Лада 2019: новые модели и успехи Бренда

Спектры излучения датчика Glu ^[+Halo] ( a ), не иммобилизованного и ( b ), иммобилизованного на смоле HaloLink ^® . Спектры были получены после возбуждения FRET-донора mTurquoise2 при λ _ex  = 425 нм (± 9 нм) в присутствии (черная кривая) и в отсутствие (серая кривая) 1 M d-глюкозы. Интенсивность нормализована к излучению на длине волны 485 нм (λ 90 143 em 90 144 м, бирюзовый2)

По сравнению с другими методами иммобилизации для таких датчиков, такими как инкапсуляция, ориентированная на сайт иммобилизация с помощью HaloTag ^® превосходит ни гибкость, ни отрицательно влияет на доступность иммобилизованного датчика.В предыдущем исследовании аналогичный датчик d-глюкозы на основе FRET был инкапсулирован в частицы кремнезема, что значительно снизило интенсивность FRET [38]. Кроме того, биосенсор можно иммобилизовать непосредственно из неочищенного клеточного экстракта, что позволяет избежать трудоемкой и дорогостоящей хроматографической очистки белка [39].

Онлайн-применение иммобилизованного сенсора Glu

С сенсором Glu ^[+Halo] , ковалентно иммобилизованным на поверхности шариков Sepharose ^® , устойчивость сенсора к механическим воздействиям была значительно повышена , что было необходимым условием для применения этих шариков непосредственно в микробном культивировании (дополнительный файл 1: рисунок S6). В то время как иммобилизация решает проблемы стабильности, гашение среды CGXII остается. Кроме того, увеличение концентрации C. glutamicum также приводит к увеличению фона из-за аутофлуоресценции [40]. Чтобы преодолеть это, иммобилизованный датчик Glu ^[+Halo] был протестирован в среде M9, типичной среде для культивирования Escherichia coli [32]. Несмотря на снижение ΔR до 35%, изменение коэффициента FRET заметно (см. Дополнительный файл 1: рисунок S3).Как следствие, измерения в среде М9 можно было проводить с помощью датчика непосредственно в культивируемом пространстве, что облегчает онлайн-приложение.

Результаты онлайн-применения иммобилизованного сенсора Glu ^[+Halo] во время культивирования E. coli K12 MG1655 в среде M9 показаны на рис. 5. На протяжении всего культивирования контролировались оба флуоресцентных сигнала сенсора. с помощью BioLector ^® и рассчитывали отношение FRET (I _A /I _D ). Затем рассчитывали концентрацию внеклеточной d-глюкозы на основе отношения FRET и калибровки иммобилизованного датчика Glu ^[+Halo] в той же среде в той же цветочной пластине (см. дополнительный файл 1: рисунок S9 для калибровки). . За потреблением d-глюкозы можно было следить на протяжении всего эксперимента по культивированию (20 ч). Здесь датчик Glu ^[+Halo] имел диапазон обнаружения от 0,02 до 2 мМ (0,0036 и 0,36 г л ^-1 ). В соответствии с этим диапазоном, при истощении запасов d-глюкозы (через 18 ч) дальнейшее изменение FRET-сигнала обнаружить не удалось.Несмотря на то, что в среде не осталось d-глюкозы, биомасса продолжала увеличиваться, предположительно в результате избыточного метаболизма [41].

Соотношение FRET ( a ), истощение запасов глюкозы ( b ) и рост биомассы ( c ) в культивировании E. coli в среде M9, измеренные с помощью иммобилизованного биосенсора на основе FRET на смоле HaloLink ^® . Соотношение FRET использовалось для расчета текущей концентрации d-глюкозы на основе калибровки иммобилизованного датчика (см. дополнительный файл 1: рисунок S9)

Преимущество онлайн-измерения совпадает с недостатком, заключающимся в том, что оно ограничено определенным окном измерения, определяемым динамическим диапазоном датчика.В отличие от непрерывных измерений, где конечная концентрация d-глюкозы в образцах может быть адаптирована к аффинности сенсора, для онлайн-измерений требуются либо сенсоры с более широким динамическим диапазоном, либо другие сенсоры с соответствующей аффинностью, чтобы охватить более широкий диапазон концентраций целевого метаболита. . Аффинность сенсора d-глюкозы можно регулировать либо соответствующей аминокислотной заменой в глюкозосвязывающих белках [24, 42, 43], выбором альтернативных глюкозосвязывающих белков с более низкой аффинностью [44, 45], либо вставкой линкера последовательности [9, 20].Поскольку до сих пор не известно ни одного датчика на основе FRET с очень широким диапазоном обнаружения [7], можно было бы рассмотреть возможность комбинации нескольких датчиков d-глюкозы с разным сродством и FRET-пар, иммобилизованных на одном носителе, для расширения диапазона обнаружения.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Кевин Фрет, открытый гей-латиноамериканский трэп-исполнитель, застрелен в Пуэрто-Рико

Кевин Фрет, пуэрториканская звезда социальных сетей, объявивший себя первым открытым геем-латиноамериканским трэп-исполнителем, был смертельно ранен в Сан-Хуане рано утром в четверг, согласно в полицию и местные новости.

25-летний г-н Фрет ехал на мотоцикле по району Сантурсе около 5:30 утра, когда ему дважды выстрелили в голову и бедро, сообщила полиция. Его доставили в ближайшую больницу, где констатировали смерть.

Полиция еще не назвала имя застреленного человека в ожидании опознания тела, но менеджер г-на Фрета, Эдуардо Родригес, подтвердил его смерть в заявлении для Billboard.

Его смерть наступила на фоне всеобщего беспокойства по поводу преступности в Пуэрто-Рико; в среду топ Ф.Б.И. Чиновник заявил, что остров столкнулся с «кризисом насилия».

В статье, опубликованной в апреле, журнал Paper Magazine назвал мистера Фрета «первым пионером латинского трэпа, открытым геем». В том же месяце он выпустил сингл «Soy Así» или «I’m Like This».

Видео «Soy Así», которое было просмотрено более 500 000 раз на YouTube, начинается с того, что г-н Фрет в блестящем укороченном топе и облегающих брюках держит в руках винтовку (предположительно поддельную). В окружении женщин в откровенных нарядах он хвастается своей внешностью, макияжем и дизайнерскими нарядами и называет себя «реинкарнацией Фриды Кало».

«Я человек, которому все равно, что говорят другие», — сказал он журналу.

«Молодые геи или молодые лесбиянки, которые сейчас смотрят на меня как на образец для подражания, типа «вау, если он это сделал, и ему все равно, что говорят другие, я могу это сделать».

Латинский трэп зародился на Карибах в середине 2000-х годов, смешивая южный хип-хоп с местными звуками. Bad Bunny, Messiah и Ozuna — все они работали с Cardi B — являются одними из самых известных практиков.

В заявлении для Billboard Mr.Менеджер Фрета, г-н Родригес, сказал, что его клиент был «художником и мечтателем с большим сердцем».

«Его страстью была музыка, — добавил он, — и еще многое нужно было сделать».

В июле мистер Фрет снялся в клипе артиста Майка Дюрана на песню «Diferente». Были знакомые тропы — деньги, бикини — но внешний вид мистера Фрета, читающего рэп в радужной сетчатой ​​футболке в джакузи, а позже в белоснежной рубашке с блестящей короной и невероятно длинными ресницами — был, на самом деле, очень разные.

Сэми Немир Оливарес, пуэрториканский писатель и активист, проживающий в Нью-Йорке, сказал, что г-н Фрет олицетворяет надежду для таких людей, как он сам, которые столкнулись с издевательствами и преследованиями из-за своей сексуальной ориентации.

«Кевин Фрет представил освежающий взгляд на музыкальный жанр, который очень гомофобный и очень мачистистский», — сказал он.

Г-н Фрет использовал хвастовство и перформативность жанра, чтобы доказать инклюзивность, утверждал г-н Немир Оливарес.

«В Пуэрто-Рико это акт сопротивления», — добавил он.

Но не всегда все шло гладко. Г-н Фрет жестко отреагировал после того, как стал объектом гомофобных угроз в текстах песен конкурирующего артиста, что оставило некоторые сомнения в том, что его убийство было мотивировано ненавистью.

Полиция искала другого мужчину на мотоцикле, который был с мистером Фретом, когда его нашли, но быстро скрылся. О мотивах пока не сообщается.

Мистер Фрет тоже жил в Майами в последние месяцы. В июне ему предъявили обвинение в нанесении побоев после драки в районе Брикелл.Мистер Фрет сказал, что на него напали из-за его сексуальной ориентации.

У него было много подписчиков в Instagram, но в четверг не было видно ни одной публикации, что указывает на то, что он, возможно, удалил предыдущие публикации. Была только одна «история»: религиозное изречение, которое переводится как «Молись, расслабься и позволь Богу сделать все остальное».

Taylor 322ce 12-Fret 2019 Shaded Edge Burst с OHSC — Gerald Musique

Описание

Наша распорка V-класса придает дополнительную мощность, сустейн и сладость этому 12-ладовому Grand Concert с вырезом, расширяя его музыкальный диапазон.Нижняя дека и обечайки из черного дерева производят сильное звучание — даже в GC с небольшим корпусом — с мясистым акцентом на средних частотах и ​​мерцанием верхних частот, а верхняя дека из красного дерева добавляет нотку естественной компрессии, чтобы сгладить отклик сверху донизу. Комбинация грифа с 12 ладами, чуть более короткой мензуры (24-7/8 дюйма) и смещенного положения бриджа (ближе к центру нижней части) обеспечивает более тонкое ощущение от руки. Это отличный выбор для игроков, которые ценят комфорт компактной рамы.Благодаря удобному для микрофона голосу он также является отличным выбором для записи, а электроника ES2 обеспечивает чистый, насыщенный звук с усилением. Темная и землистая эстетика включает в себя затененную верхнюю часть из темного красного дерева, черную окантовку, полностью атласную отделку, черную накладку и небольшие ромбовидные вставки из итальянского акрила.

ХАРАКТЕРИСТИКИ:

• Распорка V-класса для улучшения интонации, сустейна и громкости
• Электроника Taylor ES2 со встроенным фазовращателем, регулировкой низких и высоких частот
• Сочетание экзотических пород дерева
• Дизайн с 12 ладами и вырезом для лучшего доступа к верхнему ладу
• Поставляется с жестким футляром

ХАРАКТЕРИСТИКИ:

Корпус

• Тип кузова: Grand Concert/OO
• Вырез: венецианский
• Верхняя древесина: Массив неотропического красного дерева
• Нижняя дека и обечайка: массив тасманского черного дерева
• Раскос: V-Класс Grand Concert с рельефным профилем
• Отделка корпуса: глянцевый верх, матовая задняя и боковые стороны
• Ориентация: правша

Шея

• Форма шейки: стандартный профиль Taylor
• Ширина гайки: 1. 75 дюймов (44,45 мм)
• Накладка на гриф: Натуральное западноафриканское черное дерево
• Гриф: тропическое красное дерево
• Длина шкалы: 24,84″
• Количество ладов: 18
• Отделка горловины: сатин

Электроника

• Звукосниматель/предусилитель: Да
• Торговая марка: Тейлор
• Конфигурация: Датчик, устанавливаемый за седлом, с регулируемыми датчиками
• Эквалайзер предусилителя: 2-полосный Объяснено выше
• Фильтр обратной связи: Фаза
• Тюнер: №

Прочее

• Накладка на переднюю бабку: натуральное западноафриканское черное дерево
• Колки: головка Taylor с прорезями и пуговицами из синтетической слоновой кости
• Бридж: Натуральное западноафриканское черное дерево
• Седло и гайка: микарта «волна»/графитовая гайка
• Количество струн: 6
• Особенности:
• Кейс: Роскошный жесткий кейс
• Аксессуары: Нет
• Страна происхождения: США

Межбазовый FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики. Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов оснований РНК FRET, состоящей из донора tC ^O и неэмиссионного акцептора tC _nitro . Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезируется и впервые включается в РНК. Эта пара FRET точно описывает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем наблюдения за переходом от A-формы РНК к Z-форме. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ. Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой процесс, при котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором.Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, можно получить информацию о структуре и/или относительном положении различных меченых донором и акцептором биомолекул в физиологических условиях in vitro или даже в живых клетках (2,3). FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и РНК-белковые комплексы, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4).Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одной молекулы с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для исследования совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния. Например, индуцируемое ионами сворачивание изгибов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6).Одним из способов повысить уровень информации, получаемой с помощью FRET в РНК-системах, было бы использование флуоресцентных аналогов оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например. tC ^O (9), тиено[3,4- d ]пиримидины ( ^th A, ^th C, ^th G и ^th U) (10) и изотиазоло[4,3 — d ]пиримидины ( ^tz A, ^tz C, ^tz G и ^tz U) (11), суррогат U с применением в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для исследования G-квадруплекса (13) и расширенных нуклеозидов РНК (xRNAs) (14). Однако FRET между основаниями был исследован только для ДНК с использованием неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC ^O – tC _nitro (15), qAN1–qA _nitro (8) и pA–qA _nitro ). (16)) или излучающий акцептор ( ^th dG–tC) (17). Использование излучающего акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и прямой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы излучения донора и акцептора значительно разделены.Однако большинство высокоэмиссионных FBA излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие излучений может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности в анализ FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции донора (или времени жизни) по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях FRET между основаниями в РНК с использованием пары tC ^O – tC _нитро FRET (рис. 1).Неэмиссионная акцепторная молекула tC _nitro впервые синтезирована и охарактеризована для использования в контексте РНК. В эталонном исследовании мы видим превосходное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК A-формы без существенных признаков структурного возмущения по сравнению с естественным дуплексом РНК A-формы, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования. структурные изменения внутри РНК с высокой точностью. Кроме того, общее использование межбазового FRET для исследования структурных изменений в РНК демонстрируется здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного FRET-донора tC ^O и неэмиссионного FRET-акцептора tC _nitro .

Рисунок 1.

Структура излучающего FRET-донора tC ^O и неэмиссионного FRET-акцептора tC _нитро .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика фосфорамидита рибо-tC _нитро представлены в дополнительных данных. Фосфорамидит рибо-ТС ^О был синтезирован согласно литературным данным (9).Твердофазный синтез tC ^O /tC _нитро -модифицированных олигорибонуклеотидов и их характеристика описаны в дополнительных данных.

Все используемые образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА. Все образцы смешивали и обрабатывали в стерильных средах, не содержащих РНКазы. Концентрацию олигонуклеотида определяли путем измерения поглощения при 260 нм. Молярная абсорбционная способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм была рассчитана с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных нитей была рассчитана таким же образом, с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу в молярной абсорбционной способности между цитозином (ε = 7400 M ^-1 см ^-1 ) и tC ^O ( ϵ = 11000 М ^-1 см ^-1 ) или tC _нитро (ϵ = 9700 М ^-1 см ^-1 ) при 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, использованных для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной нити с равным количеством акцепторной нити при 22°С с ​​последующим быстрым нагреванием до 95°С и, через 10 мин, охлаждение до 5°С при 7.5°С ч ^-1 . Концентрация донорной цепи при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК формы A–Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждая донорная нить была смешана с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5,08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-RNA FRET гибридизовали, как описано выше, с 30% избытком комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной нити со 100% избытком комплементарной ей нити при 22°C с последующим быстрым нагреванием до 75°C и охлаждением через 10 мин. до 55°С при 1,7°С ч ^-1 с последующим охлаждением до 5°С при 60°С ч ^-1 . Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (более высокая концентрация была выбрана для стимулирования гетеродуплексного отжига по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК А-формы, впоследствии разводили до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы разводили фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO ₄ ·H ₂ O (Sigma-Aldrich) для получения в желаемой концентрации NaClO ₄ (8 М, если не указано иное), при этом учитывают полученное изменение плотности раствора (18), а также поправку на различия в концентрации образца (определяют по поглощению при 260 нм) .

Все образцы были измерены сразу после отжига или хранились при температуре -20°C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

РНК записывали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым многоклеточным температурным блоком при нагревании от 20°С до 90°С и последующем охлаждении до 20°С со скоростью 0,5°С мин. ⁻¹ . Поглощение при 260 нм регистрировали через каждые 0,5°С в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывали как максимум первой производной кривых УФ-плавления после сглаживания БПФ-фильтром.

Спектры кругового дихроизма (КД) были записаны на CD-спектрометре Chirascan (Applied Photophysics) со сканированием в диапазоне от 200 до 600 нм с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры были скорректированы с учетом фонового вклада.

Измерения флуоресценции

Стационарные эмиссионные спектры регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарных измерениях и измерениях времени жизни. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

Квантовый выход измеряли для дуплексов, содержащих только tC ^O (т.е. без tC _нитро ) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ _f = 54,6%) в 0,5 MH ₂ SO ₄ для справки. Эмиссия регистрировалась между 360 и 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .Время жизни

$$\begin{equation*}\langle \tau \rangle = \frac{{\mathop \sum \nolimits_i {\alpha _i}{\tau _i}} }{{\mathop \sum \nolimits_i {\alpha _i}}}\end{equation*}$$

$$\begin{equation*}E = 1 — \frac{{{I_{{\rm DA }}}}}{{{I _{\rm D}}}}\end{equation*}$$

$$\begin{equation*}E = 1 — \frac{{{\tau _ {{\rm DA}}}}}{{{\tau _{\rm D}}}}\end{equation*}$$

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-форм РНК. ( B ) Иллюстрация параметров шести базовых шагов, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-форм РНК. ( B ) Иллюстрация параметров шести базовых шагов, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма

et ​​al.

$$\begin{equation*}{J_{{\rm{DA}}}} = \smallint {I_{\rm{D}}}\left(\lambda \right){\varepsilon _{\rm{ A}}}\left( \lambda \right){\lambda ^{\rm{4}}}{\rm{d}}\lambda \end{equation*}$$

Z-форма

Чтобы сделать возможным сравнение между тремя ранее описанными структурами Z-формы (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые представляют собой 6-меры, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мер, мы использовали метод, в котором мы расширяем 6-меры ранее опубликованного PDB- файлы в 14-меры с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA, чтобы получить параметры базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных базовых параметров GC и CG для конкретных структур.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базового шага, содержащий 14 пар оснований вместо исходных 6. Наконец, используя эти файлы базового шага, стандартную геометрию спаривания оснований Уотсона-Крика, квантовый выход tC ^O в Z-РНК (Φ _f = 21,3%) и спектральное перекрытие между эмиссией tC ^O и поглощение tC _нитро в Z-РНК ( J _DA = 1,4 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ^-1 см ^-1 для каждой теоретической эффективности разделения FRET), были рассчитаны с использованием FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез ТС

Недавно мы сообщили о синтезе и включении в РНК tC ^O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC ^O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является превосходным FRET донор-кандидат для межбазового FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC _нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).Защищенный 2′-O-TBS рибонуклеозид tC _nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в мультиграммовом масштабе по пятистадийному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 подвергали катализируемому медью перекрестному сочетанию CS с тиолом 2 , что сделало возможным селективное образование связи CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Выход 81%.Трициклическая ароматическая система tC _нитро была построена с конденсацией с замыканием кольца, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по сравнению с межмолекулярной реакцией. Полученный полностью защищенный tC _нитро рибонуклеозид затем удаляли с получения соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26, 27) дали желаемый строительный блок tC _нитро -фосфорамидит 5 для включения олигорибонуклеотидов.

Схема 1.

Синтез фосфорамидита tC _нитро 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si(OTf) ₂ , ДМФА, 0°C, 1 ч; затем имидазол, 0°С, 30 мин; затем TBS-Cl, КТ, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60°C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0°C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py·(HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0°C —> КТ, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0°C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, ТГФ, КТ, 20 ч.

Схема 1.

Синтез ТС _нитро фосфорамидит 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si(OTf) ₂ , ДМФА, 0°C, 1 ч; затем имидазол, 0°С, 30 мин; затем TBS-Cl, КТ, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60°C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0°C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py·(HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0°C —> КТ, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0°C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, ТГФ, КТ, 20 ч.

Тест FRET РНК А-формы

Для изучения FRET в РНК с использованием tC ^O и tC _nitro мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC ^O , и четыре комплементарные акцепторные последовательности, содержащие tC _nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют образовывать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донора и акцептора. Спектры CD модифицированных tC _нитро дуплексов очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC _нитро не нарушает A-форму (дополнительная фигура S1). Кроме того, свойства УФ-плавления tC _нитро -модифицированных дуплексов указывают на то, что tC _нитро , как и tC ^O , оказывает слегка стабилизирующее действие на А-форму РНК, при этом степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 . 4–1,7°C для 5′-C tC _нитро U-3′; 3,9–4,2°С для 5′-U tC _нитро C-3′; Дополнительная таблица S1) (9).

Рисунок 3.

( A ) Последовательности РНК, используемые для исследования характеристик FRET между основаниями в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _нитро (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазические сайты обозначаются подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, использованных в этом исследовании, см. в дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3.

( A ) Последовательности РНК, использованные для исследования характеристик FRET между основаниями в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _нитро (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазические сайты обозначаются подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, использованных в этом исследовании, см. в дополнительных таблицах S1 и S7.

Флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК приведены в таблице 1. Важно отметить, что tC ^O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), и представляет собой превосходное перекрытие длинноволновой полосы излучения tC ^O с полосой поглощения tC _nitro (рис. 4).В предположении свободного вращения переходных дипольных моментов (κ ² = 2/3) теоретическое расстояние Фёрстера для tC ^O – tC _нитро FRET-пары в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

.	λ абс, макс [нм] .	ϵ макс. [M −1 см −1 ] .	λ em,max [нм] .	Φ f [%] .	〈τ〉 [нс] .
TC OA	368-373 (370)	7400-9700 (8300)	452-460 (456)	20-25 (22)	3.8-4.7 (4.3)
TC Nitro 4 B	449-458 (454)	6400-7100 (6800)	—	—

Абсорбция и флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

.	λ абс, макс [нм] .	ϵ макс. [M −1 см −1 ] .	λ em,max [нм] .	Φ f [%] .	〈τ〉 [нс] .
4
TC OA	368-373 (370)	7400-9700 (8300)	452-460 (456)	20-25 (22)	3.8-4.7 (4.3)
TC NITRO B	449-458 (454)	6400-7100 (6800)	—	—

Рисунок 4.

Спектральное перекрытие между излучением tC ^O и поглощением tC _нитро в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC ^O и поглощением tC _nitro в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Для исследования применимости FRET между основаниями с использованием tC ^O и tC _nitro в системах РНК измеренную эффективность FRET сравнивали с теоретическим значением для A-формы РНК, которое было рассчитано на основании установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на В-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET в зависимости от расстояния между донором и акцептором измерялась с использованием как стационарного излучения, так и измерений времени жизни флуоресценции tC ^O в дуплексах с tC _нитро и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок). С2). На рисунке 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC ^O – tC _nitro внутри статических нуклеиновых кислот A-формы и B-формы.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественных нецелочисленных расстояниях, добавлены к рисунку для ориентации глаз. Локальные минимумы этих кривых возникают из-за разделения, при котором переходные диполи донора и акцептора были бы перпендикулярны друг другу и, следовательно, представляют собой геометрию, при которой в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты не может происходить перенос энергии.

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро в A-форме РНК в зависимости от разделения пар оснований.Голубые ромбы отмечают усредненные данные стационарных измерений и измерений за весь срок службы. Черные ромбы отмечают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _нитро внутри A-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серыми ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC ^O – tC _нитро внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7.4, 123 мМ Na ⁺ .

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро в A-форме РНК в зависимости от разделения пар оснований. Голубые ромбы отмечают усредненные данные стационарных измерений и измерений за весь срок службы. Черные ромбы отмечают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _нитро внутри A-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серыми ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC ^O – tC _нитро внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Измеренные данные точно следуют предсказанному шаблону FRET A-формы, показывая, что аналоги оснований прочно уложены внутри РНК, и убедительно предполагают, что они существенно не нарушают структуру РНК. Таким образом, это эталонное исследование показывает, что пара tC ^O – tC _нитро FRET отлично подходит для измерений FRET между основаниями в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межбазового FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC ^O и tC _nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), теперь должны быть возможны аналогичные исследования внутри РНК, что делает межосновную FRET с использованием tC ^O – tC _nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

Форма от A до Z FRET

Чтобы проиллюстрировать потенциал этого метода, мы разработали исследование, в котором tC ^O –tC _нитро interbase FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК.Структура правосторонней В-формы ДНК и А-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут иметь левостороннюю структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК впервые была кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит преимущественно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые интерферон-ответные белки имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могут отслеживать структурные изменения Z-РНК в живых клеточных системах, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были отправлены в базу данных PDB: исследование ЯМР, где Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 М NaClO ₄ , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование РНК Z-формы вместе с фермент ADAR1 (идентификатор PDB: 2GXB) (31,32).

Чтобы обеспечить возможность сравнения между структурами, депонированными в PDB, и структурами, используемыми в этом исследовании, мы применили теорию FRET для предсказания паттернов FRET, ожидаемых от tC ^O –tC _нитро при вставке в разные положения двух олигорибонуклеотидов, каждый из которых содержит структура, соответствующая одной из записей PDB, упомянутых выше (рис. 6А). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретическая картина FRET, полученная с использованием структуры ДНК Z-формы, связанной с ADAR1 (идентификатор PDB: 1QBJ), была включена в качестве дополнительного сравнения (31,33). Как видно на рисунке 6A, теоретическая картина FRET для трех описанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность для изучения конформационных изменений от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК от A до Z была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК от A к Z.Это конформационное изменение обычно отслеживается с помощью CD, что требует инструментов, менее распространенных в научно-исследовательских лабораториях, значительно большего количества образцов, чем измерения флуоресценции, и несовместимо с измерениями в целлюло . Во-вторых, получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки), вместе с прогнозируемыми значениями FRET для ранее опубликованных структур Z-формы : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, ЯМР-структура Z-формы РНК в 6 М NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанной с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе от А- к Z-форме. Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ (А-форма) или с добавлением 8 М NaClO ₄ (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение всего срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для GC-repeat в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET для ранее опубликованной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, ЯМР-структура Z-формы РНК в 6 М NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанной с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе от А- к Z-форме. Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ (А-форма) или с добавлением 8 М NaClO ₄ (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение всего срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3А).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был максимально коротким (14 мер), но при этом позволял исследовать полный оборот спирали, т. Е. Разделение донор-акцептор до 10 п.н. без изнашивания концов. Кроме того, GC-повтор окружен одним абазическим участком и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и повышать стабильность дуплекса, совпадающего внутри каркаса, тогда как абазовые сайты служат гибким линкером, позволяющим формировать GC-повторы. Z-РНК, при этом концы остаются в А-форме.

В этом исследовании для индуцирования Z-формы использовали 8 М NaClO ₄ . Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительная фигура S3), что является еще одним признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их природные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием как стационарного излучения, так и времени жизни флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной и той же цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, картина FRET GC-повторов в A-форме отличается от таковой в эталонном исследовании, где донор и акцептор в противоположных цепях для всех разделений (дополнительная фигура S5). В данных Z-формы есть несоответствие между эффективностью FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для эшелонирования семь и девять (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки сблизило бы донора и акцептора в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение донора может иметь характер прямого контакта (например, перенос электрона Декстера) и, следовательно, происходить во временной шкале, которую невозможно разрешить с помощью нашей установки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах в затухании флуоресценции будет видно только время жизни правильно свернутой части образца, т. е. дуплексов Z-формы РНК, в то время как стационарное излучение будет еще больше тушиться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET. ценность. Поскольку наши результаты показывают разницу между стационарным состоянием и временем жизни FRET при разделении семь и девять и, следовательно, указывают на частичное образование «темных видов» (т. г. шпильки) в этих образцах, в последующей оценке для этих точек данных использовалась только эффективность FRET на основе срока службы (рис. 6).

Сначала мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК от A к Z. Разница в характере FRET между A- и Z-формами РНК поразительна: эффективность переноса изменяется на 25-87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между А- и Z-формы РНК, отслеживая изменение FRET только при одном или паре разделений.Квантовый выход tC ^O практически одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в эффективности переноса связаны со структурными изменениями в РНК, а не с изменениями в микроокружении зонда. В совокупности это показывает, что РНК между основаниями FRET между tC ^O и tC _nitro , разделенными 4–10 п. исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Значительные различия во времени жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК A- и Z-формы указывают на возможность применения микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК, особенно в Z-форме, можно было бы отслеживать в микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным шаблоном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, полученный нами для Z-формы РНК, хорошо согласуется с ранее описанными структурами на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров структур 6mer PDB. Одним из объяснений этих несоответствий может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-мерной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК А-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновских лучей, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически релевантных концентрациях РНК.Учитывая большую редкость отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано подробно комментировать структурное единообразие этой формы дуплекса РНК. Это потребует большего набора сравнительных исследований, касающихся таких аспектов, как длина олигорибонуклеотидов и тип ассоциированного белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC ^O –tC _nitro FRET хорошо подходит для мониторинга FRET между основаниями в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и картина FRET близко соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO ₄ , что показывает, что, как и в ДНК, FRET между основаниями РНК можно использовать для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении интервалов tC ^O – tC _nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими PDB-структурами Z-формы РНК мы обнаруживаем общее сходство, но также и значительные различия.Различия аналогичной величины также могут быть обнаружены между структурами PDB, что означает, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли Z-форма РНК одну единую структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и РНК-белковых комплексов по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновной FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстро растущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовую FRET можно проводить в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная польза этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в живых клеточных системах, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновским излучением или ЯМР, для получения новой ценной информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афафа Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение А.Ф.Ф. и М.Б. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 для L.M.W., ID14-0036 для MG]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 to L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

Детхофф

Е.А.

Чу

Дж.

Мустое

А.М.

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция с помощью динамики РНК

Природа

2012

482

322

330

Harpur

A.G.

Wouters

F.S.

Бастианс

П.И.Х.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в одиночных клетках

Нац. Биотехнолог.

2001

19

167

169

Hillger

F.

Hanni

D.

D.

Nettels

D.

Geister

S.

Grandin

M.

Textor

M.

Шулер

Б.

Исследование взаимодействия белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

Анжю. хим. Междунар. Эд.

2008

47

6184

6188

Gubaev

A.

Klostermeier

D.

KlosterMeier

D.

D.

Hammann

C.

РНК Структура и складные: биофизические методы и методы прогнозирования

2013

Берлин

Де Грюйтер

181

214

Пеулен

Т.О.

Опанасюк

О.

Зайдель

К.А.М.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET с временным разрешением меченых макромолекул

J. Phys. хим. Б

2017

121

8211

8241

McPhee

S.A.

Huang

L.

Lilley

D.M.

Критическая пара оснований в k-витках, придающая характеристики складчатости и коррелирующая с биологической функцией

Нац. коммун.

2014

5

5127

Dumat

B.

Larsen

A.F.

Wilhelmsson

L.M.

Рез. нуклеиновых кислот.

2016

44

e101

Вранне

М.С.

füchtbauer

AF

DUMAT

B.

B.

Bood

M.

EL-SAGHEER

AH

BROWN

T.

Gradén

H.

Grøtli

M.

Wilhelmsson

LM

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

Дж. Ам. хим. соц.

2017

139

9271

9280

Füchtbauer

A.F.F.

Pruus

S.

S.

Börjesson

K.

MCPhee

S.A.

Lilley

D.M.J.

Wilhelmsson

L.M.

Аналог флуоресцентной РНК цитозина – внутренний зонд для детальных структурных и динамических исследований

Науч. Респ.

2017

7

2393

Шин

Д.

Синкельдам

Р.В.

Дж. Ам. хим. соц.

2011

133

14912

14915

Ровира

А.Р.

Fin

A.

Tor

Y.

Химический мутагенез эмиссионного РНК — алфавита

Дж. Ам. хим. соц.

2015

137

14602

14605

Се

Ю.

Дикс

А.В.

Tor

Y.

FRET позволяет обнаруживать связывание РНК с малой молекулой в режиме реального времени

Дж. Ам. хим. соц.

2009

131

17605

17614

Tanpure

А.А.

Шриватсан

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве топологически специфичных зондов включения флуоресценции для ДНК и РНК G-квадруплексов

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

43

e149

Эрнандес

А.Р.

Кул

Э.Т.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора рибонуклеозидов увеличенного размера

Орг. лат.

2011

13

676

679

Börjesson

K.

Preus

S.

El-Sagheer

A.H.

Браун

T.

ALBINSSON

B.

Wilhelmsson

Wilhelmsson

L.M.

L.M.

База нуклеиновой кислоты Аналоговая пара облегчает детализированные структурные измерения в системах содержащих нуклеиновой кислоты

Дж. Ам. хим. соц.

2009

131

4288

4293

Bood

M.

Füchtbauer

A.F.

Wranne

M.С.

Ро

Дж.Дж.

Сарангамат

С.

Эль-Сагир

А.Х.

Руперт

Д. Л.М.

Фишер

Р.С.

Magennis

Ю.В.

Jones

AC

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

Хим. науч.

2018

9

3494

3502

Хан

Дж.Х.

Yamamoto

S.

Park

S.

Sugiyama

H.

Разработка аналоговой FRET-системы на основе высокоэмиссионной

Хим. Евро. Дж.

2017

23

7607

7613

Миллер

М.Л.

Доран

М.

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

J. Phys. хим.

1956

60

186

189

Preus

S.

Kilså

K.

K.

K.

Miannay

FA

ALBINSSON

B.

Wilhelmsson

LM

Fretmatrix: общая методология для моделирования и анализа FRET в нуклеиновых кислотах

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

41

e18

Лу

X.J.

Олсон

В.К.

3DNA: пакет программного обеспечения для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Рез. нуклеиновых кислот.

2003

31

5108

5121

Олсон

В.К.

Бансал

М.

Берли

С.К.

Дикерсон

Р.Е.

Gerstein

M.

Harvey

S.C.

Neidle

S.

Shakked

Z.

Стандартная система отсчета для описания геометрии пар оснований нуклеиновых кислот

Дж. Мол. биол.

2001

313

229

237

SANDIN

P.

BÖRJESSON

K.

LI

,

LI

H.

Mårtensson

J.

Brown

T.

Wilhelmsson

LM

Albinsson

B.

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно ненарушающего флуоресцентного аналога основания ДНК

Рез. нуклеиновых кислот.

2008

36

157

167

Pruus

S.

Börjesson

K.

Kilså

K.

K.

ALBINSSON

B.

Wilhelmsson

LM

Характеристика Nucleobase Analogy Acceptore Tactor TC _нитро

J. Phys. хим. Б.

2010

114

1050

1056

Чжэн

Г.Х.

Лу

Х.Дж.

Олсон

В.К.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Рез. нуклеиновых кислот.

2009

37

W240

W246

Серебряный

В.

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

Тетраэдр Летт.

2002

43

1983

1985

SINHA

ND

Biernat

J.

J.

MCManus

J.

Köster

H.

Полимерная поддержка Олигонуклеотидный синтез XVIII: использование β -цианоэтил- N , N -Диалкиламино-/ N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающий снятие защиты и выделение конечного продукта

Рез. нуклеиновых кислот.

1984

12

4539

4557

XU

Y.

ISHIZUKA

T.

T.

T.

T.

T.

KOMIYAMA

M.

A U-тетрад стабилизирует телемерную rna rna rna g-addruplex

Дж. Ам. хим. соц.

2010

132

7231

7233

Ван

А.HJ

Куигли

Г.Дж.

Колпак

Ф.Дж.

Кроуфорд

Дж.Л.

Ванбум

Дж.Х.

Vandermarel

G.

Rich

A.

Молекулярная структура фрагмента левосторонней двойной спирали ДНК с атомным разрешением

Природа

1979

282

680

686

Зал

К.

Круз

П.

Тиноко

И.

Джовин

Т.М.

Вандесанде

Дж.Х.

Z-РНК — левосторонняя двойная спираль РНК

Природа

1984

311

584

586

Зарлинг

Д.А.

Калхун

CJ

Feuerstein

B.G.

Сена

Э.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, ингибирует рост клеток человека

Дж. Мол. биол.

1990

211

147

160

Пласидо

Д.

Браун

Б.А.

Lowenhaupt

K.

K.

Rich

A.

ATHANASIADIS

ALTANASIADIS

A.

А.

А.

Двойная спираль RNA RNA, связанная Z Alpha affra of RNA-редактирования фермента ADAR1

Структура

2007

15

395

404

Popenda

M.

Milecki

J.

Adamiak

R.W.

Рез. нуклеиновых кислот.

2004

32

4044

4054

Шварц

Т.

Роулд

М.A.

Lowenhaupt

K.

Herbert

A.

Rich

A.

Кристаллическая структура Z-DNA альфа-домена связанного с левосторонним редактирующим ферментом ADAR1 человека

Наука

1999

284

1841

1845

Примечания автора

© Автор(ы), 2019 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Молекулярные детерминанты контактов ЭР–Гольджи, идентифицированные с помощью новой системы FRET–FLIM | Журнал клеточной биологии

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе потребности идентифицированных хитов в поддержании ERTGoCS, и, в частности, зависело ли это от их активности переноса липидов. ORP10 ассоциируется с микротрубочками, а также с комплексом Гольджи (рис. 5А; Nissilä et al., 2012), и, не обладая каноническим доменом FFAT, может взаимодействовать с VAP (Weber-Boyvat et al., 2015; Мерфи и Левин, 2016). ORP10 принадлежит к подсемейству ORP, которое включает членов, которые могут передавать PS (Maeda et al., 2013), такие как ORP5 и ORP8, которые передают PS в обмен на PI4P между ER и PM (Chung et al. , 2015), в то время как Было показано, что сам ORP10 связывает и экстрагирует PS (Maeda et al., 2013). Мы заметили, что остатки oxysterol-related domain (ORD) ORP5/ORP8, которые участвуют в обмене PS/PI4P (Chung et al., 2015), очень хорошо консервативны в ORP10 (Fig. 5B).Чтобы выяснить, связана ли потребность в ORP10 в поддержании ERTGoCS со структурной ролью или с его активностью по переносу липидов, устойчивый к siRNA ORP10 был реэкспрессирован в клетках с истощенным ORP10, как в его форме WT, так и в формах, где сайты ORD участвуют в Связывание PS (L418D) и PI4P (H535/536A) было мутировано (фиг. 5B). Мы обнаружили, что WT, но не мутантные формы ORP10, которые были правильно нацелены на комплекс Гольджи (рис. 5C), могут восстанавливать ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис.5D и рис. S3, A и B), что указывает на то, что активность ORP10 по переносу липидов необходима для стабильности этих MCS. PS синтезируется в ER, но обогащен в PM, TGN и эндосомах (Leventis, Grinstein, 2010; Fairn et al. , 2011), где он асимметрично распределен между двуслойными листками, ограничиваясь цитозольным листком. Таким образом, мы проверили возможность того, что ORP10 может участвовать в переносе PS из ER в цитозольный листок мембран TGN, изучая влияние истощения ORP10 на внутриклеточное распределение PS с использованием двух различных генетически кодируемых зондов: PS-связывающий домен лактадгерина (домен C2; Yeung et al., 2008; рис. 5 E) и эвектина (домен PH; Uchida et al., 2011; рис. S3 C). Мы обнаружили, что истощение ORP10 вызывало снижение PS на аппарате Гольджи, что оценивалось по распределению двух зондов PS (рис. 5 E и рис. S3 C), что показало заметное снижение пула Golgi (но не PM). пул) в клетках ORP10-KD, а также по наблюдению за тем, что меньшее количество мембран TGN из клеток ORP10-KD сохранялось на PS-аффинных шариках по сравнению с контрольными клетками (рис. S3 D).

Таким образом, ORP10 требуется для защиты содержимого PS в TGN и, в то же время, ERTGoCS (рис. 4, А–Ф; рис. 5 Д; и рис. S3, C и D), что указывает на то, что липидный состав TGN и, в частности, содержание в нем PS имеет решающее значение для создания/поддержания этих структур. Подтверждая эту гипотезу, экзогенное добавление PS частично восстанавливало ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис. 5 F). Сходные результаты были получены, когда производство PS было усилено за счет сверхэкспрессии мутантной (P269S) формы PS-синтазы 1, которая нечувствительна к ингибированию продукта (Sousa et al., 2014; Зон и др., 2016; Рис. 5 G и Рис. S3 E).

Мы рассмотрели тот же вопрос (т. е. структурную роль в сравнении с ролью, зависящей от переноса липидов, в поддержании ERTGoCS) для OSBP1, который оказался обязательным партнером ORP9 в поддержании ERTGoCS. С этой целью мы изучили влияние итраконазола, ингибитора активности липидного обмена OSBP1 (Strating et al., 2015), на стабильность ERTGoCS и обнаружили, что он не оказывает ингибирующего действия ни в контрольных клетках, ни в ORP9-KD.