Лада 2019: новые модели и успехи Бренда

Лада Vesta 2020, авто с пробегом

Какие комплектации новых Lada можно было купить в 2020 году? Сравним цены на новые автомобили предыдущего года выпуска. Данные автомобили распроданы и их больше нельзя приобрести в состоянии новых, однако в наличии есть автомобили Лада с небольшим пробегом, свежие, двух- и трёхлетние модели.

Lada 2019-2020 с пробегом

Большое преимущество автомобилей с небольшим пробегом — наилучшее соотношение цена-качество: состояние таких автомобилей Лада близко к новому, а цена — гораздо ниже! Значительная экономия позволяет приобрести автомобили, даже если у вас ограничен бюджет. Кроме того, на такие автомобили легко взять автокредит: банки охотно финансируют покупку свежего автомобиля из салона, особенно при покупке у официального дилера. Вы можете взять как целевой автокредит на Лада Vesta 2019, 2020 года выпуска, так и обычный потребительский (например, в банке Тинькофф достаточно просто оформить карту).

LADA (ВАЗ) Largus

955 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до
95 500 ₽
LADA (ВАЗ) 2121 (4×4)

645 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 64 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

795 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 79 500 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

540 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 54 000 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

899 000 ₽

Год выпуска: 2020

Скидка при покупке в кредит до 89 900 ₽
LADA (ВАЗ) 2121 (4×4)

560 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 56 000 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

825 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 82 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

935 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 93 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

825 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 82 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

965 000 ₽

Год выпуска: 2020

Скидка при покупке в кредит до 96 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

875 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 87 500 ₽
LADA (ВАЗ) 2121 (4×4)

625 000 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 62 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

980 000 ₽

Год выпуска: 2020

Скидка при покупке в кредит до 98 000 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

530 999 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 53 100 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

900 000 ₽

Год выпуска: 2020

Скидка при покупке в кредит до 90 000 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

631 999 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 63 200 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

525 999 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 52 600 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

620 999 ₽

Год выпуска: 2019

Скидка при покупке в кредит до 62 100 ₽

Все Лада с пробегом в наличии

Кроме относительно новых автомобилей 2019, 2020 года выпуска, в нашем автосалоне, благодаря программе Trade In, есть много б\у автомобилей Лада в отличном состоянии.

Все машины проходят тщательную проверку технического состояния, юридическую проверку, а также детальную предпродажную подготовку. Если вы искали, где купить б\у Лада в Санкт-Петербурге — то это весьма подходящий вариант! Покупка авто с пробегом у официального дилера — гораздо более надежный способ, чем приобретение машины у частника “с рук”.

LADA (ВАЗ) Largus

979 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 97 900 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

1 020 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 102 000 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

1 019 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 101 900 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

995 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 99 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

975 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 97 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

895 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 89 500 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

777 000 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 77 700 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

575 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 57 500 ₽
LADA (ВАЗ) 2121 (4×4)

595 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 59 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

745 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 74 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

797 000 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 79 700 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

875 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 87 500 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

335 000 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 33 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

795 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 79 500 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

819 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 81 900 ₽
LADA (ВАЗ) 2121 (4×4)

525 000 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 52 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

775 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 77 500 ₽
LADA (ВАЗ) 2121 (4×4)

525 000 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 52 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

755 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 75 500 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

795 000 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 79 500 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

365 000 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 36 500 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

495 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 49 600 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

560 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 56 100 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

350 999 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 35 100 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

633 000 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 63 300 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

450 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 45 100 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

618 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 61 900 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

529 000 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 52 900 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

565 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 56 600 ₽
LADA (ВАЗ) Kalina

319 999 ₽

Год выпуска: 2015

Скидка при покупке в кредит до 32 000 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

550 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 55 100 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

430 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 43 100 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

370 999 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 37 100 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

445 999 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 44 600 ₽
LADA (ВАЗ) Kalina

341 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 34 200 ₽
LADA (ВАЗ) Kalina

350 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 35 100 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

399 999 ₽

Год выпуска: 2013

Скидка при покупке в кредит до 40 000 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

560 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 56 100 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

745 999 ₽

Год выпуска: 2017

Скидка при покупке в кредит до 74 600 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

534 999 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 53 500 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

527 999 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 52 800 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

502 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 50 300 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

503 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 50 400 ₽
LADA (ВАЗ) Largus

552 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 55 300 ₽
LADA (ВАЗ) Granta

338 999 ₽

Год выпуска: 2018

Скидка при покупке в кредит до 33 900 ₽
LADA (ВАЗ) XRAY

498 999 ₽

Год выпуска: 2016

Скидка при покупке в кредит до 49 900 ₽
LADA (ВАЗ) Vesta

483 999 ₽

Год выпуска: 2015

Скидка при покупке в кредит до 48 400 ₽

Б\У Лада Веста С ПРОБЕГОМ В КРЕДИТ

В каком банке лучше взять автокредит на подержанные автомобили Лада? Заполните эту форму, рассчитайте стоимость, и наши менеджеры проконсультируют Вас и помогут приобрести Lada с пробегом в кредит на самых выгодных условиях! 28 банков-партнеров, ПТС остается у вас, КАСКО необязательно, кредит по 2-м документам, рассмотрение заявки — 15 минут.

98% одобрение!

Возможно приобретение в кредит как без первоначального взноса (0%), так и со взносом.

Отзывы покупателей:

Audi A6

Автор Ибрагимов Э.

Дата 15 марта

Я, Ибрагимов Эдуард Расимович, купил автомобиль и очень доволен!!! Костику огромное спасибо за помощь в этом приобретении. Ребята молодцы!!!

Nissan Murano

Автор Давтян Л.

Дата 9 декабря

Я, Давтян Левик Овсепович, благодарю менеджера по продажам Дамира, за внимательное отношение, индивидуальный подход, оперативность. Рекомендую салон Атлант-Моторс.

RANGE ROVER VOGUE

Автор Фиева М.

Дата 25 марта

Я, Фиева М.А., приобрела автомобиль в автосалоне Атлант-Моторс. Быстро, качественно, удобно!!!

Volkswagen Polo

Автор Бычкова С.

Дата 28 декабря

Ребята молодцы. Вежливые, быстрые. Сообразили быстро что мне надо. Советую этот автосалон!

дилер LADA в г.

Москва (Москва и МО)

«Яхрома-Лада» — базовое предприятие АО «АВТОВАЗ» в Московском регионе, и благодаря этому мы гарантируем самые выгодные цены на автомобили LADA и качественное обслуживание.

АО «Яхрома-Лада» начала свою работу в 1976 году. 44 года наша компания является дочерним предприятием и официальным дилером АО «АВТОВАЗ».

Имея многолетний опыт работы, сплоченный трудовой коллектив и хорошую производственную базу «Яхрома-Лада» заняла ведущие позиции на авторынке и заслужила уважение и доверие многих клиентов. По состоянию на 2019 г. количество постоянных клиентов компании превысило 65 500. В их числе крупные государственные и коммерческие заказчики и большое количество жителей Москвы, Московской, Тверской, Владимирской и Ярославской областей.

Наличие постоянных прямых связей с заводом позволило организовать бесперебойные поставки автомобилей, наладить качественное гарантийное и сервисное обслуживание. Сотрудники нашего автосалона и техцентра аттестованы заводом-изготовителем, специалисты по гарантийному обслуживанию уполномочены представлять интересы и принимать решения от имени АО «АВТОВАЗ».

Вниманию наших клиентов постоянно представлено более 200 автомобилей LADA, различных цветов и комплектаций. Большим успехом пользуются последние модели АВТОВАЗ LADA Vesta и LADA XRAY.

Автотехцентр «Яхрома-Лада» предлагает следующие услуги:

  • продажа автомобилей LADA

  • реализация и установка дополнительного оборудования

  • комиссионная продажа и обмен автомобилей

  • страхование автомобилей по программам КАСКО/ОСАГО

  • оформление автокредита

  • гарантийный ремонт автомобилей

  • техническое обслуживание

  • кузовной ремонт

  • продажа автозапчастей

  • заказ запасных частей

  • мойка

  • специальные условия работы с корпоративными клиентами

На протяжении 44 лет ежедневно более 100 специалистов «Яхрома-Лада» прилагают все усилия для того, чтобы покупка или ремонт автомобиля стали для Вас доступными, а процесс обслуживания в нашем дилерском центре — приятным времяпровождением.

Для Вас доступны:

  • Бесплатный тест-драйв автомобилей LADA

  • Предварительная запись на ремонт – онлайн-заявка или по телефону

  • Зона отдыха с Wi-Fi и возможностью наблюдения за процессом ремонта Вашего а/м

  • Личный консультант – при необходимости Вы можете позвонить нашему специалисту по любому интересующему Вас вопросу

В 2019 года «Яхрома-Лада» провела полный ребрендинг дилерского центра в соответствии с утвержденными стандартами LADA.

Ждем Вас по адресу: Московская область, г.Яхрома, Шлюзовой переулок, д.1

Телефоны: +7(495)229-4-229 / +7(495)775-25-25

Е-mail: [email protected]

Гандбольная «Лада» обыграла «Ростов-Дон» — Волга Ньюс

В своем 13-м матче предварительного этапа «OLIMPBET Суперлиги — чемпионата России» в Тольятти «Лада» обыграла «Ростов-Дон» из Ростова-на-Дону — 30:29 (14:15).

Свой первый гол дончанки вымучивали целых девять минут, в течение которых Дарья Деревень отбила пять опаснейших бросков, включая «семерик». Поначалу и ростовские голкиперы свою команду выручали, потому-то и нули аж до шестой минуты держались на табло. Но Галине Габисовой вслед за удачными действиями обеих коллег по амплуа не посчастливилось засэйвить «выстрел» Ирины Никитиной, произведенный с пенальти, и счет был открыт. А еще через две с половиной минуты окрыленная «Лада» сделала его 4:0. Лишь затем отмеченная после матча призом лучшего игрока в составе «Ростов-Дона» Анна Лагерквист смогла Деревень размочить.

Покончив с нефартом, даже несмотря на два своих удаления, гости на 16-й минуте подобрались к нам вплотную (6:5), а после того как сами впервые оказались в большинстве, восстановили паритет (8:8). Вскоре же и вовсе захватили лидерство. Минимальная разница в пользу дончанок сохранилась до перерыва, хотя незадолго до него они было вырвались вперед и на «плюс 2».

Неблагоприятная для нас картина наблюдалась вплоть до хит-парада сольных шедевров 22-го номера тольяттинок, старт которым был дан на 34-й минуте. До этого матча Наталья Решетникова в нынешнем сезоне была малоэффективна. А тут принялась буквально феерить, не совершив за всю игру ни единого промаха. Как в шутку заметила после поединка Маренникова, видимо, теперь наступил ее год, указывая на соответствующие цифры на спине тольяттинского левого крыла. На отрезке в девять с половиной минут Решетникова шесть раз уложила мяч в гостевую сетку. И на исходе 43-й минуты уже мы были на пару шагов впереди (22:20).

Самым классным оказался именно 22-й гол, когда ловкая спортсменка обыграла соперниц у своих ворот, промчалась через всю площадку и мастерски переиграла вратаря.

Дончанки вновь основательно взялись за дело, и меньше чем через шесть минут все перевернулось вверх тормашками (23:25). Вернулась после передышки на площадку и Решетникова, забившая 28-й гол своей команды, благодаря которому на 56-й минуте мы вновь повели в один мяч. Вслед за ней после гостевого «выстрела» Екатерины Левши отличилась, подорвавшись неожиданно для обороны ростовчанок, и Алена Блохина. А за 1:08 до сирены Ольга Фомина сделала «плюс 2». В ответ не промазала Виктория Борщенко с семиметровой «точки», после чего последовал наш своевременный тайм-аут. И «Лада» грамотно «убила» остававшиеся до финиша 20 секунд.

Гандбольная «Лада» одержала первую победу под руководством Екатерины Маренниковой | СОВА

В своем 13-м матче предварительного этапа чемпионата России в Тольятти «Лада» обыграла «Ростов-Дон». Тем самым прервалась серия поражений волжанок. Эксперты посчитали эту победу сенсационной. Напомним, что накануне игры тольяттинскую команду по обоюдному согласию сторон покинул ее главный тренер Алексей Алексеев. Исполняющей обязанности стала Екатерина Маренникова.

Фото: Андрей Савельев

В сезоне 2021/22 соперники встречались друг с другом уже три раза. Два матча команды провели в рамках Суперлиги: 15 сентября «Ростов-Дон» потерпел поражение со счетом 30:31, а уже 17 ноября взял реванш — 28:23.

Следующая встреча состоялась в матче 1/4 финала Кубка России 2021/22. 28 декабря «Ростов-Дон» на домашней площадке выиграл у тольяттинской «Лады» со счетом 33:32, сообщает пресс-служба донской команды.

Счет нового матча в Тольятти открыла «Лада», реализовав 7-метровый на 6-й минуте. Далее тольяттинки забросили еще три мяча в ворота «Ростов-Дона». Команда Пера Юханссона смогла «распечатать» ворота соперника лишь на 10-й минуте — с линии забила Анна Лагерквист.

Вскоре дончанки начали нагонять соперника. На 20-й минуте сравняли счет — 8:8 и вышли вперед — 9:8. Однако несколько удачных атак — и «Лада» вновь повела.

На последних минутах тайма уже тольяттинская команда допустила несколько ошибок, что позволило «Ростов-Дону» уйти на перерыв с минимальным преимуществом — 15:14.

Второй тайм команды начали так же бодро. За минуту два мяча забросили игроки «Ростов-Дона». Но уже на 36-й минуте тольяттинские гандболистки вновь сравняли счет. Игра пошла мяч в мяч.

Встреча складывалась напряженно для обеих команд. «Лада» не позволяла «Ростов-Дону» оторваться, то и дело вырываясь вперед по счету. Последняя десятиминутка оказалась и вовсе нервной: преимущество «Ростов-Дона» в два мяча растаяло после пары атак соперника.

За полторы минуты до конца матча, когда табло показало 29:28 в пользу «Лады», Пер Юханссон взял тайм-аут. Тольяттинская команда забила гол, а после 7-метровый в ее ворота реализовали роставчанки — 30:29. До конца матча цифры на табло не изменились. «Ростов-Дон» уступил «Ладе».

ГК «Лада» остается на третьем месте в турнирной таблице. Следующую игру волжская команда проведет 23 января в Румынии в рамках Евролиги против местной «Мэгуры».

Еще больше новостей в наших соцсетях!
Читайте, обсуждайте, подписывайтесь.

Усовершенствованная нормализация FRET позволяет проводить количественный анализ белковых взаимодействий, включая стехиометрию и относительную аффинность в живых клетках.

Банк данных, содержащий их, доступен в Интернете по адресу http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/. Используемые плазмиды и карты перечислены на дополнительном рисунке 11.

Подготовка образцов клеток

Все эксперименты проводились на клетках HeLa, клон ACC 57.Клетки пассировали за сутки до трансфекции, достигая конфлюэнтности 70–80% в день трансфекции. Для микроскопических экспериментов клетки высевали на 8-луночные предметные стекла со стеклянным дном иди. Для проточной цитометрии клетки высевали в 24-луночные многолуночные планшеты. Для достижения покрытия в широком диапазоне соотношений акцептор/донор плазмиды, несущие донор или акцептор, трансфицировали в пяти различных массовых соотношениях: 5:1, 3:1, 1:1, 1:3 и 1:5. Трансфекцию осуществляли с помощью реагента для трансфекции TurboFect™ (Thermo Scientific™, каталожный номер: R0531) в соответствии со спецификациями продукта.

Получение и оценка изображений под микроскопом

Микроскопию выполняли с помощью лазерной сканирующей конфокальной системы Nikon A1 R+, оснащенной 12-разрядными детекторами, с использованием план-апохроматического масляного иммерсионного объектива с увеличением 60x (NA1. 4). Донорный канал был получен с возбуждением на 488 нм и эмиссионным фильтром 525/50. Канал FRET был получен с возбуждением на 488 нм и эмиссионным фильтром 595/50. Акцепторный канал был получен с возбуждением на 561 нм и эмиссионным фильтром 595/50.

Измерения фотообесцвечивания акцептора были проведены на Nikon A1 с использованием план-апохроматического масляного иммерсионного объектива с увеличением 60x (NA1.4). Фотодеструкцию применяли при длине волны 561 нм при 100% мощности лазера в течение одной секунды (лазер: Melles Griot 85-YCA-020, мощность 20 мВт при 561 нм ± 0,5 нм).

Оценка изображений проводилась с использованием пакета программного обеспечения Fiji ImageJ (https://fiji.sc/) и набора самописных макросов FRET, которые находятся в свободном доступе под лицензией GPLv3 (стандартная общественная лицензия версии 3). ) на GitHub под (https://github.com/BHochreiter). Предоставляется описание и протокол использования этих макросов для оценки (дополнительный рис. 7).

Получение и оценка методом проточной цитометрии

Измерения FRET на основе проточной цитометрии проводились на приборе CYTOFLEX S (Beckman Coulter, серийный номер AW19039) с использованием следующих настроек каналов. Донорский канал: лазерное возбуждение 488 нм, 525/40 Фильтр излучения BP (505–545 нм), канал FRET: лазерное возбуждение 488 нм, фильтр излучения BP 610/20 (600–620 нм), акцепторный канал: возбуждение лазером 561 нм, фильтр излучения 610/20 BP (600–620 нм

Программное обеспечение CytExpert (https://www.beckman.com/coulter-flow-cytometers/software) использовали для сбора данных и гейтирования анализируемых популяций. Программное обеспечение FlowPy (http://flowpy.wikidot.com/) использовалось для извлечения данных из файла формата FCS в формат txt с разделителями табуляции.

Оценка обесцвечивания акцептора

В качестве альтернативного метода определения эффективности FRET мы использовали метод фотообесцвечивания акцептора, в котором используется прямое сравнение интенсивности излучения донора до и после фотодеструкции акцепторного флуорофора, после чего большинство измерений и инструментов вызванные искажения не имеют значения, и поэтому результат является прямым коррелятом физического процесса. Однако многие флуорофоры проявляют определенные спектральные аномалии при освещении сильным источником света, которые необходимо учитывать перед анализом FRET. Донорные флуорофоры иногда могут совместно обесцвечиваться или, наоборот, фотоактивироваться при освещении с определенной длиной волны акцептора, что приводит к изменению флуоресцентного сигнала без присутствия FRET. Другим явлением является фотопереключение акцептора после обесцвечивания, когда вместо потери излучения акцептор переходит на другой профиль излучения, который часто можно обнаружить в донорном канале 12,13 .

Поправочные коэффициенты df (совместное обесцвечивание и фотоактивация донора) и af (фотопереключение акцептора) используются для учета этих эффектов и определяются для образцов, содержащих только донор или акцептор.

$$df=\frac{{D}_{dpost}-{D}_{dpre}}{{D}_{dpre}}$$

(2)

$$af=\frac{{D}_{apost}-{D}_{apre}}{{A}_{apre}-{A}_{apost}}$$

(3)

, где «после» означает интенсивность после обесцвечивания с акцептор-специфическим возбуждением, а «до» — значение до. {c}}$$

(5)

Расчет коэффициентов нормализации C1 и C2

Сигналы доноров, FRET и акцепторов требуют нормализации, чтобы преобразовать их в одно измерение и сделать возможным расчет относительных концентраций и соотношений доноров и акцепторов. C1 и C2 нормализуют донор или акцептор соответственно к сигналу в канале FRET. Им требуется информация от конструкции с известной эффективностью переноса и стехиометрией. Каждый измеренный эксперимент включал популяцию, трансфицированную тандемной слитой конструкцией mCherry-YFP, которая удовлетворяет этим требованиям.{c}\ast C2}$$

(8)

Расчет различных показателей FRET на основе полученных сигналов

Из-за спектральных свойств флуорофоров сигналы донорного, акцепторного и FRET-канала должны быть скорректированы на спектральные перекрестные помехи (или просачивание) от другого флуорофора. Во-первых, четыре фактора спектрального просачивания определяются с использованием образцов, содержащих только донорный или акцепторный флуорофор. В литературе встречаются различные номенклатуры для этих факторов – в этой работе используются S1–S4 31 .S1 и S3 описывают спектральное просачивание донорной флуоресценции в FRET и акцепторный канал соответственно, тогда как S2 и S4 описывают спектральное просачивание акцепторной флуоресценции в FRET и донорный канал соответственно. (Список математических параметров в уравнениях приведен в таблице 1)

$${\rm{донор}}\,{\rm{into}}\,{\rm{FRET}}\,{\rm{ канал}}:{S}_{1}=\frac{{F}_{d}}{{D}_{d}}$$

(9)

$${\rm{акцептор}}\,{\rm{в}}\,{\rm{FRET}}\,{\rm{канал}}:{S}_{2}=\frac{ {F}_{a}}{{A}_{a}}$$

(10)

$${\rm{донор}}\,{\rm{в}}\,{\rm{акцептор}}\,{\rm{канал}}:{S}_{3}=\frac{ {A}_{d}}{{D}_{d}}$$

(11)

$${\rm{акцептор}}\,{\rm{в}}\,{\rm{донор}}\,{\rm{канал}}:{S}_{4}=\frac{ {D}_{a}}{{A}_{a}}$$

(12)

Таблица 1 Список переменных. {c}=\frac{{A}_{da}-{S}_{3}\ast {D}_{da}}{1-{S}_{3}\ast {S}_{4 }}$$

(14)

Если донор не дает никакого сигнала в акцепторном канале и наоборот, т.е. S3 и S4 равны 0, то этот шаг можно пропустить, а использовать сигналы сразу после коррекции фона.

Скорректированные сигналы донора и акцептора можно использовать для отделения фактического сигнала FRET от спектрального просачивания в канале FRET согласно Youvan et al .{c}}$$

(18)

Моделирование экспериментов FRET

Для моделирования экспериментов FRET мы создали математическую модель, основанную на обобщенной форме закона действующих масс, которая описывает состояние всех химических взаимодействий в равновесии.

$$A+B\rightleftharpoons \text{AB},\,{K}_{a}=\frac{[AB]}{[A]\ast [B]}$$

(19)

Состояние равновесия, а точнее, концентрации свободной и связанной фракций молекул зависят от концентраций реагентов, а также их сродства, описываемого константой сродства K a (или ее обратной величиной, константа диссоциации K d ). K a – постоянная величина для реакции при заданной температуре и давлении. Для расчета FRET мы можем использовать наши донор и акцептор как A и B соответственно.

$${K}_{a}=\frac{[complex]}{{[don]}_{free}\ast {[acc]}_{free}}$$

(20)

$$[complex]=[don]-{[don]}_{free}=[acc]-{[acc]}_{free}$$

(21)

Когда эти формулы объединяются и решаются для [комплекса], количество связанных и свободных частиц может быть определено при данной общей концентрации донора, акцептора и значениях K a .{2}}+[don]{K}_{a}+\frac{[acc]}{z}{K}_{a}+1}{2{K}_{a}}$$

(24)

Важно отметить, что такой способ введения фактора стехиометрии подразумевает, что множественные донорные или акцепторные молекулы, появляющиеся в комплексе, уже связаны друг с другом до взаимодействия между донорными и акцепторными молекулами. Эта формула не может отображать сродство донорных или акцепторных субкомплексов по отдельности. {c}\) и F ​​ c сигналы могут быть рассчитаны путем применения фиксированное значение для максимальной эффективности FRET FRET max , которое представляет собой эффективность FRET, если все донорные и акцепторные молекулы были вовлечены в донорно-акцепторный комплекс, а также коэффициенты спектрального просачивания S1, S2, S3 и S4.

$${D}_{da}={[don]}_{free}+[complex]\ast (1-FRE{T}_{max})+({[acc]}_{free} +[комплекс])\ast {S}_{4}$$

(26)

$${A}_{da}={[acc]}_{свободный}+[сложный]+(\,{[don]}_{свободный}+[сложный]\ast (1-FRE{T }_{макс.}))\ast {S}_{3}$$

(27)

$${F}_{da}=[комплекс]\ast FRE{T}_{max}+S1\ast {D}_{da}+S2\ast {A}_{da}$$

(28)

Для вычислительного моделирования модель можно упростить, установив S1, S2, S3 и S4 на 0, что не меняет математического моделирования.

Из полученных значений были рассчитаны показатели FRET в соответствии с уравнениями 16–18.

Подгонка результатов FRET

встроили результаты наших измерений в имитационную модель. Чтобы напрямую использовать интенсивности донорного и акцепторного каналов, а также полученный DFRET для подгонки, мы немного изменили формулу, чтобы получить меру FRET вместо концентрации комплекса.{app}}\ast \frac{FRE{T}_{max}}{don}$$

(31)

Аппроксимация проводилась с помощью нелинейной модели наименьших квадратов, сводящей к минимуму отклонение теоретических и реальных значений за несколько итераций. Подгонка модели может быть непосредственно применена к измеренным значениям, но должна быть ограничена значимой областью вокруг стехиометрии комплекса. Для простого взаимодействия 1:1 мы применяем модель ко всем значениям с отношением акцептора к донору от 0,2 до 2.

Статистическая информация

Статистические значения для подгонки модели были определены с помощью нелинейного алгоритма подбора методом наименьших квадратов программного обеспечения R. Статистическая информация (где применимо) и n чисел приведены на соответствующих рисунках или в подписях к рисункам.

Реализованное программное обеспечение и код

Все описанные расчеты и оценки могут быть выполнены в свободно доступных ( R, ImageJ, CytExpert, FlowPy ) или распространенных (Microsoft Excel) программных пакетах.

Расчеты FRET, оценка FRET и моделирование были выполнены в Microsoft Excel (версия 2013). Предоставляются примеры таблиц данных (дополнительные шаблоны 1 и 2), включая пояснения по использованию и набор образцов данных (дополнительные рисунки 8–10).

Подгонка модели была выполнена в R (https://www.r-project.org/) с использованием команд нелинейного подбора методом наименьших квадратов. Предоставляется код, используемый для установки (дополнительное примечание 2).

Весь написанный код, который использовался в этой работе, включая полностью автоматизированные макросы ImageJ и последовательности кода R, предоставляется в дополнении или доступен на Github по адресу https://github. com/BHochreiter.

Биосенсор на основе FRET для количественного определения глюкозы в культуральных супернатантах микробных культур в мл | Microbial Cell Factory

Характеристика сенсора

Концентрация d-глюкозы в микробных культурах обычно находится в диапазоне от 0 до 200 мМ, что требует сравнительно низкой аффинности сенсора d-глюкозы в нижнем миллимолярном диапазоне для обнаружения истощения d-глюкозы. Первый вариант растворимого сенсора, Glu [-] , изученный в этой работе, показывает значения K d , равные 0.4 ± 0,1 мМ для d-глюкозы и очень хорошая чувствительность в буфере, о чем можно судить по изменению отношения FRET (ΔR) на 75% между несвязанным и связанным состоянием (дополнительный файл 1: рисунок S1). Таким образом, диапазон обнаружения в буфере MOPS составляет от 0,01 мМ до 10 мМ (от 0,0018 г л -1 до 1,8 г л -1 ) d-глюкозы.

Помимо высокой интенсивности сигнала датчик также должен быть стабильным в условиях, применяемых в микробиореакторе, где биосенсор подвергается воздействию температуры и механических нагрузок при встряхивании. Сначала была протестирована термостабильность растворимого сенсора Glu [-] в отношении его стабильности при различных температурах. Хотя коэффициент FRET в присутствии и в отсутствие d-глюкозы оставался стабильным в течение 21 дня инкубации при 4 °C и - 20 °C соответственно, коэффициент FRET уже явно изменился через 3 дня при 25 °C (рис. . 1а), что явно ограничивает применимость этого датчика при комнатной температуре. Таким образом, сеньор подходит для применения в лабораторных масштабах со временем культивирования в диапазоне от 24 до 48 часов.Анализ SDS-PAGE показал, что наблюдаемая нестабильность вызвана главным образом усиливающейся деградацией слитого белка (рис. 1b). Белок биосенсора распадается на фрагменты размером около 30 кДа (рис. 1b, красная рамка), что соответствует размерам как FP, так и центрального MglB соответственно. Аналогичные результаты были получены и ранее при попытках кристаллизации различных подобных сенсоров (данные не показаны). Однако основной механизм еще предстоит выяснить.

Рис. 1

Стабильность датчика Glu [-] (20 мкМ) в буфере MOPS (20 мМ, pH 7.3) при 25 °С. . Соотношение FRET датчика Glu [-] , показывающее явные признаки деградации после инкубации в течение 3 дней. b SDS-PAGE анализ датчика Glu [-] . Этикетки над дорожками отмечают количество дней инкубации. Размер полноразмерного белка составляет  ~ 90 кДа (зеленая рамка). Через 2 дня при 25 °C сенсор начинает разлагаться на более мелкие фрагменты  ~ 60 кДа (оранжевый прямоугольник, дорожка 3) и  ~ 25–30 кДа (красный прямоугольник). Через 4 дня (дорожки 4–11) сенсор полностью разлагается на фрагмент  ~ 25–30 кДа (подробности см. в тексте)

Помимо температуры, сенсор должен быть стабилен также по отношению к различным средам культивирования.Чтобы тщательно протестировать применение нового сенсора d-глюкозы для применения с Corynebacterium glutamicum , среду CGXII тестировали как типичную среду для культивирования [30] на предмет влияния на свойства сенсора. Соответствующая изотерма связывания датчика Glu [-] , зарегистрированная в присутствии культуральной среды, демонстрирует сильное влияние среды CGXII на чувствительность датчика по отношению к буферу (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S2). Из-за сильного фона и гашения среды CGXII измерения целесообразны только со средой CGXII, разбавленной не менее чем 95% буфера (об./об.).Кроме того, это разведение позволяет проводить измерения в присутствии клеток C. glutamicum . Таким образом, разделение клеток перед измерением уровня d-глюкозы не требуется. К счастью, среда не повлияла на кажущийся K d сенсорного варианта, что указывает на то, что гасящий эффект среды влияет на флуоресцентные белки, а не на MglB (дополнительный файл 1: рисунок S2). Пределы обнаружения от 0,01 мМ до 10 мМ (от 0,0018 г л -1 до 1,8 г л -1 ) d-глюкозы, однако, могут быть сдвинуты путем разбавления образцов культивирования.Разбавление в 40 раз позволило бы количественно определить d-глюкозу от 0,4 мМ до 400 мМ (от 0,072 до 72 г л -1 ), что охватывает диапазон концентраций большинства микробных культур.

Еще одной предпосылкой для применения таких датчиков является воспроизводимость калибровок во время типичного эксперимента по культивированию, что указывает на их стабильность в условиях процесса. Повторные сравнительные калибровки в буфере MOPS в присутствии и в отсутствие среды CGXII (2,5% по объему, разведение 1:40) не показали существенного влияния на кажущуюся аффинность (K d ) и интенсивность сигнала Glu [-] датчик.Как показано на рис. 2, изотермы связывания оставались стабильными на протяжении всего эксперимента, что свидетельствует о том, что этот датчик можно использовать для повторных измерений.

Рис. 2

Изотерма связывания биосенсора Glu [-] в MOPS (20 мМ, pH 7,3) ( a ) со средой CGXII (2,5% об./об.) и ( b ) без добавление среды без встряхивания. Отношение FRET (I A /I D ) было рассчитано по излучению донора mTurquoise2 на 485 нм (± 20 нм) и акцептора Венеры на 528 нм (± 20 нм) после возбуждения донора на 428 нм (± 9 нм) в соответствии с уравнением(1). Между измерениями датчик хранили в защищенном от света месте при 4 °C. Кривые (пунктирные) были приспособлены к данным в соответствии с формулой. (2)

Помимо термической деградации и воздействия среды вредным оказалось также встряхивание датчика Glu [-] в пластинах ® прибора BioLector ® , поскольку эмиссия обоих FRET-партнеров значительно уменьшилась (см. Дополнительный файл 1: рисунок S5). Снижение обеих интенсивностей излучения свидетельствует о деградации как минимум донора, а скорее всего и акцептора.Кроме того, частота встряхивания > 800 об/мин приводила к агрегации датчика Glu [-] (данные не показаны). Агрегированный датчик больше не реагировал на изменения концентрации d-глюкозы, что делало датчик Glu [-] непригодным для онлайн-применения во встряхиваемых культурах. Однако растворимый датчик Glu [-] можно применять в автоматизированном процессе для измерения уровня d-глюкозы на линии. В таких условиях запас биосенсоров можно легко хранить при температуре 4 °C между измерениями, что резко увеличивает срок его службы. Кроме того, датчик Glu [-] не подвергается тряске, что положительно влияет на стабильность датчика.

Применение сенсора растворимого Glu

[-]

Имея под рукой достаточно стабильный сенсор и воспроизводимую калибровку, был разработан протокол количественного определения d-глюкозы для широко используемого производственного штамма Corynebacterium glutamicum . (см. дополнительный файл 1: рисунок S7). Во время культивирования C. glutamicum ATCC 13032 в BioLector ® рост биомассы, потребление кислорода и изменения рН контролировали в режиме онлайн.Как описано в разделе «Методы», каждый час с помощью системы обработки жидкостей отбирали три образца, разбавляли и измеряли концентрацию d-глюкозы с использованием биосенсора Glu [-] (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S8 для калибровки). Супернатант остальных образцов хранили при 4 °C для сравнительного автономного анализа с использованием ВЭЖХ и ферментативного анализа d-глюкозы [2].

Как показано на рис. 3, сенсорный анализ Glu [-] показал очень хорошие результаты и показал потребление d-глюкозы в соответствии с анализами ВЭЖХ и ферментативного анализа.Примечательно, что измерение проводилось в присутствии бактериальных клеток с использованием небольшого количества образца (15 мкл) и очень короткого времени инкубации (< 1 мин). Эти свойства облегчают процесс измерения, и, таким образом, наш рабочий процесс позволяет проводить количественную оценку d-глюкозы в большом количестве образцов во время выполнения процесса культивирования.

Рис. 3

Рост биомассы ( a ) и потребление d-глюкозы C. glutamicum ATCC 13032 в среде CGXII с последующим использованием ( b ) датчика Glu [-] ( 9010 c ) ферментативный анализ d-глюкозы и ( d ) анализ ВЭЖХ.В то время как сенсорный анализ можно было проводить в режиме реального времени, ферментативный анализ и ВЭЖХ проводили в автономном режиме после окончания культивирования. Каждая кривая напоминает биологическую реплику. Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD) в трех технических повторностях

Ферментативный анализ обычно используется для количественного определения d-глюкозы в образцах микробных культур [2, 3], а также может использоваться в автоматизированной поточной установке [33]. Однако есть и ярко выраженные недостатки: во-первых, они требуют предварительного отделения бактериальных клеток, часто с помощью центрифугирования или фильтрации.Это усложняет рабочий процесс, отнимает больше времени и требует сложной платформы для работы с жидкостями. Напротив, анализ сенсора d-глюкозы требует только этапов разбавления, которые можно быстро выполнить с помощью стандартных операций с жидкостями. Во-вторых, ферментативные анализы включают этапы инкубации от 10 минут [34] до 30 минут [2]. Хотя этот трудоемкий шаг не вызывает проблем при параллельной обработке большого количества образцов, он ограничивает интервал измерений в режиме реального времени. Например, предыдущее исследование продемонстрировало измерения d-глюкозы в режиме реального времени с помощью ферментативного анализа с интервалом 80 минут [33].Биосенсор Glu [-] , с другой стороны, немедленно реагирует на d-глюкозу в окружающей среде, а также в присутствии клеток, что открывает путь к очень коротким циклам измерений и, таким образом, увеличивает плотность данных.

Насколько нам известно, в настоящее время не существует установленного метода ВЭЖХ на линии для микробиореакторов из-за длительного времени удерживания и иногда сложной подготовки образцов [35]. В то время как подготовка проб путем фильтрации может быть легко автоматизирована, недостаток измерения только одной пробы за раз серьезно затрудняет применение методов ВЭЖХ на линии при культивировании в микробиореакторе, которое часто включает несколько параллельных культиваций.Однако преимущества хроматографических методов заключаются в измерении нескольких аналитов за один цикл.

Иммобилизация

После успешной настройки протокола оперативных измерений в среде CGXII мы направились к приложению для онлайн-измерений. Как показано выше, растворимый датчик Glu [-] не обладает долговременной стабильностью при температурах выше 25 °C и подвержен механическому воздействию. Нельзя избежать механического стресса, так как перемешивание необходимо для любого микробного культивирования, чтобы обеспечить достаточное перемешивание и, в случае аэробного культивирования, перенос кислорода.Таким образом, стабильность датчика должна быть улучшена. Первоначальные исследования иммобилизации с помощью His-метки не увенчались успехом, поскольку Co 2+ -хелатная связь с гранулами диоксида кремния, функционализированными нитрилотриуксусной кислотой (Dynabeads, ThermoScientific), не была стабильной в условиях процесса (данные не показаны). Альтернативным подходом является иммобилизация с помощью HaloTag ® [21], которая обеспечивает ковалентную иммобилизацию и очистку в одну стадию, начиная также непосредственно с неочищенных клеточных экстрактов, как это было недавно успешно продемонстрировано для иммобилизации различных ферментов [22, 36, 37]. ].

Слияние HaloTag ® с С-концом сенсора d-глюкозы привело к сенсору Glu [+Halo] . Это слияние уменьшило общий коэффициент FRET, а также ΔR в растворе с 75% до почти 40% по сравнению с датчиком Glu [-] . Однако после иммобилизации датчик Glu [+Halo] восстанавливает функциональность и высокую интенсивность сигнала (ΔR 74%) датчика Glu [-] (подробнее см. Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Этот неожиданный результат можно объяснить следующим образом: как мы показали ранее, эффективность FRET (интенсивность сигнала) сильно зависит от расстояния и гибкости донорского FP mTurquoise2 по отношению к центральному белку, связывающему глюкозу (MglB) [20].Из-за сходного размера FP и HaloTag ® (около 30 кДа) нельзя исключить отрицательные стерические эффекты С-концевого HaloTag ® в составе растворимого сенсора, что могло бы объяснить снижение общей эффективности переноса, как показано в спектрах излучения (рис. 4). Здесь снижение эффективности переноса отражается в снижении эмиссии акцепторной Венеры после возбуждения донора mTurquoise2 (λ ex  = 425 ± 9 нм). Поскольку HaloTag ® расположен на С-конце сенсора, белок, вероятно, деформирован, тем самым изменяя расстояние и/или ориентацию между донором и акцептором.Иммобилизация на поверхности гранул Sepharose ® предположительно уменьшает взаимодействие HaloTag ® с FRET-партнерами, что приводит к восстановлению функциональности. Примечательно, что на сродство (K d ) сенсора не влияет ни добавление метки, ни иммобилизация. В растворимой форме, а также в иммобилизованной форме аффинность оставалась в том же диапазоне (0,8 мМ ± 0,2 мМ), что свидетельствует о том, что HaloTag ® не влияет на сайт связывания d-глюкозы (дополнительный файл 1: рисунок С1).

Рис. 4

Спектры излучения датчика Glu [+Halo] ( a ), не иммобилизованного и ( b ), иммобилизованного на смоле HaloLink ® . Спектры были получены после возбуждения FRET-донора mTurquoise2 при λ ex  = 425 нм (± 9 нм) в присутствии (черная кривая) и в отсутствие (серая кривая) 1 M d-глюкозы. Интенсивность нормализована к излучению на длине волны 485 нм (λ 90 143 em 90 144 м, бирюзовый2)

По сравнению с другими методами иммобилизации для таких датчиков, такими как инкапсуляция, ориентированная на сайт иммобилизация с помощью HaloTag ® превосходит ни гибкость, ни отрицательно влияет на доступность иммобилизованного датчика.В предыдущем исследовании аналогичный датчик d-глюкозы на основе FRET был инкапсулирован в частицы кремнезема, что значительно снизило интенсивность FRET [38]. Кроме того, биосенсор можно иммобилизовать непосредственно из неочищенного клеточного экстракта, что позволяет избежать трудоемкой и дорогостоящей хроматографической очистки белка [39].

Онлайн-применение иммобилизованного сенсора Glu

[+Halo]

С сенсором Glu [+Halo] , ковалентно иммобилизованным на поверхности шариков Sepharose ® , устойчивость сенсора к механическим воздействиям была значительно повышена , что было необходимым условием для применения этих шариков непосредственно в микробном культивировании (дополнительный файл 1: рисунок S6). В то время как иммобилизация решает проблемы стабильности, гашение среды CGXII остается. Кроме того, увеличение концентрации C. glutamicum также приводит к увеличению фона из-за аутофлуоресценции [40]. Чтобы преодолеть это, иммобилизованный датчик Glu [+Halo] был протестирован в среде M9, типичной среде для культивирования Escherichia coli [32]. Несмотря на снижение ΔR до 35%, изменение коэффициента FRET заметно (см. Дополнительный файл 1: рисунок S3).Как следствие, измерения в среде М9 можно было проводить с помощью датчика непосредственно в культивируемом пространстве, что облегчает онлайн-приложение.

Результаты онлайн-применения иммобилизованного сенсора Glu [+Halo] во время культивирования E. coli K12 MG1655 в среде M9 показаны на рис. 5. На протяжении всего культивирования контролировались оба флуоресцентных сигнала сенсора. с помощью BioLector ® и рассчитывали отношение FRET (I A /I D ). Затем рассчитывали концентрацию внеклеточной d-глюкозы на основе отношения FRET и калибровки иммобилизованного датчика Glu [+Halo] в той же среде в той же цветочной пластине (см. дополнительный файл 1: рисунок S9 для калибровки). . За потреблением d-глюкозы можно было следить на протяжении всего эксперимента по культивированию (20 ч). Здесь датчик Glu [+Halo] имел диапазон обнаружения от 0,02 до 2 мМ (0,0036 и 0,36 г л -1 ). В соответствии с этим диапазоном, при истощении запасов d-глюкозы (через 18 ч) дальнейшее изменение FRET-сигнала обнаружить не удалось.Несмотря на то, что в среде не осталось d-глюкозы, биомасса продолжала увеличиваться, предположительно в результате избыточного метаболизма [41].

Рис. 5

Соотношение FRET ( a ), истощение запасов глюкозы ( b ) и рост биомассы ( c ) в культивировании E. coli в среде M9, измеренные с помощью иммобилизованного биосенсора на основе FRET на смоле HaloLink ® . Соотношение FRET использовалось для расчета текущей концентрации d-глюкозы на основе калибровки иммобилизованного датчика (см. дополнительный файл 1: рисунок S9)

Преимущество онлайн-измерения совпадает с недостатком, заключающимся в том, что оно ограничено определенным окном измерения, определяемым динамическим диапазоном датчика.В отличие от непрерывных измерений, где конечная концентрация d-глюкозы в образцах может быть адаптирована к аффинности сенсора, для онлайн-измерений требуются либо сенсоры с более широким динамическим диапазоном, либо другие сенсоры с соответствующей аффинностью, чтобы охватить более широкий диапазон концентраций целевого метаболита. . Аффинность сенсора d-глюкозы можно регулировать либо соответствующей аминокислотной заменой в глюкозосвязывающих белках [24, 42, 43], выбором альтернативных глюкозосвязывающих белков с более низкой аффинностью [44, 45], либо вставкой линкера последовательности [9, 20].Поскольку до сих пор не известно ни одного датчика на основе FRET с очень широким диапазоном обнаружения [7], можно было бы рассмотреть возможность комбинации нескольких датчиков d-глюкозы с разным сродством и FRET-пар, иммобилизованных на одном носителе, для расширения диапазона обнаружения.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Кевин Фрет, открытый гей-латиноамериканский трэп-исполнитель, застрелен в Пуэрто-Рико

Кевин Фрет, пуэрториканская звезда социальных сетей, объявивший себя первым открытым геем-латиноамериканским трэп-исполнителем, был смертельно ранен в Сан-Хуане рано утром в четверг, согласно в полицию и местные новости.

25-летний г-н Фрет ехал на мотоцикле по району Сантурсе около 5:30 утра, когда ему дважды выстрелили в голову и бедро, сообщила полиция. Его доставили в ближайшую больницу, где констатировали смерть.

Полиция еще не назвала имя застреленного человека в ожидании опознания тела, но менеджер г-на Фрета, Эдуардо Родригес, подтвердил его смерть в заявлении для Billboard.

Его смерть наступила на фоне всеобщего беспокойства по поводу преступности в Пуэрто-Рико; в среду топ Ф.Б.И. Чиновник заявил, что остров столкнулся с «кризисом насилия».

В статье, опубликованной в апреле, журнал Paper Magazine назвал мистера Фрета «первым пионером латинского трэпа, открытым геем». В том же месяце он выпустил сингл «Soy Así» или «I’m Like This».

Видео «Soy Así», которое было просмотрено более 500 000 раз на YouTube, начинается с того, что г-н Фрет в блестящем укороченном топе и облегающих брюках держит в руках винтовку (предположительно поддельную). В окружении женщин в откровенных нарядах он хвастается своей внешностью, макияжем и дизайнерскими нарядами и называет себя «реинкарнацией Фриды Кало».

«Я человек, которому все равно, что говорят другие», — сказал он журналу.

«Молодые геи или молодые лесбиянки, которые сейчас смотрят на меня как на образец для подражания, типа «вау, если он это сделал, и ему все равно, что говорят другие, я могу это сделать».

Латинский трэп зародился на Карибах в середине 2000-х годов, смешивая южный хип-хоп с местными звуками. Bad Bunny, Messiah и Ozuna — все они работали с Cardi B — являются одними из самых известных практиков.

В заявлении для Billboard Mr.Менеджер Фрета, г-н Родригес, сказал, что его клиент был «художником и мечтателем с большим сердцем».

«Его страстью была музыка, — добавил он, — и еще многое нужно было сделать».

В июле мистер Фрет снялся в клипе артиста Майка Дюрана на песню «Diferente». Были знакомые тропы — деньги, бикини — но внешний вид мистера Фрета, читающего рэп в радужной сетчатой ​​футболке в джакузи, а позже в белоснежной рубашке с блестящей короной и невероятно длинными ресницами — был, на самом деле, очень разные.

Сэми Немир Оливарес, пуэрториканский писатель и активист, проживающий в Нью-Йорке, сказал, что г-н Фрет олицетворяет надежду для таких людей, как он сам, которые столкнулись с издевательствами и преследованиями из-за своей сексуальной ориентации.

«Кевин Фрет представил освежающий взгляд на музыкальный жанр, который очень гомофобный и очень мачистистский», — сказал он.

Г-н Фрет использовал хвастовство и перформативность жанра, чтобы доказать инклюзивность, утверждал г-н Немир Оливарес.

«В Пуэрто-Рико это акт сопротивления», — добавил он.

Но не всегда все шло гладко. Г-н Фрет жестко отреагировал после того, как стал объектом гомофобных угроз в текстах песен конкурирующего артиста, что оставило некоторые сомнения в том, что его убийство было мотивировано ненавистью.

Полиция искала другого мужчину на мотоцикле, который был с мистером Фретом, когда его нашли, но быстро скрылся. О мотивах пока не сообщается.

Мистер Фрет тоже жил в Майами в последние месяцы. В июне ему предъявили обвинение в нанесении побоев после драки в районе Брикелл.Мистер Фрет сказал, что на него напали из-за его сексуальной ориентации.

У него было много подписчиков в Instagram, но в четверг не было видно ни одной публикации, что указывает на то, что он, возможно, удалил предыдущие публикации. Была только одна «история»: религиозное изречение, которое переводится как «Молись, расслабься и позволь Богу сделать все остальное».

Taylor 322ce 12-Fret 2019 Shaded Edge Burst с OHSC — Gerald Musique

Описание

Наша распорка V-класса придает дополнительную мощность, сустейн и сладость этому 12-ладовому Grand Concert с вырезом, расширяя его музыкальный диапазон.Нижняя дека и обечайки из черного дерева производят сильное звучание — даже в GC с небольшим корпусом — с мясистым акцентом на средних частотах и ​​мерцанием верхних частот, а верхняя дека из красного дерева добавляет нотку естественной компрессии, чтобы сгладить отклик сверху донизу. Комбинация грифа с 12 ладами, чуть более короткой мензуры (24-7/8 дюйма) и смещенного положения бриджа (ближе к центру нижней части) обеспечивает более тонкое ощущение от руки. Это отличный выбор для игроков, которые ценят комфорт компактной рамы.Благодаря удобному для микрофона голосу он также является отличным выбором для записи, а электроника ES2 обеспечивает чистый, насыщенный звук с усилением. Темная и землистая эстетика включает в себя затененную верхнюю часть из темного красного дерева, черную окантовку, полностью атласную отделку, черную накладку и небольшие ромбовидные вставки из итальянского акрила.

ХАРАКТЕРИСТИКИ:

  • Распорка V-класса для улучшения интонации, сустейна и громкости
  • Электроника Taylor ES2 со встроенным фазовращателем, регулировкой низких и высоких частот
  • Сочетание экзотических пород дерева
  • Дизайн с 12 ладами и вырезом для лучшего доступа к верхнему ладу
  • Поставляется с жестким футляром

ХАРАКТЕРИСТИКИ:

Корпус

  • Тип кузова: Grand Concert/OO
  • Вырез: венецианский
  • Верхняя древесина: Массив неотропического красного дерева
  • Нижняя дека и обечайка: массив тасманского черного дерева
  • Раскос: V-Класс Grand Concert с рельефным профилем
  • Отделка корпуса: глянцевый верх, матовая задняя и боковые стороны
  • Ориентация: правша

Шея

  • Форма шейки: стандартный профиль Taylor
  • Ширина гайки: 1. 75 дюймов (44,45 мм)
  • Накладка на гриф: Натуральное западноафриканское черное дерево
  • Гриф: тропическое красное дерево
  • Длина шкалы: 24,84″
  • Количество ладов: 18
  • Отделка горловины: сатин

Электроника

  • Звукосниматель/предусилитель: Да
  • Торговая марка: Тейлор
  • Конфигурация: Датчик, устанавливаемый за седлом, с регулируемыми датчиками
  • Эквалайзер предусилителя: 2-полосный Объяснено выше
  • Фильтр обратной связи: Фаза
  • Тюнер: №

Прочее

  • Накладка на переднюю бабку: натуральное западноафриканское черное дерево
  • Колки: головка Taylor с прорезями и пуговицами из синтетической слоновой кости
  • Бридж: Натуральное западноафриканское черное дерево
  • Седло и гайка: микарта «волна»/графитовая гайка
  • Количество струн: 6
  • Особенности:
  • Кейс: Роскошный жесткий кейс
  • Аксессуары: Нет
  • Страна происхождения: США

Родственные

Межбазовый FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики. Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов оснований РНК FRET, состоящей из донора tC O и неэмиссионного акцептора tC nitro . Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезируется и впервые включается в РНК. Эта пара FRET точно описывает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем наблюдения за переходом от A-формы РНК к Z-форме. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ. Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой процесс, при котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором.Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, можно получить информацию о структуре и/или относительном положении различных меченых донором и акцептором биомолекул в физиологических условиях in vitro или даже в живых клетках (2,3). FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и РНК-белковые комплексы, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4).Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одной молекулы с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для исследования совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния. Например, индуцируемое ионами сворачивание изгибов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6).Одним из способов повысить уровень информации, получаемой с помощью FRET в РНК-системах, было бы использование флуоресцентных аналогов оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например. tC O (9), тиено[3,4- d ]пиримидины ( th A, th C, th G и th U) (10) и изотиазоло[4,3 — d ]пиримидины ( tz A, tz C, tz G и tz U) (11), суррогат U с применением в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для исследования G-квадруплекса (13) и расширенных нуклеозидов РНК (xRNAs) (14). Однако FRET между основаниями был исследован только для ДНК с использованием неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC O – tC nitro (15), qAN1–qA nitro (8) и pA–qA nitro ). (16)) или излучающий акцептор ( th dG–tC) (17). Использование излучающего акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и прямой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы излучения донора и акцептора значительно разделены.Однако большинство высокоэмиссионных FBA излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие излучений может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности в анализ FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции донора (или времени жизни) по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях FRET между основаниями в РНК с использованием пары tC O – tC нитро FRET (рис. 1).Неэмиссионная акцепторная молекула tC nitro впервые синтезирована и охарактеризована для использования в контексте РНК. В эталонном исследовании мы видим превосходное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК A-формы без существенных признаков структурного возмущения по сравнению с естественным дуплексом РНК A-формы, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования. структурные изменения внутри РНК с высокой точностью. Кроме того, общее использование межбазового FRET для исследования структурных изменений в РНК демонстрируется здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного FRET-донора tC O и неэмиссионного FRET-акцептора tC nitro .

Рисунок 1.

Структура излучающего FRET-донора tC O и неэмиссионного FRET-акцептора tC нитро .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика фосфорамидита рибо-tC нитро представлены в дополнительных данных. Фосфорамидит рибо-ТС О был синтезирован согласно литературным данным (9).Твердофазный синтез tC O /tC нитро -модифицированных олигорибонуклеотидов и их характеристика описаны в дополнительных данных.

Все используемые образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА. Все образцы смешивали и обрабатывали в стерильных средах, не содержащих РНКазы. Концентрацию олигонуклеотида определяли путем измерения поглощения при 260 нм. Молярная абсорбционная способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм была рассчитана с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных нитей была рассчитана таким же образом, с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу в молярной абсорбционной способности между цитозином (ε = 7400 M -1 см -1 ) и tC O ( ϵ = 11000 М -1 см -1 ) или tC нитро (ϵ = 9700 М -1 см -1 ) при 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, использованных для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной нити с равным количеством акцепторной нити при 22°С с ​​последующим быстрым нагреванием до 95°С и, через 10 мин, охлаждение до 5°С при 7.5°С ч -1 . Концентрация донорной цепи при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК формы A–Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждая донорная нить была смешана с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5,08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-RNA FRET гибридизовали, как описано выше, с 30% избытком комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной нити со 100% избытком комплементарной ей нити при 22°C с последующим быстрым нагреванием до 75°C и охлаждением через 10 мин. до 55°С при 1,7°С ч -1 с последующим охлаждением до 5°С при 60°С ч -1 . Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (более высокая концентрация была выбрана для стимулирования гетеродуплексного отжига по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК А-формы, впоследствии разводили до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы разводили фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO 4 ·H 2 O (Sigma-Aldrich) для получения в желаемой концентрации NaClO 4 (8 М, если не указано иное), при этом учитывают полученное изменение плотности раствора (18), а также поправку на различия в концентрации образца (определяют по поглощению при 260 нм) .

Все образцы были измерены сразу после отжига или хранились при температуре -20°C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

Кривые УФ-плавления

РНК записывали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым многоклеточным температурным блоком при нагревании от 20°С до 90°С и последующем охлаждении до 20°С со скоростью 0,5°С мин. −1 . Поглощение при 260 нм регистрировали через каждые 0,5°С в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывали как максимум первой производной кривых УФ-плавления после сглаживания БПФ-фильтром.

Спектры кругового дихроизма (КД) были записаны на CD-спектрометре Chirascan (Applied Photophysics) со сканированием в диапазоне от 200 до 600 нм с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры были скорректированы с учетом фонового вклада.

Измерения флуоресценции

Стационарные эмиссионные спектры регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарных измерениях и измерениях времени жизни. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин -1 .

Квантовый выход измеряли для дуплексов, содержащих только tC O (т.е. без tC нитро ) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ f = 54,6%) в 0,5 MH 2 SO 4 для справки. Эмиссия регистрировалась между 360 и 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин -1 .Время жизни

флуоресценции определяли с помощью коррелированного по времени счета одиночных фотонов (TCSPC). Образцы возбуждались импульсным (10 МГц) лазерным диодом PicoQuant с длиной волны 377 нм, а эмиссионный монохроматор был установлен на 460 нм. Подсчеты собирали фотоумножителем R3809U-50 с микроканальной пластиной (Hamamatsu) и вводили в многоканальный анализатор Lifespec (Edinburgh Analytical Instruments) с 2048 каналами. Условие остановки было установлено на 10 000 отсчетов в верхнем канале. Реконволюционную подгонку к би- или триэкспоненциальным функциям выполняли с помощью Fluofit Pro v.4 программное обеспечение (PicoQuant GmbH). Среднее время жизни было взвешено по амплитуде в соответствии с уравнением (1):

$$\begin{equation*}\langle \tau \rangle = \frac{{\mathop \sum \nolimits_i {\alpha _i}{\tau _i}} }{{\mathop \sum \nolimits_i {\alpha _i}}}\end{equation*}$$

(1)где |$\langle \tau \rangle$| — средний срок службы, |${\tau _i}$| — i -е время жизни, а |${\alpha _i}$| — амплитуда i -го времени жизни. Измерения были продублированы. Эффективность FRET была рассчитана на основе стационарного излучения и времени жизни флуоресценции в соответствии с уравнениями (2 и 3):

$$\begin{equation*}E = 1 — \frac{{{I_{{\rm DA }}}}}{{{I _{\rm D}}}}\end{equation*}$$

(2)

$$\begin{equation*}E = 1 — \frac{{{\tau _ {{\rm DA}}}}}{{{\tau _{\rm D}}}}\end{equation*}$$

(3)где I — интегральная интенсивность донора, а τ — средний срок службы донора.6}}\end{equation*}$$

(5)где η – показатель преломления среды (1,4 для биомолекул), Φ D – квантовый выход донора, Дж ( λ ) — интеграл перекрытия, R DA — расстояние между донором и акцептором, а κ 2 — ориентационный фактор, описывающий относительную ориентацию переходных дипольных моментов донора и акцептора. Зная о фотофизических свойствах пары FRET (Φ D и J ( λ )) и относительном положении и ориентации донора и акцептора ( R DA и κ 2 ), ожидаемая эффективность переноса была рассчитана с использованием программного обеспечения FRETmatrix на базе MATLAB (19).Протокол немного отличался для A- и Z-формы РНК (рис. 2A), как описано ниже.

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-форм РНК. ( B ) Иллюстрация параметров шести базовых шагов, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-форм РНК. ( B ) Иллюстрация параметров шести базовых шагов, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма
Средние параметры базового шага для A-формы были взяты из Olson et ​​al. (21) На рис. 2B показаны шесть различных параметров базового шага, которые используются для построения моделей нуклеиновых кислот. Чтобы создать плавную кривую, которая направляет взгляд, каждый базовый шаг был разделен на 10 шагов одинакового размера, для которых было рассчитано гипотетическое значение FRET. В расчетах использовалась ориентация дипольных моментов перехода tC O и tC нитро (22,23), а также экспериментально наблюдаемый квантовый выход tC O в контексте каждой последовательности: 19.1% для эталонного исследования A-РНК и 20,9% для исследования A-Z-РНК (дополнительные таблицы S4 и S8). Используя уравнение (6), интеграл перекрытия, J DA , был определен экспериментально и составил 1,5 × 10 14 нм 4 M -1 см -1 для А-формы РНК в исследовании от A до Z-РНК.

$$\begin{equation*}{J_{{\rm{DA}}}} = \smallint {I_{\rm{D}}}\left(\lambda \right){\varepsilon _{\rm{ A}}}\left( \lambda \right){\lambda ^{\rm{4}}}{\rm{d}}\lambda \end{equation*}$$

(6)где I D представляет собой зависящий от длины волны спектр излучения донора, нормализованный для интегрирования к единице, ϵ A представляет собой зависящую от длины волны молярную поглощательную способность акцептора, а λ представляет собой длину волны в нм.
Z-форма

Чтобы сделать возможным сравнение между тремя ранее описанными структурами Z-формы (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые представляют собой 6-меры, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мер, мы использовали метод, в котором мы расширяем 6-меры ранее опубликованного PDB- файлы в 14-меры с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA, чтобы получить параметры базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных базовых параметров GC и CG для конкретных структур.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базового шага, содержащий 14 пар оснований вместо исходных 6. Наконец, используя эти файлы базового шага, стандартную геометрию спаривания оснований Уотсона-Крика, квантовый выход tC O в Z-РНК (Φ f = 21,3%) и спектральное перекрытие между эмиссией tC O и поглощение tC нитро в Z-РНК ( J DA = 1,4 × 10 14 нм 4 M -1 см -1 для каждой теоретической эффективности разделения FRET), были рассчитаны с использованием FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез ТС

нитро

Недавно мы сообщили о синтезе и включении в РНК tC O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является превосходным FRET донор-кандидат для межбазового FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).Защищенный 2′-O-TBS рибонуклеозид tC nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в мультиграммовом масштабе по пятистадийному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 подвергали катализируемому медью перекрестному сочетанию CS с тиолом 2 , что сделало возможным селективное образование связи CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Выход 81%.Трициклическая ароматическая система tC нитро была построена с конденсацией с замыканием кольца, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по сравнению с межмолекулярной реакцией. Полученный полностью защищенный tC нитро рибонуклеозид затем удаляли с получения соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26, 27) дали желаемый строительный блок tC нитро -фосфорамидит 5 для включения олигорибонуклеотидов.

Схема 1.

Синтез фосфорамидита tC нитро 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu 2 Si(OTf) 2 , ДМФА, 0°C, 1 ч; затем имидазол, 0°С, 30 мин; затем TBS-Cl, КТ, 12 ч. ( B ) NH 2 NH 2 (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs 2 CO 3 , ДМСО, 60°C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0°C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py·(HF) x , CH 2 Cl 2 , 0°C —> КТ, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0°C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, ТГФ, КТ, 20 ч.

Схема 1.

Синтез ТС нитро фосфорамидит 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu 2 Si(OTf) 2 , ДМФА, 0°C, 1 ч; затем имидазол, 0°С, 30 мин; затем TBS-Cl, КТ, 12 ч. ( B ) NH 2 NH 2 (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs 2 CO 3 , ДМСО, 60°C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0°C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py·(HF) x , CH 2 Cl 2 , 0°C —> КТ, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0°C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, ТГФ, КТ, 20 ч.

Тест FRET РНК А-формы

Для изучения FRET в РНК с использованием tC O и tC nitro мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC O , и четыре комплементарные акцепторные последовательности, содержащие tC nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют образовывать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донора и акцептора. Спектры CD модифицированных tC нитро дуплексов очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC нитро не нарушает A-форму (дополнительная фигура S1). Кроме того, свойства УФ-плавления tC нитро -модифицированных дуплексов указывают на то, что tC нитро , как и tC O , оказывает слегка стабилизирующее действие на А-форму РНК, при этом степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 . 4–1,7°C для 5′-C tC нитро U-3′; 3,9–4,2°С для 5′-U tC нитро C-3′; Дополнительная таблица S1) (9).

Рисунок 3.

( A ) Последовательности РНК, используемые для исследования характеристик FRET между основаниями в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC нитро (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазические сайты обозначаются подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, использованных в этом исследовании, см. в дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3.

( A ) Последовательности РНК, использованные для исследования характеристик FRET между основаниями в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC нитро (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазические сайты обозначаются подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, использованных в этом исследовании, см. в дополнительных таблицах S1 и S7.

Флуоресцентные свойства tC O и tC nitro в A-форме РНК приведены в таблице 1. Важно отметить, что tC O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), и представляет собой превосходное перекрытие длинноволновой полосы излучения tC O с полосой поглощения tC nitro (рис. 4).В предположении свободного вращения переходных дипольных моментов (κ 2 = 2/3) теоретическое расстояние Фёрстера для tC O – tC нитро FRET-пары в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.

Таблица 1.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC O и tC nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

. λ абс, макс [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em,max [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
4
TC OA 368-373 (370) 7400-9700 (8300) 452-460 (456) 20-25 (22) 3.8-4.7 (4.3)
TC

NITRO B

449-458 (454) 6400-7100 (6800)
. λ абс, макс [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em,max [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
TC OA 368-373 (370) 7400-9700 (8300) 452-460 (456) 20-25 (22) 3.8-4.7 (4.3)
TC Nitro

4 B

449-458 (454) 6400-7100 (6800)
Таблица 1.

Абсорбция и флуоресцентные свойства tC O и tC nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

. λ абс, макс [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em,max [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
4
TC OA 368-373 (370) 7400-9700 (8300) 452-460 (456) 20-25 (22) 3.8-4.7 (4.3)
TC

NITRO B

449-458 (454) 6400-7100 (6800)
. λ абс, макс [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em,max [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
TC OA 368-373 (370) 7400-9700 (8300) 452-460 (456) 20-25 (22) 3.8-4.7 (4.3)
TC Nitro B 449-458 (454) 6400-7100 (6800)

Рисунок 4.

Спектральное перекрытие между излучением tC O и поглощением tC нитро в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC O и поглощением tC nitro в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .

Для исследования применимости FRET между основаниями с использованием tC O и tC nitro в системах РНК измеренную эффективность FRET сравнивали с теоретическим значением для A-формы РНК, которое было рассчитано на основании установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на В-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET в зависимости от расстояния между донором и акцептором измерялась с использованием как стационарного излучения, так и измерений времени жизни флуоресценции tC O в дуплексах с tC нитро и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок). С2). На рисунке 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC O – tC nitro внутри статических нуклеиновых кислот A-формы и B-формы.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественных нецелочисленных расстояниях, добавлены к рисунку для ориентации глаз. Локальные минимумы этих кривых возникают из-за разделения, при котором переходные диполи донора и акцептора были бы перпендикулярны друг другу и, следовательно, представляют собой геометрию, при которой в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты не может происходить перенос энергии.

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC O и tC нитро в A-форме РНК в зависимости от разделения пар оснований.Голубые ромбы отмечают усредненные данные стационарных измерений и измерений за весь срок службы. Черные ромбы отмечают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC нитро внутри A-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серыми ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC O – tC нитро внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7.4, 123 мМ Na + .

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC O и tC нитро в A-форме РНК в зависимости от разделения пар оснований. Голубые ромбы отмечают усредненные данные стационарных измерений и измерений за весь срок службы. Черные ромбы отмечают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC нитро внутри A-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серыми ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC O – tC нитро внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .

Измеренные данные точно следуют предсказанному шаблону FRET A-формы, показывая, что аналоги оснований прочно уложены внутри РНК, и убедительно предполагают, что они существенно не нарушают структуру РНК. Таким образом, это эталонное исследование показывает, что пара tC O – tC нитро FRET отлично подходит для измерений FRET между основаниями в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межбазового FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC O и tC nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), теперь должны быть возможны аналогичные исследования внутри РНК, что делает межосновную FRET с использованием tC O – tC nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

Форма от A до Z FRET

Чтобы проиллюстрировать потенциал этого метода, мы разработали исследование, в котором tC O –tC нитро interbase FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК.Структура правосторонней В-формы ДНК и А-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут иметь левостороннюю структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК впервые была кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит преимущественно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые интерферон-ответные белки имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могут отслеживать структурные изменения Z-РНК в живых клеточных системах, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были отправлены в базу данных PDB: исследование ЯМР, где Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 М NaClO 4 , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование РНК Z-формы вместе с фермент ADAR1 (идентификатор PDB: 2GXB) (31,32).

Чтобы обеспечить возможность сравнения между структурами, депонированными в PDB, и структурами, используемыми в этом исследовании, мы применили теорию FRET для предсказания паттернов FRET, ожидаемых от tC O –tC нитро при вставке в разные положения двух олигорибонуклеотидов, каждый из которых содержит структура, соответствующая одной из записей PDB, упомянутых выше (рис. 6А). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретическая картина FRET, полученная с использованием структуры ДНК Z-формы, связанной с ADAR1 (идентификатор PDB: 1QBJ), была включена в качестве дополнительного сравнения (31,33). Как видно на рисунке 6A, теоретическая картина FRET для трех описанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность для изучения конформационных изменений от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК от A до Z была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК от A к Z.Это конформационное изменение обычно отслеживается с помощью CD, что требует инструментов, менее распространенных в научно-исследовательских лабораториях, значительно большего количества образцов, чем измерения флуоресценции, и несовместимо с измерениями в целлюло . Во-вторых, получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC нитро для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки), вместе с прогнозируемыми значениями FRET для ранее опубликованных структур Z-формы : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, ЯМР-структура Z-формы РНК в 6 М NaClO 4 ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанной с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC нитро для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе от А- к Z-форме. Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na + (А-форма) или с добавлением 8 М NaClO 4 (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение всего срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC нитро для GC-repeat в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET для ранее опубликованной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, ЯМР-структура Z-формы РНК в 6 М NaClO 4 ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанной с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC нитро для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе от А- к Z-форме. Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na + (А-форма) или с добавлением 8 М NaClO 4 (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение всего срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3А).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был максимально коротким (14 мер), но при этом позволял исследовать полный оборот спирали, т. Е. Разделение донор-акцептор до 10 п.н. без изнашивания концов. Кроме того, GC-повтор окружен одним абазическим участком и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и повышать стабильность дуплекса, совпадающего внутри каркаса, тогда как абазовые сайты служат гибким линкером, позволяющим формировать GC-повторы. Z-РНК, при этом концы остаются в А-форме.

В этом исследовании для индуцирования Z-формы использовали 8 М NaClO 4 . Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительная фигура S3), что является еще одним признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их природные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием как стационарного излучения, так и времени жизни флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной и той же цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, картина FRET GC-повторов в A-форме отличается от таковой в эталонном исследовании, где донор и акцептор в противоположных цепях для всех разделений (дополнительная фигура S5). В данных Z-формы есть несоответствие между эффективностью FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для эшелонирования семь и девять (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки сблизило бы донора и акцептора в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение донора может иметь характер прямого контакта (например, перенос электрона Декстера) и, следовательно, происходить во временной шкале, которую невозможно разрешить с помощью нашей установки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах в затухании флуоресценции будет видно только время жизни правильно свернутой части образца, т. е. дуплексов Z-формы РНК, в то время как стационарное излучение будет еще больше тушиться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET. ценность. Поскольку наши результаты показывают разницу между стационарным состоянием и временем жизни FRET при разделении семь и девять и, следовательно, указывают на частичное образование «темных видов» (т. г. шпильки) в этих образцах, в последующей оценке для этих точек данных использовалась только эффективность FRET на основе срока службы (рис. 6).

Сначала мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК от A к Z. Разница в характере FRET между A- и Z-формами РНК поразительна: эффективность переноса изменяется на 25-87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между А- и Z-формы РНК, отслеживая изменение FRET только при одном или паре разделений.Квантовый выход tC O практически одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в эффективности переноса связаны со структурными изменениями в РНК, а не с изменениями в микроокружении зонда. В совокупности это показывает, что РНК между основаниями FRET между tC O и tC nitro , разделенными 4–10 п. исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Значительные различия во времени жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК A- и Z-формы указывают на возможность применения микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК, особенно в Z-форме, можно было бы отслеживать в микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным шаблоном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, полученный нами для Z-формы РНК, хорошо согласуется с ранее описанными структурами на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров структур 6mer PDB. Одним из объяснений этих несоответствий может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-мерной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК А-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновских лучей, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически релевантных концентрациях РНК.Учитывая большую редкость отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано подробно комментировать структурное единообразие этой формы дуплекса РНК. Это потребует большего набора сравнительных исследований, касающихся таких аспектов, как длина олигорибонуклеотидов и тип ассоциированного белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC O –tC nitro FRET хорошо подходит для мониторинга FRET между основаниями в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и картина FRET близко соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO 4 , что показывает, что, как и в ДНК, FRET между основаниями РНК можно использовать для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении интервалов tC O – tC nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими PDB-структурами Z-формы РНК мы обнаруживаем общее сходство, но также и значительные различия.Различия аналогичной величины также могут быть обнаружены между структурами PDB, что означает, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли Z-форма РНК одну единую структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и РНК-белковых комплексов по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновной FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстро растущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовую FRET можно проводить в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная польза этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в живых клеточных системах, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновским излучением или ЯМР, для получения новой ценной информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афафа Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение А.Ф.Ф. и М.Б. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 для L.M.W., ID14-0036 для MG]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 to L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

1.

Детхофф

Е.А.

,

Чу

Дж.

,

Мустое

А.М.

,

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция с помощью динамики РНК

.

Природа

.

2012

;

482

:

322

330

.2.

Harpur

A.G.

,

Wouters

F.S.

,

Бастианс

П.И.Х.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в одиночных клетках

.

Нац. Биотехнолог.

2001

;

19

:

167

169

.3.

Hillger

F.

,

Hanni

D.

,

D.

,

Nettels

D.

,

Geister

S.

,

Grandin

M.

,

Textor

M.

,

Шулер

Б.

Исследование взаимодействия белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

.

Анжю. хим. Междунар. Эд.

2008

;

47

:

6184

6188

.4.

Gubaev

A.

,

Klostermeier

,

D.

KlosterMeier

D.

,

D.

,

Hammann

C.

РНК Структура и складные: биофизические методы и методы прогнозирования

.

2013

;

Берлин

Де Грюйтер

181

214

.5.

Пеулен

Т.О.

,

Опанасюк

О.

,

Зайдель

К.А.М.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET с временным разрешением меченых макромолекул

.

J. Phys. хим. Б

.

2017

;

121

:

8211

8241

.6.

McPhee

S.A.

,

Huang

L.

,

Lilley

D.M.

Критическая пара оснований в k-витках, придающая характеристики складчатости и коррелирующая с биологической функцией

.

Нац. коммун.

2014

;

5

:

5127

.7.

Dumat

B.

,

Larsen

A.F.

,

Wilhelmsson

L.M.

Рез. нуклеиновых кислот.

2016

;

44

:

e101

.8.

Вранне

М.С.

,

füchtbauer

,

AF

,

DUMAT

B.

,

B.

,

Bood

M.

,

EL-SAGHEER

AH

,

BROWN

T.

,

Gradén

H.

,

Grøtli

M.

,

Wilhelmsson

LM

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

.

Дж. Ам. хим. соц.

2017

;

139

:

9271

9280

.9.

Füchtbauer

A.F.F.

,

Pruus

S.

,

S.

,

Börjesson

K.

,

MCPhee

S.A.

,

Lilley

D.M.J.

,

Wilhelmsson

L.M.

Аналог флуоресцентной РНК цитозина – внутренний зонд для детальных структурных и динамических исследований

.

Науч. Респ.

2017

;

7

:

2393

.10.

Шин

Д.

,

Синкельдам

Р.В.

Дж. Ам. хим. соц.

2011

;

133

:

14912

14915

.11.

Ровира

А.Р.

,

Fin

A.

,

Tor

Y.

Химический мутагенез эмиссионного РНК — алфавита

.

Дж. Ам. хим. соц.

2015

;

137

:

14602

14605

.12.

Се

Ю.

,

Дикс

А.В.

,

Tor

Y.

FRET позволяет обнаруживать связывание РНК с малой молекулой в режиме реального времени

.

Дж. Ам. хим. соц.

2009

;

131

:

17605

17614

.13.

Tanpure

А.А.

,

Шриватсан

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве топологически специфичных зондов включения флуоресценции для ДНК и РНК G-квадруплексов

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

;

43

:

e149

.14.

Эрнандес

А.Р.

,

Кул

Э.Т.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора рибонуклеозидов увеличенного размера

.

Орг. лат.

2011

;

13

:

676

679

.15.

Börjesson

K.

,

Preus

S.

,

El-Sagheer

A.H.

,

Браун

T.

,

ALBINSSON

B.

,

Wilhelmsson

,

Wilhelmsson

L.M.

L.M.

База нуклеиновой кислоты Аналоговая пара облегчает детализированные структурные измерения в системах содержащих нуклеиновой кислоты

.

Дж. Ам. хим. соц.

2009

;

131

:

4288

4293

.16.

Bood

M.

,

Füchtbauer

A.F.

,

Wranne

M.С.

,

Ро

Дж.Дж.

,

Сарангамат

С.

,

Эль-Сагир

А.Х.

,

Руперт

Д. Л.М.

,

Фишер

Р.С.

,

Magennis

Ю.В.

,

Jones

AC

и др. .

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

.

Хим. науч.

2018

;

9

:

3494

3502

.17.

Хан

Дж.Х.

,

Yamamoto

S.

,

Park

S.

,

Sugiyama

H.

Разработка аналоговой FRET-системы на основе высокоэмиссионной

Хим. Евро. Дж.

2017

;

23

:

7607

7613

.18.

Миллер

М.Л.

,

Доран

М.

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

.

J. Phys. хим.

1956

;

60

:

186

189

.19.

Preus

S.

,

Kilså

K.

,

K.

,

K.

,

Miannay

FA

,

ALBINSSON

B.

,

Wilhelmsson

LM

Fretmatrix: общая методология для моделирования и анализа FRET в нуклеиновых кислотах

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

;

41

:

e18

.20.

Лу

X.J.

,

Олсон

В.К.

3DNA: пакет программного обеспечения для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2003

;

31

:

5108

5121

.21.

Олсон

В.К.

,

Бансал

М.

,

Берли

С.К.

,

Дикерсон

Р.Е.

,

Gerstein

M.

,

Harvey

S.C.

,

Neidle

S.

,

Shakked

Z.

и др. .

Стандартная система отсчета для описания геометрии пар оснований нуклеиновых кислот

.

Дж. Мол. биол.

2001

;

313

:

229

237

.22.

SANDIN

P.

,

BÖRJESSON

,

K.

,

LI

,

LI

H.

,

Mårtensson

J.

,

Brown

T.

,

Wilhelmsson

LM

,

Albinsson

B.

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно ненарушающего флуоресцентного аналога основания ДНК

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2008

;

36

:

157

167

.23.

Pruus

S.

,

Börjesson

,

K.

,

Kilså

K.

,

K.

,

ALBINSSON

B.

,

Wilhelmsson

LM

Характеристика Nucleobase Analogy Acceptore Tactor TC нитро

.

J. Phys. хим. Б.

2010

;

114

:

1050

1056

.24.

Чжэн

Г.Х.

,

Лу

Х.Дж.

,

Олсон

В.К.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2009

;

37

:

W240

W246

.25.

Серебряный

В.

,

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

.

Тетраэдр Летт.

2002

;

43

:

1983

1985

.26.

SINHA

ND

,

Biernat

J.

,

J.

,

MCManus

J.

,

Köster

H.

Полимерная поддержка Олигонуклеотидный синтез XVIII: использование β -цианоэтил- N , N -Диалкиламино-/ N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающий снятие защиты и выделение конечного продукта

.

Рез. нуклеиновых кислот.

1984

;

12

:

4539

4557

.27.

XU

Y.

,

ISHIZUKA

T.

,

T.

,

T.

,

T.

,

T.

,

KOMIYAMA

M.

A U-тетрад стабилизирует телемерную rna rna rna g-addruplex

.

Дж. Ам. хим. соц.

2010

;

132

:

7231

7233

.28.

Ван

А.HJ

,

Куигли

Г.Дж.

,

Колпак

Ф.Дж.

,

Кроуфорд

Дж.Л.

,

Ванбум

Дж.Х.

,

Vandermarel

G.

,

Rich

A.

Молекулярная структура фрагмента левосторонней двойной спирали ДНК с атомным разрешением

.

Природа

.

1979

;

282

:

680

686

.29.

Зал

К.

,

Круз

П.

,

Тиноко

И.

,

Джовин

Т.М.

,

Вандесанде

Дж.Х.

Z-РНК — левосторонняя двойная спираль РНК

.

Природа

.

1984

;

311

:

584

586

.30.

Зарлинг

Д.А.

,

Калхун

CJ

,

Feuerstein

B.G.

,

Сена

Э.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, ингибирует рост клеток человека

.

Дж. Мол. биол.

1990

;

211

:

147

160

.31.

Пласидо

Д.

,

Браун

Б.А.

,

Lowenhaupt

K.

,

K.

,

Rich

A.

,

ATHANASIADIS

ALTANASIADIS

A.

А.

А.

Двойная спираль RNA RNA, связанная Z Alpha affra of RNA-редактирования фермента ADAR1

.

Структура

.

2007

;

15

:

395

404

.32.

Popenda

M.

,

Milecki

J.

,

Adamiak

R.W.

Рез. нуклеиновых кислот.

2004

;

32

:

4044

4054

.33.

Шварц

Т.

,

Роулд

М.A.

,

Lowenhaupt

K.

,

Herbert

A.

,

Rich

A.

Кристаллическая структура Z-DNA альфа-домена связанного с левосторонним редактирующим ферментом ADAR1 человека

.

Наука

.

1999

;

284

:

1841

1845

.

Примечания автора

© Автор(ы), 2019 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Молекулярные детерминанты контактов ЭР–Гольджи, идентифицированные с помощью новой системы FRET–FLIM | Журнал клеточной биологии

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе потребности идентифицированных хитов в поддержании ERTGoCS, и, в частности, зависело ли это от их активности переноса липидов. ORP10 ассоциируется с микротрубочками, а также с комплексом Гольджи (рис. 5А; Nissilä et al., 2012), и, не обладая каноническим доменом FFAT, может взаимодействовать с VAP (Weber-Boyvat et al., 2015; Мерфи и Левин, 2016). ORP10 принадлежит к подсемейству ORP, которое включает членов, которые могут передавать PS (Maeda et al., 2013), такие как ORP5 и ORP8, которые передают PS в обмен на PI4P между ER и PM (Chung et al. , 2015), в то время как Было показано, что сам ORP10 связывает и экстрагирует PS (Maeda et al., 2013). Мы заметили, что остатки oxysterol-related domain (ORD) ORP5/ORP8, которые участвуют в обмене PS/PI4P (Chung et al., 2015), очень хорошо консервативны в ORP10 (Fig. 5B).Чтобы выяснить, связана ли потребность в ORP10 в поддержании ERTGoCS со структурной ролью или с его активностью по переносу липидов, устойчивый к siRNA ORP10 был реэкспрессирован в клетках с истощенным ORP10, как в его форме WT, так и в формах, где сайты ORD участвуют в Связывание PS (L418D) и PI4P (H535/536A) было мутировано (фиг. 5B). Мы обнаружили, что WT, но не мутантные формы ORP10, которые были правильно нацелены на комплекс Гольджи (рис. 5C), могут восстанавливать ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис.5D и рис. S3, A и B), что указывает на то, что активность ORP10 по переносу липидов необходима для стабильности этих MCS. PS синтезируется в ER, но обогащен в PM, TGN и эндосомах (Leventis, Grinstein, 2010; Fairn et al. , 2011), где он асимметрично распределен между двуслойными листками, ограничиваясь цитозольным листком. Таким образом, мы проверили возможность того, что ORP10 может участвовать в переносе PS из ER в цитозольный листок мембран TGN, изучая влияние истощения ORP10 на внутриклеточное распределение PS с использованием двух различных генетически кодируемых зондов: PS-связывающий домен лактадгерина (домен C2; Yeung et al., 2008; рис. 5 E) и эвектина (домен PH; Uchida et al., 2011; рис. S3 C). Мы обнаружили, что истощение ORP10 вызывало снижение PS на аппарате Гольджи, что оценивалось по распределению двух зондов PS (рис. 5 E и рис. S3 C), что показало заметное снижение пула Golgi (но не PM). пул) в клетках ORP10-KD, а также по наблюдению за тем, что меньшее количество мембран TGN из клеток ORP10-KD сохранялось на PS-аффинных шариках по сравнению с контрольными клетками (рис. S3 D).

Таким образом, ORP10 требуется для защиты содержимого PS в TGN и, в то же время, ERTGoCS (рис. 4, А–Ф; рис. 5 Д; и рис. S3, C и D), что указывает на то, что липидный состав TGN и, в частности, содержание в нем PS имеет решающее значение для создания/поддержания этих структур. Подтверждая эту гипотезу, экзогенное добавление PS частично восстанавливало ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис. 5 F). Сходные результаты были получены, когда производство PS было усилено за счет сверхэкспрессии мутантной (P269S) формы PS-синтазы 1, которая нечувствительна к ингибированию продукта (Sousa et al., 2014; Зон и др., 2016; Рис. 5 G и Рис. S3 E).

Мы рассмотрели тот же вопрос (т. е. структурную роль в сравнении с ролью, зависящей от переноса липидов, в поддержании ERTGoCS) для OSBP1, который оказался обязательным партнером ORP9 в поддержании ERTGoCS. С этой целью мы изучили влияние итраконазола, ингибитора активности липидного обмена OSBP1 (Strating et al., 2015), на стабильность ERTGoCS и обнаружили, что он не оказывает ингибирующего действия ни в контрольных клетках, ни в ORP9-KD.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

2019 © Все права защищены. Карта сайта