 43). Красная линия тренда для результатов FRET взята из (31). Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. Вверху, гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из (46)). ( D ) Кумулятивные распределения ν для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных на (C).

Чтобы всесторонне сравнить результаты недавних SAXS и FRET анализов IDP, мы собрали опубликованные наборы данных для множества неупорядоченных белков ( Рис. 1C-D; Таблица S3 ). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF), исследования SAXS неизменно находят ν> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как ν, полученное из исследований FRET, обычно оказывается ниже значения случайного блуждания, равного 0,50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение в 0,09 является существенным, учитывая, что весь диапазон ν изменяется только от 0.От 6 (для SARW) до 0,5 (для случайного блуждания без самоизбегания) до 0,33 (для идеальной сферы; несколько выше для несферических компактных состояний). В целом, результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP (белковоподобного состава) более расширены, чем случайное блуждание без самоизбегания, тогда как FRET предполагает иное ( Fig. 1D ).

Приведенные выше и другие аналогичные результаты побудили нас и других рассмотреть факторы, которые могут способствовать стойкому расхождению между взглядами на ВПЛ на основе SAXS и FRET (36, 40, 43, 48).Одна альтернатива, обозначенная здесь «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к изменению обычно фиксированной связи между R _g и расстоянием между концом полипептидной цепи (R _ee). В частности, для гомополимера, использующего SARW, соотношение G = (R _ee / R _г) ², как ожидается, будет зафиксировано на уровне 6,3 независимо от длины полимера. Однако недавнее моделирование показывает, что, в отличие от гомополимеров, это соотношение может значительно варьироваться для гетерополимеров (36, 40, 43, 44), при этом такое «разделение» предлагает возможное объяснение расхождения между SAXS (который измеряет R _g) и FRET (который измеряет R _ee).Напротив, вторая гипотеза, обозначенная в данном документе как «гипотеза взаимодействия флуорофора», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных красителем. искусственно сжиматься (10, 46, 48, 49).

Чтобы обратиться к этим гипотезам, мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения модифицированных флуорофором IDP в присутствии и в отсутствие модификации красителя.Таким образом, мы обнаруживаем, что мечение флуорофорами, обычно используемыми для исследований FRET, изменяет конформационный ансамбль, заселенный в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные с помощью SAXS, на 10-20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого сокращения достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET. Параллельно мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также уплотняет этот иначе SARW полимер (10), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (43).Мы также показываем, что SAXS может извлекать R _g, ν и R _ee с точностью лучше 3% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти модели достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подгруппы конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных. Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Мечение флуорофором вызывает коллапс сильно расширенного ансамбля

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия флуорофора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же IDP при сайт-специфической модификации одной или двумя копиями Обычно используется краситель FRET Alexa488. Мы выбрали этот краситель, потому что он относительно гидрофильный (44), и поэтому считается, что он с меньшей вероятностью образует взаимодействия, которые могут изменить конформационный ансамбль, чем любой из других широко используемых флуорофоров FRET.В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (50). Чтобы получить модифицированный моно-красителем белок, мы ввели остаток цистеина в положение 117 и модифицировали его соответствующим тиол-реактивным вариантом Alexa488 (PNtC-Alexa488). Чтобы получить белок, модифицированный парой красителей, мы ввели цистеины в положения 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). Алкилирование использовали для получения не содержащих красителей конструкций (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd), которые мы использовали в качестве контролей, в дополнение к немодифицированному родительскому белку (PNt).

Добавление Alexa488 уменьшает измеренные с помощью SAXS размеры IDP как в водных, так и в промежуточных денатурирующих условиях ( рис. 2A, таблица S1 ). В частности, R _g и ν уменьшаются почти в два раза для PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt ( Рис. 2B; Таблица S1 ). Эти данные указывают на то, что мечение с помощью Alexa488 приводит к усиленному сокращению конформационного ансамбля PNt, подразумевая, что стабилизация опосредованных флуорофором взаимодействий внутри конформационного ансамбля IDP.Следует отметить, что в то время как немеченый белок в 2 M Gdn находится в хорошем состоянии растворителя (ν> 0,5), при этом взаимодействия белок-белок слабее, чем взаимодействия белок-растворитель, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта. . Величина этого зависящего от денатуранта расширения цепи качественно подобна наблюдаемой FRET для множества других белков, что согласуется с общим происхождением ( Fig. 1B ) (43, 44).Мы также наблюдали зависимое от флуорофора уменьшение среднего R _g и ν для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 (, рис. 2, ). Этот результат указывает на то, что конформационный ансамбль PNt подвержен влиянию взаимодействий флуорофор-белок, а не только взаимодействий флуорофор-флуорофор. Следует отметить, что это сокращение происходит, несмотря на тот факт, что стационарная анизотропия флуоресценции PNtCC-Alexa488 составляет 0,11 и 0,08 в 0 и 2 M денатуранте, соответственно (, таблица S2 ), ниже порога, обычно используемого для обозначения свободного вращения. белковых красителей (43, 51).

Рис. 2. Добавление Alexa488 изменяет рассеяние PNt.

(A) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-Alkylated (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, красный) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, синяя) в 0,15 M KCl, 2 M Gdn, и 4 млн гдн. Результаты для алкилированных PNt неотличимы от PNt дикого типа, но существуют значительные различия для PNt, меченных одним (синим) или двумя (красным) флуорофорами Alexa488. (B) R _g и ν как функция концентрации Gdn.Серые кривые воспроизведены из предыдущего анализа PNt дикого типа (46).

Таким образом, кажется, что добавление даже относительно гидрофильных флуорофоров, обычно используемых для измерений FRET, может значительно влиять на размеры неупорядоченных полипептидных цепей (43, 44, 51).

Размеры ПЭГ не зависят от концентрации полимера

В более раннем исследовании мы сообщали, что добавление Alexa488 / 594 к ПЭГ приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (10), аналогичному тому, что наблюдается при измерениях FRET развернутых белков.Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, замаскировали то, что в противном случае было бы денатурант-зависимыми изменениями в R _g (43). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров полимера (, рис. 3, ). Точно так же при всех условиях мы наблюдаем показатель Флори, равный 0.60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта. Таким образом, гипотеза взаимодействия флуорофоров остается простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, наблюдаемых для PEG, меченного флуорофором (10).

Рис. 3. Профили SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта.

(A) Безразмерные графики Кратки для PEG 24 кДа при 0,5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0-4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG.Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали. (B) R _g и ν как функция концентрации Gdn для 0,5 и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров

В совокупности приведенные выше наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению его конформационного ансамбля, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET.Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что разделение гетерополимера также вносит вклад в расхождение SAXS-FRET. Чтобы изучить, как состав и структура аминокислотной последовательности могут изменить профиль SAXS, и проверить нашу способность извлекать информацию из таких отклонений, мы использовали моделирование полипептидной цепи на уровне Cβ (46), чтобы смоделировать рассеяние для развернутых ансамблей из 50 белковых последовательностей из 250 последовательностей. 650 остатков, случайно выбранных из PDB. Мы рассматривали каждую последовательность как бинарную гидрофобную / полярную (HP) цепь, где единственные благоприятные взаимодействия происходят между атомами Cβ алифатических и / или ароматических остатков.Для каждой из 50 последовательностей использовали 30 различных сил взаимодействия Cβ. Это моделирование дало диапазон отклонений от G (ν), полученных из моделирования гомополимеров ( рис. S4A ). Из 1500 результирующих ансамблей мы определили R _g, ν и R _ee как непосредственно из атомных координат моделируемого ансамбля, так и путем подбора гидратированного профиля SAXS (с добавленными реалистичными случайными ошибками) каждого ансамбля с использованием нашего MFF. Предполагаемое расстояние от конца до конца (R _ee ^inf) было определено с использованием соотношения R _ee ^inf (R _g, ν) = G (ν) ^1/2 * R _g, где G (ν) была получена путем моделирования гомополимеров.

По сравнению с истинными значениями, рассчитанными на основе координат атомов, аппроксимации, полученные с использованием наших значений выхода MFF для R _g, ν и R _ee со средним абсолютным отклонением всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å, соответственно, что соответствует средней абсолютной ошибке 3%, 2% и 4% ( Fig S3 ). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более протяженных конформаций с ν> 0,54 погрешность составляет ~ 2%.

Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор MFFhet, используя моделирование гетерополимеров, описанное выше.Применение этого слегка модифицированного MFF снижает погрешности в подогнанных R _g, ν и R _ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% средней абсолютной ошибки ( Рис. 4A- С ). Эти результаты демонстрируют, что анализ SAXS возвращает точные значения R _ee в дополнение к R _g и ν, даже для неупорядоченных гетерополимеров.

Рис. 4. Подгонка смоделированных данных SAXS к реалистичным последовательностям гетерополимеров демонстрирует, что профили SAXS являются надежным показателем R _g, ν и R _ee, а также информируют о степени неоднородности.

( A-C ) Сравнение R _g, ν и R _ee, рассчитанных на основе координат моделирования HP-модели, по сравнению с нашим MFFhet (R _g, ν) с профилями SAXS со случайно добавленными экспериментальными ошибками. D ) Отклонения в распределении наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо смешанными паттернами HP (полученными путем подбора наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R _{| i – j |} от разделения последовательностей, | i – j |, где | i – j |> N / 2). E ) Влияние Δν _end при различных значениях ν. F ) Подбор экспериментальных данных для MFF (R _g, ν, Δν _конец) демонстрирует, что мечение флуорофора и образование петли через дисульфидные связи в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах

MFF _het точно определяет габаритные размеры неупорядоченных гетерополимеров. Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами HP ( рис.S4 ). Эти различия можно увидеть на графике распределения внутримолекулярных расстояний, где наклон на разделительных расстояниях | i – j |> N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение ν ( Рис. 4D ) . Мы определяем изменение наклона как Δν _конец ( Рис. 4D ). Отрицательные значения Δν _конец коррелируют с большим количеством гидрофобных остатков на концах полипептидных последовательностей ( рис. 4D, S4C ) и с отклонениями в G (ν) ( рис.S4A ) (R ² ~ 0,84). Профиль SAXS наиболее чувствителен к Δν _end при низком qR _g ( Рис. 4E ).

Чтобы извлечь эту дополнительную информацию из данных SAXS, мы сгенерировали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF (R _g, ν, Δν _end) ( Рис. 4E-F; Movie S2 ). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn ( рис.4F ). Δν _конец уменьшается с ~ 0 для PNt до ~ -0,1 для PNtCC-Alexa488 и PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на N-конце цепи. Эти данные демонстрируют, что для неупорядоченных полимеров МУРР чувствителен к отклонениям гетерополимера (, рис. 4E-F ), но при этом может точно измерять R _g и ν ( рис. 4A-C ).

Обсуждение

Маркировка с помощью Alexa488, флуорофора, обычно используемого для измерения FRET, может изменить конформационный ансамбль неупорядоченного белка, уменьшая R _g и ν, даже когда анизотропия флуоресценции низка относительно принятых пределов для свободного вращения (43, 51).В сочетании с предыдущими исследованиями (10) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом, что неупорядоченные цепи подвергаются умеренному расширению в денатурантах (46), и улучшенными методами извлечения значений R _g из данных FRET, обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий между SAXS и FRET по размерам неупорядоченных белки.

В соответствии с нашими выводами об эффектах, вызванных флуорофором, другие обнаружили, что молекулярные размеры, определяемые FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные флуорофоры предполагают более коллапсированное состояние (44).Полноатомное моделирование молекулярной динамики с парой флуорофоров Alexa488 / 594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (68). Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы smFRET как от ДНК, так и от PEG, которые часто называют «спектроскопическими линейками», зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (49). Однако в явном несогласии с нашими данными Fuertes et al . (43) провели измерения SAXS на пяти IDP с Alexa488/594 и без них и пришли к выводу, что, в среднем , изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными.Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном всех возможных значений ν. В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, ν _{без метки} -ν _метка = 0,08, 0,03, 0,03, -0,02, -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02, -0,08 при анализе с использованием наших процедур. ). То есть более половины этих IDP демонстрируют индуцированное флуорофором сокращение, аналогичное по величине сокращению, которое мы наблюдаем для меченого флуорофором PNt в воде.Вместе эти данные предполагают последовательную картину индуцированного флуорофором сокращения, способствующего различиям в величине и денатурантной зависимости R _g, полученной с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, вносит вклад в расхождение между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорционального отношения между R _g и R _ee, возникающие при переходе от гомополимеров к гетерополимерам (43). В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если повторно взвесить ансамбль (т.е., вычисляет R _g с использованием только подмножества конформаций), многие возможные значения R _ee согласуются с любым заданным R _g (и наоборот). Однако вместо того, чтобы выбирать подгруппу для соответствия данным, мы выбрали альтернативный подход (46). Вначале мы создаем физически правдоподобные ансамбли и проверяем, соответствуют ли они данным в целом. Мы обнаружили, что MFF, полученный из наших ансамблей, точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R _g), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры.Поскольку мы можем определить значения R _g и R _ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF.

Этот MFF несовершенен в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R _{, g} и ν. Но ошибка для этих двух параметров очень мала по сравнению с их истинными значениями ( Рис. 4A-C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода.Из этого результата мы заключаем, что SAXS хорошо подходит для экстракции как R _g, так и R _ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями. Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; это, однако, усиливает осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь, и ранее (46), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( Таблицы S1, S3 ).Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям. Водорастворимые, хорошо уложенные последовательности белков обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (69). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS. Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашей MFF ( рис.4Д-Ф ). Большие отклонения могут возникать для некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например, блок-сополимеры) и / или в условиях скопления, которые могут выполнять определенные функции (70, 71).

Эти результаты и анализ, представленные здесь, демонстрируют, что вода является хорошим растворителем для многих складываемых белковых последовательностей, делая их расширенными с ν ≥ 0,54. Это свойство, вероятно, полезно для клетки, поскольку помогает уменьшить неправильную укладку и нежелательные ассоциации, одновременно облегчая синтез и транспорт белка.Более того, многие белки сворачиваются (как в термодинамическом, так и в кинетическом смысле) даже в присутствии умеренных количеств денатурантов, а некоторые даже в 6 M Gdn (42, 72), где ν ~ 0,6. Следовательно, сворачивание — это надежный процесс, который критически не зависит от качества растворителя, пока структура нативного белка стабильна по сравнению с развернутым ансамблем.

Материалы и методы

Очистка белка

PNtCC и PNtC были экспрессированы в E. coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (46, 50, 73), со следующими модификациями.После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно упаковывали в 50 мМ Трис, pH 7,2, с 50 мМ ß-меркаптоэтанолом (ßME). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ ßME.

Алкилирование

Очищенный PNtCC или PNtC (70 мкМ) в 50 мМ Трис, pH 8, 5 мМ ЭДТА восстанавливали 5 мМ ТСЕР в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании. Алкилирование инициировали добавлением 10 мМ йодацетамида в воде. Конструкции PNt инкубировали 30 мин при комнатной температуре при перемешивании в темноте.Реакцию алкилирования гасили добавлением 20 мМ свежего DTT. Избыток реагентов удаляли с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 16/60 S200). Эффективность алкилирования (100%) определяли масс-спектрометрией (МС).

Alexa488, маркировка

конструкций PNt были сокращены, как указано выше. Малеимид Alexa488 C5 (ThermoFisher Scientific) ресуспендировали в ДМСО до 5 мг / мл и добавляли к восстановленному белку по каплям при перемешивании до конечного соотношения флуорофор: цистеин 5: 1. Реакция протекала в течение ночи при 4 ° C при перемешивании в темноте.Свободный флуорофор отделяли от меченого флуорофором белка с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 16/60 S200), постоянно защищая от света. Эффективность маркировки (100% для PNtCC;> 50% для PNtC) определяли масс-спектрометрией.

Стационарная анизотропия

Измерения стационарной анизотропии были выполнены на флуорометре QM-6 T-формата (Horiba) при комнатной температуре в 50 мМ Tris pH 7,5 и 2 M Gdn, где указано. Образцы, содержащие 1 мкМ Alexa-488, возбуждали вертикально поляризованным светом с длиной волны 494 нм.Анизотропия (r) рассчитывалась с использованием излучения при 516 нм по формуле

Где G — поправочный коэффициент прибора. G рассчитывали по испусканию free-Alexa488 на длине волны 516 нм после возбуждения горизонтально поляризованным светом 494 нм по уравнению

SAXS

Данные были собраны на линии пучка BioCAT в Advanced Photon Source (Аргоннская национальная лаборатория) с использованием колонки GE Lifesciences Superdex 200 SEC с рассеянием, представленным как q = 4π sin θ / λ , где 2θ — угол рассеяния, а λ — длина волны рентгеновского излучения (1 Å).

Код для моделирования и подбора данных рассеяния

Код и связанные файлы, необходимые для моделирования и анализа, доступны на сайте www. (будет добавлено перед публикацией). Кроме того, наш веб-сервер http://sosnick.uchicago.edu/SAXSonIDPs доступен для согласования данных SAXS с нашим MFF (ν, R _g).

Моделирование и создание MFF

Расчеты были выполнены в Исследовательском вычислительном центре Чикагского университета с использованием версии нашей программы молекулярной динамики Upside ( arXiv: 1610.07277 ), модифицированный для взаимодействий на уровне Cβ, как это было сделано ранее (46).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти за помощь в измерениях МУРР и Мэтью Чэмпиона за помощь в масс-спектрометрических экспериментах. Эта работа была поддержана грантом R01 GM055694 (TRS) Национального института здравоохранения (NIH), Фондом У. М. Кека (PLC) и грантами NSF GRF DGE-1144082 (JAR) и MCB 1516959 (CR Matthews). Использование Усовершенствованного источника фотонов, пользовательского объекта Управления науки, находящегося в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, поддерживалось Министерством энергетики в рамках контракта №DEAC02-06Ch21357. Этот проект был поддержан NIH (2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18).

Philtone Guitar Company — Radius and Fret Out

Радиус накладки грифа влияет на выход изгиба при поворотах. Чем ниже действие, тем более плоским должен быть радиус, чтобы учесть шаг + изгибы 1-й струны над 12-м ладом.

Это только высокая E, растягивающаяся на 1 ступенчатых виражах выше 12-го лада (обычное наблюдение для круглых радиусов)? Проблема, приводящая к выходу из лада с высоким E, заключается в том, что, когда изгиб заставляет струну перемещаться по грифу, она достигает пика радиуса.Часто (несмотря на проблемы с отрывом и рельефом) одни и те же изгибы на B и G достигают высоты звука в точке за пиком радиуса, так что вершина следующего предшествующего лада отходит от места расположения струны к бриджу. Таким образом, решение состоит в том, чтобы избегать пика радиуса во время игры. Сгибайте разные струны на разных ладах и обратите внимание, как струна движется по отношению к следующему предыдущему ладу.

Если вышеописанная ситуация описывает ситуацию, и вы не хотите менять гриф на более плоский радиус, вы можете либо 1) избегать изгибов на высокой E выше 12-го лада, или 2) попробовать установку старой школы, где высокая E Струны си расположены выше ладов, чем струны G и D.Чем выше струна на мостике, тем дальше она будет от вершины следующего предшествующего лада. Эти настройки ничего не стоят.

В противном случае — если вы хотите, чтобы ваше действие было ниже, чем позволяют вышеуказанные настройки, или вы хотите часто сгибать высокий E — вы можете подумать о том, чтобы иметь более плоский радиус на более высоких ладах, либо разумно выравнивая, либо изменяя радиус FB и повторно, либо используя другая шея с более плоским радиусом. Эти настройки могут быть дорогими.

Радиус здесь важен, и поэтому он также не подходит — шейке нужно немного в нужном месте.Если другие струны выходят из строя, влияющими факторами являются слишком маленький зазор, слишком большое облегчение или недостаточное отклонение.

Если вам нужен низкий строй — например, на расстоянии 0,050 дюйма от низа высокой струны E до вершины 12-го лада (лад на 1-м, чтобы удалить гайку из измерения), и вы будете гнуть — я предлагаю с радиусом не менее 12 дюймов на последнем ладу (можно добавлять с 1-го лада). Радиус 9,5 или 10 дюймов все еще может подавиться на высоком E-изгибе на одну ступень + выше 12-го лада.Для справки попробуйте радиус 9,5 дюймов некоторых крыльев Am Std (хотя иногда радиус на вершинах ладов более округлый, чем у FB из-за неточностей нивелирования) или радиус PRS 10 дюймов (они согласуются). Высота E 0,060 дюйма обычно подходит для радиуса 10 дюймов, если рельеф и спад правильные.

Выравнивание желаемого рельефа / спада имеет смысл только в том случае, если имеется достаточно материала для ладов, который можно сэкономить для ваших ладовых предпочтений. Некоторые люди предпочли не следовать радиусу через проблемные лады, а вместо этого выровнять только пик радиуса под средними струнами (по сути, там, где нота умирает — меня не волнует этот подход, поскольку он кажется мне неровным).Если вы хотите увидеть, сколько материала будет удалено, чтобы изменить существующий радиус ладов, возьмите циркуль и наложите радиус 7,25 дюйма и радиус 9,5 дюйма на 2 дюйма и обратите внимание на разницу в средней точке. Более плоский радиус потребует еще большего удаления материала. Средний лад, стандартный винтажный размер RI обычно составляет 0,040 дюйма в высоту, иногда ниже из-за окончательного наращивания, предварительного выравнивания или износа.

Если вы выберете refret / reradius, обратитесь к специалисту по ремонту, с которым вам будет удобнее всего.Качество лепнины и то, насколько она соответствует вашему применению и предпочтениям, сделают или сломают гитару для вас. Тебе должно быть комфортно.

Насколько я понимаю, радиус 7,25 дюйма был традиционным для Fender и до Gibson Epiphone, а радиус ~ 9 дюймов — для старых электромобилей Gibson (Гибсоны различаются, когда дело доходит до радиуса), и считалось, что он удобен для гладящей руки. способствует изгибу пальцев (тяжелые струны и отсутствие больших изгибов были в порядке вещей, хотя многие плоские вершины имеют более плоский радиус, 16 дюймов Мартина и т. д.).Классические гитары имеют гораздо более плоский радиус (от 20 дюймов до плоского), чтобы облегчить выбор руки (плоская плоскость, по которой можно перемещаться, чтобы помочь отточить технику игры в руке).

Лично я предпочитаю составной 10-12-дюймовый радиус для электрогитары — я считаю, что это хороший баланс между двумя руками и аккордами / арпеджио по сравнению с техникой одиночных нот с достаточно низким действием (1-я струна, нижняя часть струны 0,050 дюйма до верхняя часть 12-го лада, зарезанная на 1-м ладу для снятия гайки с измерения, с правильным ослаблением 0,010 °.012 ”).

Праймер для микроскопии молекулярных выражений

: специализированные методы микроскопии — FRET

Микроскопия с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET)

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением.Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора возбужденного состояния ко второму хромофору в непосредственной близости.Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному хромофору безызлучательным образом посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергообмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся с той же частотой. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредуется испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора. Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофора разделены расстоянием примерно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами. Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (Рисунок 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET.На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (Рисунок 1 (b)) представлена зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка. Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофоры. Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках.Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET. Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков.Если два белка, один из которых мечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцепторной флуоресценции (GFP).

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках.В дополнение к исследованию взаимодействий белков-партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору, акцептору.В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь. Теория, предложенная Теодором Ферстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Ферстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3). Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора.Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между излучением донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками.Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3). Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Для того, чтобы произошла резонансная передача энергии, должны быть выполнены несколько критериев.В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Ферстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их. Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор примерно 10 нанометрами.На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий. В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансного переноса энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти.Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) переноса энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора. Согласно теории Ферстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

K _T = (1 / t _D) [R ₀ / r] ⁶
, где R (0) — критическое расстояние по Ферстеру , t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры.Критическое расстояние Ферстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость переноса равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора. Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.
Концептуально критическое расстояние Ферстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии. Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц.Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:
R ₀ = 2,11 x 10 ^-2 [k ² J (l) h ^-4 Q _D] ^1/6
, в котором k-квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между диполями перехода донора и акцептора, Дж (l) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и поглощения акцептора (с длина волны, выраженная в нанометрах), ч представляет собой показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.
Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , посредством уравнение:
r = R ₀ [(1 / E _T) — 1] ^1/6
и E (T) оценивается как
E _T = 1 — (t _DA / t _D)
, где t (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (не путем измерения времени жизни).
Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов переходов донора и акцептора и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.
На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве энергии резонанса флуоресценции. передаточная пара. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.
Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в поворот зависит от k -квадрат, J (l) , h и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена серия экспериментально измеренных критических расстояний Ферстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.
Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости от шестого корня, R (0) не сильно зависит от вариаций J (l) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.
Критическое расстояние Frster для обычных пар донор-акцептор RET

Белковая пара	Максимум возбуждения донора (нм)	Максимум эмиссии акцептора (нм)	Квантовый выход донора	Коэффициент молярной экстинкции акцептора	Яркость фёрстера
EBFP2-mEGFP	383	507	0.56	57,500	4,8	1: 2
ECFP-EYFP	440	527	0,40	83,400	4,9	1: 4					528	0,62	92,200	5,4	1: 2
MiCy-mKO	472	559	0,90	51,600					492	528	0.85	92,200	5,1	1: 1
CyPet-YPet	477	530	0,51	104 000	5,1	1: 4,5							610	0.60	72,000	5.1	2.5: 1
Venus-mCherry	528	610	0,57	72000				9099	528	581	0.57	138,000	5,9	1: 2
Venus-mPlum	528	649	0,57	41,000	5,2	13: 1	13: 1

Донор	Приемник	Frster Расстояние (нанометров)
Триптофан	Дансил	2.1
IAEDANS (1)	ДДПМ (2)	2,5 — 2,9
BFP	DSRFP	3,1 — 3,3
Дансил	FITC	3,3 — 4,1
Дансил	Октадецилродамин	4.3
CFP	GFP	4,7 — 4,9
CF (3)	Красный Техас	5,1
Флуоресцеин	Тетраметилродамин	4,9 — 5,5
Cy3	Cy5	> 5.0
GFP	YFP	5,5 — 5,7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5,7
Родамин 6G	Малахитовый зеленый	6,1
FITC	Тиосемикарбазид эозина	6.1 — 6,4
B-фикоэритрин	Cy5	7,2
Cy5	Cy5.5	> 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина 40007 (4) , 4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( k -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Ферстера верна и применима к измерению расстояний, эта переменная по-прежнему вызывает споры.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно даются для предполагаемого значения k -квадрат, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора путем вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимается значение 0,67. применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение k в квадрате становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации k в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений k -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если не невозможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием спектроскопии резонансного переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит.С другой стороны, крайние значения ноль и 4 для k -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, условия, которое вряд ли будет достигнуто. Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( k -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

к ² = (cos q _T — 3cos q _D cos q _A) ² = (sin q _D sin q _A cos f — 2cos q _D cos q _A) ²
, где q (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, q (D) и q (A) — углы между этими диполями и вектором соединяющий донор и акцептор, а f — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.
Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (в шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.
Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены с помощью FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, вычисленные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.
Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по его результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод изучения пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.
Применение методов FRET в оптической микроскопии
Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований к флуорофорам, образцу и режиму (режимам) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для микроскопии FRET (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимумом сквозного спектрального шума. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.
Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.
Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена на Рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе для исследования и записи ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. Стандартная камера CCD с охлаждением Пельтье прикреплена к тринокулярной головке микроскопа для получения широкопольной флуоресценции и захвата изображений в светлом поле.
Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рисунке 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.
Основываясь на фундаментальных принципах явления, следует учитывать ряд важных практических моментов, когда измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии проводятся с помощью оптического микроскопа:
Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным.Распространенным источником ошибок в измерениях FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
Донор должен проявлять низкую поляризационную анизотропию, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации ( k -квадрат). Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
При использовании методов маркировки антител биологическая активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами, не должна изменяться. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.
Чтобы феномен флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставил значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации.Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов. Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам.Когда условия подходят для возникновения резонансной передачи энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).
Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET.Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора. Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии.Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным флуоресцентным резонансным переносом энергии.
Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения. Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора.На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям. Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров.Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.
Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом клеточной гибели, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное снижение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад донорская эмиссия). Фильтр FRET (рисунок 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансной передачи энергии между двумя белками
.
Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны для оптического микроскопа.Основная цель микроскопических исследований — получить изображения с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.
Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.
Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии сокращает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии.Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.
Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания акцепторной молекулы.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.
Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы донорных, FRET и акцепторных фильтров предназначены для выделения и максимизации трех специфических сигналов: донорной флуоресценции, акцепторной флуоресценции, относящейся к FRET, и непосредственно возбужденной акцепторной флуоресценции, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.
На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектрального просвечивания) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть для достижения количественных результатов в экспериментах по резонансному переносу энергии флуоресценции. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют собой коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.
Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.
Время жизни флуоресценции ( t ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) задается уравнением:
I (t) = I ₀ эксп (-t / t)
, где I (0) — это начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — это интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( t ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.
Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.
Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощить возбужденное состояние. резонансной передачей энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.
Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсных , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением; рисунок 10 (b) )) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получается путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.
На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( f ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.
Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны к выполнению, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.
Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( t (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( t ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.
В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.
Выводы
В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия между биомолекулярными объектами in vivo .Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.
Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором и расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии посредством измерений в установившемся режиме, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явления, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.
Несмотря на то, что для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Тем не менее, несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.
Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.
Соавторы
Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.
Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Мэрилендский университет и Институт биотехнологии Мэрилендского университета (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.
Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Источники Пола Дирака, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.
НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.
© 1998-2019, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения правообладателей.Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми Правовыми положениями и условиями, изложенными владельцами.
Этот веб-сайт поддерживается нашей командой

по графике и веб-программированию
в сотрудничестве с оптической микроскопией в Национальной лаборатории сильного магнитного поля
.
Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 13:19
Счетчик доступа с 26 ноября 2004 г .: 82123
Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов,

используйте кнопки ниже для перехода на их веб-сайты: .

Лада в приора: LADA Priora седан – Запись на ТО, Скачать руководство по эксплуатации – Официальный сайт LADA

Lada Priora — цены и характеристики, фотографии и обзоры

АвтоВАЗ объяснил прекращение выпуска Lada Priora :: Бизнес :: РБК

Lada Priora уезжает в историю – Бизнес – Коммерсантъ

Официальный Лада Приора Клуб | LADA Priora Club

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Основные принципы FRET

Факторы, влияющие на измерения FRET

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Чувствительное излучение

Акцептор фотообесцвечивания

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)

Спектральная визуализация

Построение изображения поляризационной анизотропии

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

Выводы

Frontiers | FRET в биофизике мембран: обзор

Введение

Феноменологические применения FRET в мембранах

Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок

FRET с улучшенной диффузией

Homo-FRET против Hetero-FRET

FRET под микроскопом

Заключение

Заявление о конфликте интересов

Благодарности

Список литературы

Наблюдается аномальная передача избыточной энергии с помощью нескольких приемников FRET

Абстрактные

Фон

Методология / основные выводы

Выводы / Значение

Введение

Результаты

Обсуждение

Материалы и методы

Конструкция клона

Культура клеток и трансфекция

Многофотонная микроскопия

sRET Анализ

Анализ E-FRET

Флуоресцентная пожизненная микроскопия

Спектр излучения

Измерения затухания анизотропии многофотонной флуоресценции

FRET скорость передачи и вычисления ошибок

Прогнозы кинетической модели и распространение ошибок

Благодарности

Вклад авторов

Ссылки

Зафиксированные датчики FRET обнаруживают локальную активацию каспаз до дегенерации нейронов | Молекулярная нейродегенерация

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка

РЕФЕРАТ

Результаты

Мечение флуорофором вызывает коллапс сильно расширенного ансамбля

Размеры ПЭГ не зависят от концентрации полимера

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах

Обсуждение

Материалы и методы

Очистка белка

Алкилирование

Alexa488, маркировка

Стационарная анизотропия

SAXS

Код для моделирования и подбора данных рассеяния

Моделирование и создание MFF

Благодарности

Philtone Guitar Company — Radius and Fret Out

: специализированные методы микроскопии — FRET

Микроскопия с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET)

Вводные понятия

Критическое расстояние Frster для обычных пар донор-акцептор RET

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой