Ефремов ярослав отзывы: Автоподбор от Ярослава Ефремова отзывы

Ефремов Ярослав Юрьевич: 1 отзыв, ортопед, где принимает

Отзывы о местах приема

Вымогатели. Наглые и совершенно бессовестные. Результаты могут быть как занижены, так и завышены, в зависимости от того, как дальше собираются выкачивать деньги с вас. Всегда идеальная спермограмма по результатам разных клиник, в «Альтаире» «вдруг» оказывается очень плохой, а через два дня в другом центре — снова идеальна. По поводу ЭКО по ОМС — даже не думайте. Евгений Владимирович сразу берет быка за рога и заявляет, что, во-первых, необходимо все-таки оплатить 29 тысяч за бесплатную процедуру, а во-вторых: «Ну, вы же понимаете, что качество услуг платно и бесплатно будет различным? — Вы имеете ввиду дополнительные услуги при подготовке к ЭКО? — Нет, именно качество. Вы же понимаете, что нельзя купить БМВ за 500 тысяч?» То есть, за те деньги, вполне, кстати немаленькие, которые страховая перечисляет клинике, вам окажут некачественную услугу. А что именно, уважаемый Евгений Владимирович, некачественного может быть в процедуре ЭКО? Вы не семечки продаете, на минутку. Типа — это у нас по ОМС, ДАУНа сделайте им. Да? Вы не сказали, что могут понадобиться более качественные и дороге препараты при подготовке, мол, рекомендуем докупить, вы прямо заявили, что по ОМС качественных услуг не оказываете. Ну, как говорится, не хотите кулеш — сидите без углеводов. На самом деле, конечно, ничего страшного не произойдет, скорее всего, просто процедуру придется пройти дважды, а то и трижды, пока клиника не решит, что им достаточно денег от ОМС. В случае с ЭКО, клиника по сути просто пользуется отсутствием альтернативы, то есть в Орле прийти и обсудить, непосредственно можно только у них, но на самом деле, собрать документы на процедуру в любом Московском центре, где вам все сделают сразу, качественно и без вымогательств — совсем не сложно. Идите к гинекологу-акушеру по месту прописки или в Орловский перинатальный центр — не суть важно, вам нужно собрать кипу бумаг и анализов, а клинику вы потом выберете уже сами.

А анализы сдавайте только в лабораторно-исследовательских центрах, которые не оказывают услуг по лечению — им просто нет смысла вас обманывать.


Хочется сказать большое человеческое спасибо врачам: Искоростинским Евгению Владимировичу и Ольге Александровне, а также всему персоналу клиники «Альтаир» за то, что помогли осуществить нашу мечту! Благодаря им, мы обрели наше счастье — сынишку Ивана! Медицинские услуги оказываются на высоком уровне и по профессионализму ничуть не уступают столичным клиникам. В этой клинике мы наблюдаемся с 2012 года и за это время врачи и персонал стали для нас добрыми друзьями. Рекомендуем всем, кто имеет проблемы с бесплодием не спешить ехать в Москву или Питер, а обратиться в «Альтаир»! Это не пустые слова, мы всё лечение прошли там и знаем, что говорим.


Проходя комиссию в медицинском центре «Альтаир», 23. 03.16, столкнулась с тем, что врач, а именно гинеколог, работал на два кабинета. Непосредственно в гинекологии и периодически делая флюорографию, бегая с этажа на этаж. Что создавало неблагоприятную обстановку: нервозность, очереди и т. п. А терапевт вообще на 30 минут пропал из кабинета, создав тем самым очередь. В целом, если не бывает каких-либо организаций по 30 и более человек, проходящих комиссию и не пропускающих других людей, пока не пройдут все люди из их организации, работа медицинского центра оцениваются на 4 балла по 5-бальной шкале.


На мой взгляд, медицинский центр «Альтаир» — одно из немногих мест, где с тобою врач действительно работает. Подскажите мне хотя бы одно место, где на приеме врач беседует с вами 30-40 минут. Только для того, чтобы понять, какой у вас образ жизни, как вы питаетесь, какова ваша подвижность и т. д. Все это делается для того, чтобы правильно поставить вам диагноз и определить степень заболевания и его сложность, а не пичкать вас со старта тоннами таблеток. В моем случае все было достаточно просто и быстро, хотя, болезнь давала о себе знать достаточно серьезно. Мы очень долго разговаривали и выясняли все обстоятельства, которые привели к этому. После чего были сданы все необходимые анализы и назначено лечение. Спустя месяц, я был как новенький. Огромное спасибо Искоростинскому Е. В. за профессиональный и индивидуальный подход к каждому клиенту. Спасибо вам, Евгений Владимирович!


У меня не получалось забеременеть долгое время естественным путём, решили с мужем обратиться в клинику «Альтаир», сначала проконсультироваться по поводу ЭКО. Нам всё доступно объяснила Искоростинкая О. А., и мы решили начать готовиться. Все анализы сдавали в этой же клинике, очень удобно, все кабинеты рядом, очереди ждать не приходилось. Всё это время врачи нас поддерживали и настраивали на лучшее, а это Искоростинский Евгений Владимирович и Искоростинская Ольга Александровна. Сама стимуляция проходила в Орле, а пункция и перенос в Москве, что очень удобно. У меня был короткий протокол, после стимуляции поехали в Москву, для дальнейший действий. Клиника-компаньон, с которой сотрудничает «Альтаир», так же нам понравилась, и вот с первого раза у нас всё получилась! Выражаем огромное человеческое спасибо квалифицированным врачам «Альтаира». Если вам необходимо ЭКО, не откладывайте это дело на потом, лучше сразу обратитесь к врачам.

16 февраля 2016 г.


Отзывы – Студия Облик

Видеоотзывы

Отзывы юридических лиц

                           

 

 

Отзывы клиентов на сторонних ресурсах

Февраль 2021. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

Декабрь 2020. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Ноябрь 2020. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Ноябрь 2020. Ссылка на первоисточник: google.ru

Октябрь 2020.

Ссылка на первоисточник: google.ru

 

Октябрь 2020. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

Сентябрь 2020. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Сентябрь 2020. Ссылка на первоисточник: google.ru

Сентябрь 2020. Ссылка на первоисточник: google.ru

Август 2020. Ссылка на первоисточник: google.ru

Июль 2020. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

Июль 2020. Ссылка на первоисточник: google.ru

Апрель 2020. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

Март 2020. Ссылка на первоисточник: google.ru

Март 2020. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

Ноябрь 2019. Ссылка на первоисточник: google.ru

Ноябрь 2019. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

Июль 2019. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Июль 2019. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

Март 2019. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Декабрь 2018. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Ноябрь 2018. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Ноябрь 2018. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Январь 2018. Ссылка на первоисточник: drive2.ru

Октябрь 2017. Ссылка на первоисточник: yandex.ru

 

“Делал полировку+бронирование, пользуюсь их услугами уже лет 7. Доволен! Могу рекомендовать.”

Ссылка на первоисточник: google.ru

“Ребята молодцы, делают все на совесть. Машина после посещения студии выглядит шикарно! Скоро поеду с новым авто к ним….”

Ссылка на первоисточник: google.ru

“Отличные Ребята!!! Всё на высшем уровне!!! Спасибо большое!!! Рекомендую!!!”

Ссылка на первоисточник: yandex.ru

“Делаю детейлинг здесь уже не первый год – все замечательно! Николай вообще супер))”

Ссылка на первоисточник: yandex.ru

“Оставляла в студии свой Форд Мондео, ребята делали восстановительную полировку и защиту кузова. Результатом довольна – сделали всё качественно, исчезли царапины, потертости. Машина блестит как новая)) Понравился персонал, очень терпеливо и доброжелательно отвечали на все вопросы, большое спасибо! Место рекомендую”

Ссылка на первоисточник: yandex.ru

“Делали здесь химчистку авто впервые за 4,5 года. Результат очень впечатлил! На заднем сидении катается собака, на переднем была неудачная попытка очистить жирное пятно самостоятельно, на потолке – следы протечки воды через дверь багажника. Сейчас всё выглядит идеально! Машину забрала чистую, сухую и красивую. Спасибо!”

Ссылка на первоисточник: yandex.ru

“Добрый день! Хочу поделиться отзывом о студии детейлинга “Облик”. Это действительно “чудомастерская” – ребята отзывчивые, встречают и делают все на УРА! Молодцы, очень опытные мастера!. Большое Вам спасибо за все мои “кадиллаки”. Все мои машины после Вашей работы выглядели на 10+. Спасибо за отличную работу и пусть у Вас всегда будет много заказов!!! Всех Вам благ!!”

Ссылка на первоисточник: google.ru

 

“Сдавал авто на химчистку на Большеохтинский. Все очень понравилось. И отношение к клиенту и результат работы. Салон машины был мягко говоря запущен, в результате химчистки стал как новый. Спасибо ребятам за работу. Теперь планирую и вторую машину к ним же отогнать на химчистку. Мастерам спасибо за работу! Салону процветания и побольше клиентов!”

Ссылка на первоисточник: spb.zoon.ru

 

“Так случилось что у меня на руках оказался сертификат от компании Облик на сезонную чистку автомобиля Mazda , решил воспользоваться !!!Созвонился с ребятами (812) 642-26-71 , было предложено два сервиса на выбор.
Приехал в оговоренное время , встретили без опозданий и радушно , вышел мастер приемщик , запустил в закрытую территорию , загнал машину в бокс. Встретился с Александром , обговорили все мои желания и то что полагается согласно сертификата ! Выгрузил всю мелочь из авто ( ох сколько же ее много ))) и оставив машину ребятам на сервис уехал домой . Через 4 часа мне позвонил Александр и сообщил что через час все будет готово и я могу забрать своё авто , попив кофе я вызвал такси и поехал .

Увидев салон машины я не много офигел !!! Салон выглядел как новый , не хватало только запаха нового автомобиля .
За зиму ковры пришли в негодность и я задумывался их сменить но ребята их так вычистили что я уже передумал ))) Пластик и стекла были очищены до состояния нового !!! Сиденья и полка багажника приобрели новую жизнь ! Спасибо компании Облик за качественное обслуживание !!! Чистку кузова и полировку буду делать у них !!!”

Ссылка на первоисточник: cx-5.ru

 

“Уже недельку откатал, полет нормальный:) спасибо Вам ещё раз огромное!”

Ссылка на первоисточник: instagram.com

 

“С 2010 года езжу в “ОБЛИК”, уже 3я машина, которая 2 раза в год покрывается у них. Изредка бывают замечания по качеству, но все исправляется быстро и без вопросов + по гарантии за год можно убирать царапины бесплатно, чем и пользуюсь.”

Ссылка на первоисточник: yandex.ru

 

“Ездила в студию на химчистку салона и нанесение защитного покрытия на кузов. Химчистка салона – полный восторг: ощущения после нее такие же, как при первой поездке из автосалона на новой машине. Внутри все очень чисто и даже запах как будто нового авто. Очень понравилось гидрофобное покрытие на стекла. Дворники теперь не нужны 🙂
Защитное покрытие на кузов – вообще отдельная история. У меня черная машина, и на краске видны все царапины и сколы. А еще даже после мойки она как будто все равно грязная – присутствует какой-то налет. После поездки в студию Облик стало не видно мелких царапин, ребята-мастера подкрасили мне сколы, нанесли защитное покрытие. Машина снова начала блестеть, черный цвет стал очень черным. На ощупь машинка стала очень приятная. А на мойке грязь смывается, не оставляя налета, как раньше. Для черных автомобилей нанесение защитного покрытия – мастхэв. Каждый раз, проходя мимо машины, снова засматриваюсь на нее, как на новую!”

Ссылка на первоисточник: google.ru

 

“Как всегда сделали все по высшему разряду! спасибо!”

Ссылка на первоисточник: instagram. com

“Хочу выразить благодарность студии детейлинга Облик за очередное обновление внешнего вида моего кота: сделана легкая восстанавливающая полировка и нанесен гиброфоб СERAMIC PRO LITE, а также гидрофоб на передние стекла автомобиля. Как всегда все работы сделаны безукоризненно, спасибо вам за качество и профессионализм!”

Ссылка на первоисточник: jaguarclubrussia.com

“Обратился в данную фирму для комплексной обработки своего авто Cadillac XT5. Авто новая (4 месяца), но щебень и камни не щадят никого, были приличные повреждения ЛКС, да и блеск новизны уже прошёл. Покопавшись в интернете и почитав отзывы выбрал данную фирму, и не пожалел. Максимальная защита +антигравийная пленка на передок, были моим выбором. Менеджер Даниил встретил, дружелюбно ответил на вопросы, сделал рекомендации и ребята приступили к работе. Срок исполнения работ 4 дня, зато результат на лицо. Машинка блестит как новая из салона. Работа безупречная!!! Спасибо Вам огромное, дай Бог Вам здоровья и процветания!!! Отдельное спасибо за сделанную скидку, было очень приятно!!! Уважаемые автолюбители обращайтесь в данную фирму не пожалеете! Народ знает своё дело! Отношение к клиентам на высшем уровне! Молодцы ребята, так держать!!! 10 баллов из 5!”

Источник: vk. com

Ссылка на отчет: oblikdetailing.ru

“Отличный сервис. Мазда 6 2012г. В 2015 делал в Облике на Удельной 2 слоя 9H. Все сколы подкрасили, царапины заполировали, отполировали фары, стекла покрыли таким антидождем, что полгода никакой грязи не прилипало. В 2016 ездил на обновление, сейчас тоже собираюсь. Машина выглядит отлично для 5 лет.”

Ссылка на первоисточник: mazda6.ru

“В последнее время стал все больше обращать внимание на потемневшие (читай грязные) части салона. Решил поехать в ту же студию детейлинга Облик, на Большеохтинский (у них на сайте есть второй адрес), но в этот раз сделать только химчистку салона и багажника, и все. На улице грязь. Делать снаружи что-либо можно только весной. Машина была в работе сутки. Вчера забрал. Внутри вся прямо блестит. Чистота и красота.
Даже хочется каждый раз вытереть ноги перед посадкой.”

Ссылка на первоисточник: drive2.com

 

“С момента приобретения до конца марта погода была преимущественно хорошая, но это не помешало машине покрыться толстым слоем дорожной пыли, а уж на дверь багажника без слез и вовсе невозможно смотреть.  Кроме того, ЛКП нуждается в защите, так что я решился на диковинную пока что процедуру детейлинга. Если сомневаетесь, что это редкость в наших краях и умах — спросите любого на улице, что такое детейлинг 🙂 Я посмотрел профиль oblikdetailing, проникся портфолио и получил заслуженную скидку.

После обсуждения с менеджером сошлись на программе “Стандарт” (2 слоя Ceramic Pro 9H, Ceramic Pro Light + антидождь Aquapel по кругу, ну и все вспомогательные мероприятия, включая мойку и чистку). За счет скидки поклеили пленкой фары от пескоструя, почистили салон и положили уже наконец ковры 🙂

Сама студия находится в не внушающем доверие мрачном и темном здании паркинга на Костромском проспекте, 62, а заехать туда (особенно на хоть сколько-нибудь габаритном автомобиле) — та еще эпопея. Но ребята вроде как свое дело знают, а в качестве особого шага навстречу даже привезли терминал для оплаты банковской картой.

Собственно, сдал в 10 утра в субботу, спустя ровно сутки получил обратно. Из видимых и ощущаемых изменений — предсказуемая гладкость ЛКП. Надеюсь, что оно еще и защищает, как рекламировали. Гораздо значимее в повседневной эксплуатации оказался антидождь. Я сразу выехал на ЗСД и погнал через весь город по стандартной мерзковатой погоде с моросящим дождем. Покрытие действительно работает! Капли сгоняет со стекла, омывайка не нужна, да и дворники включаешь один раз за поездку. Посмотрим, конечно, как оно поведет себя под ливнем, но пока впечатления крайне положительные.”

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“Вот незадача — бесячая соседка на парковке бизнес-центра царапнула меня дверью своей красной Ауди, и достаточно глубоко. Сфоткать не успел, но царапины видели все, думаю, представляете. К счастью, на детейлинг от студии oblikDetailing есть честная гарантия — записался, заполировали, привели в полный порядок и помыли заодно. На все про все ушло три часа и ноль нервных клеток.”

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“Отдал машину на три дня в oblikdetailing.  Ребята сделали восстановительную полировку, нанесли покрытие на кузов и стекла. Почистили и пропитали салон!

Машин как новый.”

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“При покупке авто делал защитное покрытие, но т.к человек бросил этим делом заниматься, а в эксплуатации авто уже 2 года и наматывает примерно по 50 тыс км в год, то решено было вернуться к защите ЛКП.

Машина белая, это радует, говен москвоских и питерских на ней видно не так сильно, как на предыдущей синей. Пользуясь рекламой товарищей Leo-Spb и Vaucher, посещая родной город решил сдаться в Облик 🙂

По факту — результатом очень доволен.”

drive2.ru

 

“Так случилось что у меня на руках оказался сертификат от компании Облик на сезонную чистку автомобиля Mazda , решил воспользоваться !!!
Увидев салон машины я не много офигел !!! Салон выглядел как новый , не хватало только запаха нового автомобиля. За зиму ковры пришли в негодность и я задумывался их сменить но ребята их так вычистили что я уже передумал ))) Пластик и стекла были очищены до состояния нового !!! Сиденья и полка багажника приобрели новую жизнь ! Спасибо компании Облик за качественное обслуживание !!! Чистку кузова и полировку буду делать у них !!!”

Ссылка на первоисточник: mazda6. ru

“Прошла зима и подошло время весенней полировки кузова + нанесения покрытия Ceramic PRO.
В плане выбора куда обратиться уже всё было решено, отправился к тем же ребятам что и в прошлый раз, в студию детейлинга “oblik”. Всё сделали очень круто, я доволен)”

Ссылка на первоисточник: drive2.com

 

“В конце летнего отпуска, после поездки в Крым, наградил Оскара восстанавливающей полировкой с нанесением защитного покрытия и химчисткой салона. Работу поручил студии детейлинга “Облик” в Спб в их филиале на Большеохтинском. Результатом остался доволен, мелкие царапинки ушли, машинка стала гладенькой, и антидождем еще лобовуху обработали.”

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“Прекрасно работают. Предпродажная подготовка великолепная. За 2 дня из зачухонного грязного до мозга костей, исцарапанного Пажеро Спорт сделали блестящую машину. При обмене в салоне по трейд ин зачли почти миллион. Огромное спасибо. Скоро приеду на новой для обработки.”

Ссылка на первоисточник: vk. com

 

“С окончанием весны зеленый кот стал выпрашивать подлечить ему лкп от абразива с дорог и было принято решение отдать его старым знакомым: студии oblik detaling, которые переехали в новый бокс на Большеохтинский проспект.
Был проведен комплексный детейлинг — восстановительная полировка, защитное покрытие Ceramic PRO LITE и химчистка салона. Результат — выше всех похвал!”

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“Ко всем этим вашим нанополиролям, керамике и прочим body glass guard я относился с изрядной долей скепсиса. Ровно до того момента пока не попробовал их на своей шкуре, а точнее на ЛКП моего пыжа. Как оказалось есть вещи лучше нового авто. Это новое авто, которое побывало в руках профессиональных детейлеров.”

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“Езжу в студию облик ещё со времён их нахождения в Янино, все честно, открыто и понятно. Косяки бывают (один раз дважды переделывали полировку), но гарантия работает без вопросов, и за свои косяки обычно делают доп бонусы. Вообщем советую :)”

Ссылка на первоисточник: google.ru

“В Облике делал свой w212 полировка с защитой, этой весной. Остался очень доволен, машина стала как новая, если XC куплю, после ТО сразу к нему поеду.
Делают всем качественно, не зависимо с клуба ты или нет. Любят и знают своё дело, относятся с высокой ответственностью.”

Ссылка на первоисточник: clubvolvo.ru

 

“Делали химчистку. Все быстро и качественно + скидка) Большое спасибо! ”

 

 

“Решил подготовить машину к лету, а именно отполировать, нанести защитное покрытие (остановился на Ceramic Pro Light, лучшее по соотношению цена/качество) и почистить салон. Очень порадовал подход ребят к работе, всё было сделано качественно и без вопросов. За объём предоставили приятную скидку, ценник в результате получился более чем адекватный.

Машине скоро 7 лет, а выглядит теперь как новая. Особенно хотелось подчеркнуть важность нанесения защиты – прошло уже около 4 месяцев, а гидрофобное покрытие так и работает, на скорости капельки слетают как со стёкол, так и с кузова. Всем советую!”

gorod.yandex.ru

 

“Что можно сказать о проделанной работе?! конечно же доволен на все сто!! Долго я шёл к тому, чтобы обработать свой авто какой-нибудь керамикой, почти год не мог решиться, и вот наконец разродился.. Сейчас понимаю, что надо обрабатывать сразу, с новья. И по деньгам дешевле, и не появиться всей этой “дряни” от повседневной эксплуатации. Но даже если на новую машину пожмотились, то на потрепанной ещё эффектнее будет виден результат.

О результате: машина стала, как будто из салона, вся блестит, переливается. Очень удивлен, как подправили пластик на рамках дверей, который я безжалостно раскорябал скребком, пытаясь проникнуть в примерзшие двери. Теперь он выглядит идеально!, даже лучше чем было изначально. Интересен конечно гидрофобный эффект, и насколько его хватит? Тут пока сказать ничего не могу, возможно напишу позже, если не забуду.

Конечно же всем буду советовать “Облик”, потому как: 1) дешевле не найдете 2) уверенность в качестве результата 3) ну и отдельный перфекционизм и пунктуальность руководителя студии. От этого тоже многое зависит.”

Ссылка на первоисточник: vk.com

 

“Автомобиль я приобрел после полугодового простоя у ОД, за это время с него столько раз сдували пыли и протирали тряпочкой, что понять, как должен выглядеть настоящий White Diamond Tricoat за 1000$ понять было невозможно, а каталоги и вовсе не передавали красоты этой краски, в общем ребятам из Облик удалось вернуть мне 1000$ за цвет )”

Ссылка на первоисточник: Drive2.ru

 

“Если же говорить о моем впечатлении, то я очень доволен. Также хочу сказать, что у меня ни разу не был нанесен на стекла антидождь, теперь с уверенностью могу сказать, однозначно мастхэв.”

Ссылка на первоисточник: Drive2.ru

 

“Был проведен комплексный детейлинг — восстановительная полировка, защитное покрытие Ceramic PRO LITE и химчистка салона. Результат — выше всех похвал! Теперь с кота как с гуся вода в прямом смысле!;) Всем рекомендую!”

Ссылка на первоисточник: Drive2.ru

 

Результатом очень доволен, ребята работают с душой и делают как для себя. Вылизали машину до блеска, показали на многие косяки, которых я раньше не замечал, надавали кучу рекомендаций по уходу, поделились кучей полезных контактов.

Ссылка на первоисточник: Drive2.ru

 

“После покраски мест, побитых камушками, задумался об укреплении лакокрасочного покрытия (ЛКП). Авто не молодое и ЛКП крайне не любит внешних воздействий. Обзор показал, что чего-то бюджетного, что могло бы защитить от ударов камушков и укрепить ЛКП, на рынке нет. Поэтому остановился на керамике Light, которая идет вместе с полировкой авто. Дорого, но альтернатив я не нашел. Через форум нашел компанию Облик. Делают быстро. Управились за два дня.
Не могу сказать, что после полировки и керамики авто как-то очень сильно преобразился. Он и до процедур не плохо смотрелся. Да, все стало посвежее. Но посмотрим как это покрытие будет работать в течении года. Будет ли от него реальная защита.
Из мелких косяков было — в салоне полностью не успели высохнуть сидения, а так же они забыли пропылесосить салон после последней “подстрижки” алькантры. Но, надо сказать, после звонка и моего приезда к ним, все устранили.”

Ссылка на первоисточник: Drive2.ru

 

“В октябре сделал полировку и обработку кузова ceramic pro light, делал в студии детейлинга o-blik.spb.ru/, спасибо ребятам за работу и подход к делу, все очень понравилось. Синий цвет смотрится после обработки конечно не так эффектно как черный, но результат обработки классный, лкп стало как новое, снова блестит, появился сильнейший гидрофобный эффект, защитные свойства намного лучше чем у восковых покрытий и эффект должен держаться не менее 6 месяцев. Буду наблюдать.”

Ссылка на первоисточник: Drive2.ru

 

“Сегодня заезжал, царапинку маленькую убрать на ку7 – все на 5+. Огромное спасибо!”

 

 

“Еще и здесь большое спасибо, за качественную химчистку и полировку а/м, фары так вообще не узнать блестят как новые.”

 

 

“Давно забрал машину, но всё как то было с мыслсями не собраться что либо написать. В целом очень доволен. Авто получил утерянный за 5 лет лоск и обрёл доп. защиту. Как внутри, так и снаружи. А на солнце на больше хочется смотреть на отблески света, нежели ездить)))

Ещё крайне порадовало покрытие стёкол. На скорости от 90 км в сильный дождь дворники можно в-принципе не включать – всё само сдувается. Большой респект парням за трудолюбие и внимательность. Месяцев через 5 привезу на обновление. Вроде что то фоткали – может и фотки выложат в подтверждение моих слов =)”

 

 

В общем то, я давненько планировал обработку кузова, к тому же этот “ужасный” черный цвет… Да, смотрится хорошо, но все мелкие царапины видны. И вот я поехал к Николаю в студию “Облик”. Собственно, что было сделано:

Кузов — очищающая полировка + Ceramic PRO Light

Мотор — Goldenstar + Motorplast (консервант)

На мой взгляд,  очень хорошие спецы. Что понравилось больше всего — не было навязываний ненужного или чего подороже. Все оговорили, про все рассказали. В общем, впечатления положительные =)

Так же бонусом были обработаны все стекла антидождем (в обработку кузова входили только передние и лобовое) и ионизация салона. Что очень приятно.

ЗЫ что могу сказать про все это покрытие. На столько ли эффективно защищает от царапин и внешнего воздействия, как преподносит реклама — я не знаю, но защита в общем то есть. По крайней мере с октября и до июля покрытие, на мой взгляд, еще осталось. Антидождь держится, даже на лобовом. Единственное после зимнего обмерзания половины лобового видно, что такой экстрим аквапель перенес плохо — стерся.

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

“Забыл отзыв написать – химчистил тканевый салон, остался очень доволен качеством и подходом! с обычными мойками даже не сравнить. Сделали действительно на совесть, рекомендую!!”

 

 

“Сам никак до Вас доехать не могу, но этим летом рекомендовал трем друзьям полировку у Вас, новый мерс е200, синяя бмв 335 и мазда 6, все остались очень довольны подходом и результатом. Надеюсь сам к следующему лету все таки доберусь на химчистку и полировку субика”

 

 

“Огромное спасибо студии за проделанную работу, знаю автомобиль был не простым, но результат просто 5 баллов, такой я свою машину не видел даже в момент покупки новой в салоне. Всем рекомендую”

 

 

“Спасибо за работу. Делал давно, отписываюсь только сейчас. Во первых отлично освежили и намыли машину, дали кучу советов и все это за вполне бюджетную сумму. Очень понравилось отношение к клиентам, какое-то чисто человеческое, дружеское. Работу свою делают на отлично! В общем всем советую.”

 

 

“Спасибо за отличную полировку фар моей лачетти! Всю обратную дорогу радовалась тому, как лучше светить стали! Только с выездом из бокса что-нибудь сделайте, чуть не поседела пока маневрировала :-)”

Ссылка на первоисточник: alcotourism.ru

 

“Пользуясь случаем, хочу выразить благодарность за проделанную кропотливую и непростую работу!”

Ссылка на первоисточник: alcotourism.ru

 

“Тоже, хочу поблагодарить за отлично отполированный автомобиль БэМэВэ. Машинка теперь конфетка, секас, глаз не оторвать. Спасибо за старательное отношение к работе, индивидуальный подход и подаренные ништячки по уходу за машиной. Всем рекомендую, Ура!”

Ссылка на первоисточник: alcotourism.ru

 

К весне решил сделать машине подарок, отдал на восстановительную полировку в студию Облик (Полируюсь у этих ребят третий раз, также делал химчистку, качество всегда на высоте). В этот раз в качестве защитного покрытия опять выбрал ceramic pro light, в прошлый раз хватило примерно на год. Результат превзошёл ожидания, такой я её не видел никогда) Благодаря восстановительной полировке (в прошлые разы делал очищающую) ушли все царапины от тряпок, веток и прочей дребедени, машина реально стала как новая. Ну а керамика как всегда прибавила насыщенности цвета и блеска)

Ссылка на первоисточник: drive2.ru

 

“Недавно делал полировку с нанесением керамики и химчистку – это нечто. Настолько въедливого, до перфекционизма, подхода к работе, я нигде не встречал. Сделали все просто изумительно, а денег взяли мало)) Короче, категорически рекомендую))”

Ссылка на первоисточник: alcotourism.ru

 

“Сегодня посетил эту чудомастерскую. Отполировали фары, за клеили пленкой светить стали офигенно. Заодно полирнул кузов, до этого было желание отдать машинку малярам на предмет покраски. После полировки желание пропало. Так что рекомендую. Еще раз спасибо”

Ссылка на первоисточник: alcotourism.ru

Травматолог в Орле, отзывы пациентов, записаться на приём к травматологу Орёл

Аноним

Принимал врач: Туляков А. В.

Отличный доктор! Просто нет слов, симпатичный, профессиональный и к детям расположен на 100%. Так держать! (Бывший пациент проходил лечение по адресу ул. Московская, д. 29, лит. А2)

Отзыв опубликован: 19 февраля 2017 года

Аноним

Принимал врач: Фомин А. А.

Моего сына с серьезной травмой ноги доставили в травматологию детской областной больницы, где ему была оказана своевременная и качественная помощь замечательным травматологом Алексеем Алексеевичем Фоминым и проведено дальнейшее лечение. Огромнейшее спасибо Алексею Алексеевичу за высокий профессионализм, и золотые руки, творящие чудеса исцеления!!! (Бывший пациент проходил лечение по адресу ул. 8 Марта, д. 4)

Отзыв опубликован: 15 сентября 2014 года

Аноним

Принимал врач: Бутаков К. В.

Замечательный врач, отличный хирург, человек с большой буквы. В 2015 году провел моему мужу операцию по замене тазобедренного сустава. После операции муж чувствует себя хорошо, самостоятельно ходит и болей нет. Спасибо огромное. (Пациент посещал учреждение по адресу бул. Победы, д. 10)

Отзыв опубликован: 9 февраля 2017 года

Аноним

Принимал врач: Сауткин В. В.

Хороший врач. Один из лучших в Орле ортопедов. Лечились у него в НКМЦ им. З. И. Круглой, остались полностью довольны. (Бывший пациент был по адресу ул. Наугорское шоссе, д. 5)

Отзыв опубликован: 20 августа 2017 года


Аноним

Принимал врач: Сауткин В. В.

Виктор Викторович — отличный врач-ортопед. Правда немногословен, но самое главное качественно лечит, поставил меня на ноги. Спасибо вам большое, Виктор Викторович! (Написавший отзыв лечился по адресу ул. 8 Марта, д. 4)

Отзыв опубликован: 10 сентября 2013 года

Аноним

Принимал врач: Куклишин В. В.

Молодой, но прекрасный врач! Очень вежливый и добрый и к родителям, и к ребенку. Мне он очень понравился. (Написавший отзыв был по адресу ул. Карачевская, д. 41А)

Отзыв опубликован: 21 июня 2017 года

Аноним

Принимал врач: Сауткин В. В.

Рекомендую! Отличный специалист, ничего лишнего, все по делу! Были на приеме и в «Сакаре» и в ДОКБ. (Оставивший отзыв проходил лечение по адресу ул. 8 Марта, д. 4)

Отзыв опубликован: 3 января 2017 года

Аноним

Принимал врач: Сауткин В. В.

В первый раз посетили новую поликлинику. Ожидали большего. Та же огромная очередь в регистратуре, нехватка кушеток в коридоре у кабинетов. Посетили врача-ортопеда Сауткина В. В., каб. 345. Осмотрен доктором наш ребенок, отмечена положительная динамика. Всё объяснено в доступной форме. Спасибо! А вот медсестре этого кабинета желаем больше доброты и понимания своих маленьких пациентов, и их родителей. (Пациент проходил лечение по адресу ул. 8 Марта, д. 4)

Отзыв опубликован: 20 декабря 2016 года

Аноним

Принимал врач: Лысков А. М.

Отличный ортопед, лучший в области, если есть проблемы с коленями. Настоятельно рекомендую при травмах обращаться только к нему! (Бывший пациент лечился по адресу ул. Пионерская, д. 10а)

Отзыв опубликован: 30 декабря 2016 года

5 замечательно

Аноним

Принимал врач: Мордвинов Б. Б.

(Оставивший отзыв посещал учреждение по адресу ул. Матвеева, д. 9)

Понравилось:

Как-то сильно заболела нога и я пошла к врачу в поликлинику, он не направил меня на рентген, поставил диагноз воспаление сустава и прописал противовоспалительные уколы и физиопроцедуры. После двух недель лечения (больничный не дал и с больной ногой пришлось на работу ходить) боль усилилась, а врач сказал: «Ищите другого специалиста, я вам уже помочь не могу». В «Сакаре» в тот день работал Мордвинов, он направил меня на рентген и когда увидел снимок, пришёл в ужас, что я третью неделю с двумя сломаными пальцами на работу хожу. Вот такая медицина. Теперь хожу только к врачам-практикам. Дай Бог здоровья Вам, Борис Борисович, и успехов в работе!

Отзыв опубликован: 18 июля 2017 года


Аноним

Принимал врач: Бутаков К. В.

Великолепный врач, опытнейший хирург. Я не знаю другого человека во всём черноземье, кто также профессионально может провести сложнейшую операцию на колене. Подходит с большой ответственностью к принятию решений. Огромное количество знакомых людей, советующих Бутакова В. К. для проведения операции. Врач от Бога! Попадая в руки такого человека, становиться спокойно за своё здоровье! (Пациент проходил лечение по адресу бул. Победы, д. 10)

Отзыв опубликован: 27 ноября 2016 года

Аноним

Принимал врач: Бутаков К. В.

Тренировалась два раза у этого замечательного, опытного и добродушного доктора, побольше бы таких врачей! (Пациент посещал учреждение по адресу бул. Победы, д. 10)

Отзыв опубликован: 20 августа 2017 года

Аноним

Принимал врач: Мордвинов Б. Б.

Познакомилась с доктором два года назад. Купила туфли новые, после нескольких дней носки заболела стопа, врач в поликлинике хотел колоть в стопу лекарства, я отказалась, попросила направление на магниты. Через несколько дней боль ушла в пятку. Врач из поликлиники направил меня на рентген, который шпору пяточную не показал, но врач сказал, что однозначно нужно колоть в пятку уколы, так как пяточная шпора, скорее всего, начинает зарождаться, отсюда и боль. Я купила уколы, но, прочитав отзывы об инъекциях в пятку, засомневалась, решила проконсультироваться у другого специалиста. Так и познакомилась с доктором Мордвиновым. Доктор очень мне понравился, он внимательно осмотрел ногу, посмотрел снимок, сказал, что и намека на шпору нет, а пятка болит, потому что мазями и магнитами мне снимали боль с подъема стопы и боль ушла в пятку, так как там нервное окончание связки. Сказал, что через день-два боль пройдет сама, ничего колоть не нужно. Через день боль прошла. Оказалось, что на ненужные купленные лекарства я отдала больше денег, чем за прием травматолога-ортопеда. (Оставивший отзыв посещал учреждение по адресу ул. Матвеева, д. 9)

Отзыв опубликован: 20 июля 2017 года

Аноним

Принимал врач: Мордвинов Б. Б.

Врач, который спас мое колено, когда другие врачи не могли даже поставить диагноз. Провел артроскопию колена. Дай Бог здоровья Вам, Борис Борисович. Если бы Вас не было в нашем городе, я бы до сих пор бегала бы в поисках врача и мениск уже пришлось бы менять полностью. (Пациент лечился по адресу ул. Матвеева, д. 9)

Отзыв опубликован: 9 октября 2017 года

Михаил Ефремов ДТП не вспомнил – Происшествия – Коммерсантъ

В Пресненском суде столицы начались слушания по существу уголовного дела о ДТП со смертельным исходом, виновником которого следствие считает актера Михаила Ефремова. Сам он заявил, что обстоятельств аварии не помнит и потому не может признать вину. В свою очередь, выступившие на процессе свидетели-автоинспекторы рассказали суду: сразу после дорожного происшествия актер признавался, что именно он находился за рулем в момент ДТП, а также сокрушался по поводу происшедшего.

К началу заседания у входа в Пресненский суд образовалась длинная очередь. В ней можно было увидеть писателя Дмитрия Быкова и Никиту Высоцкого. Процесс в итоге начался с получасовым опозданием. Самого Михаила Ефремова сотрудники ФСИН из дома привезли заранее. По ходу заседания посторонних и журналистов к подсудимому не подпускали, во время перерывов актера уводили в конвойную комнату. Когда в соответствии с обязательной процедурой суд устанавливал личность обвиняемого, господин Ефремов назвал себя индивидуальным предпринимателем и сообщил, что у него двое несовершеннолетних детей.

Как обычно, слушания начались с ходатайств. Адвокат подсудимого Эльман Пашаев попросил по некоторым дням заседания не проводить, поскольку он будет занят в других делах. Кроме того, защитник сделал очередное громкое заявление, сообщив суду, что у него имеется информация о том, что потерпевшая сторона намеревается потребовать допроса подставного свидетеля, который раньше показаний не давал и который сообщит, что Михаил Ефремов в момент аварии находился за рулем своего внедорожника. Наконец, адвокат попросил вести интернет-трансляцию процесса. В последнем ему было отказано, поскольку слушания проходят в открытом режиме.

Затем суд рассмотрел вопрос о признании потерпевшей гражданской супруги погибшего в ДТП Сергея Захарова Ирины Стерховой. Ее адвокат утверждал, что женщина много лет жила вместе с господином Захаровым в Москве, чему есть многочисленные свидетельства — документы о совместных проживании, лечении, отпусках и т. п. К семье же в Рязанскую область, утверждал представитель госпожи Стерховой, водитель ездил изредка — только для того, чтобы отвезти деньги. Кроме того, отметил адвокат, именно госпожа Стерхова взяла на себя все расходы, связанные с похоронами господина Захарова. Однако суд в ходатайстве отказал.

Таким образом, потерпевшими по делу остаются вдова, брат и двое детей Сергея Захарова (их на заседании не было).

После этого прокурор зачитала обвинительное заключение. По версии следствия, 8 июня этого года около половины десятого вечера внедорожник Jeep Grand Cherokee, которым управлял Михаил Ефремов, столкнулся лоб в лоб с автомобилем «Лада», которым управлял водитель-экспедитор Сергей Захаров. «Ефремов, находясь в состоянии алкогольного и наркотического опьянения, превысил скорость на 25 км/ч, так как утратил контроль за управляемостью своего автомобиля, после чего допустил выезд на встречную полосу движения, лишив возможности встречный автомобиль под управлением Захарова уйти от столкновения»,— сказала гособвинитель. Несколько минут у прокурора заняло перечисление повреждений, полученных в аварии господином Захаровым. Актеру предъявлено обвинение по ч. 4 ст. 264 УК РФ (нарушение правил дорожного движения лицом, находившимся в состоянии опьянения, повлекшее по неосторожности смерть человека).

Сам подсудимый на вопрос, как он относится к обвинению, ответил, что вины не признает.

«Как я могу признать вину, если я ничего не помню?» — сказал Михаил Ефремов.

После этого были допрошены свидетели — четверо сотрудников ГИБДД, которые выезжали на место аварии. Один из них, Александр Козлов, сообщил, что прибыл на Смоленскую площадь буквально через две минуты после ДТП. По словам свидетеля, увидев, что водитель «Лады» зажат в салоне, он вызвал спасателей МЧС. Очевидцы — а по показаниям автоинспекторов, вокруг места столкновения машин собралась большая толпа — указывали, что из внедорожника после ДТП вышел Михаил Ефремов и он был сильно нетрезв. Полицейские также отметили резкий запах алкоголя, исходивший от актера, и его невнятную речь. Михаил Ефремов согласился поехать на экспертизу, которая показала, что у него в организме 1,23 промилле этанола.

Адвокат Пашаев уточнил у сотрудников ГИБДД, видели ли они сами, что его подзащитный находился за рулем джипа. Те ответили, что так утверждают все свидетели ДТП. А инспектор ДПС Павел Маркиянов, который, по его словам, постоянно находился рядом с актером, пока его коллеги опрашивали очевидцев и осматривали место ДТП, заявил суду, что сам Михаил Ефремов по горячим следам признавал, что машиной управлял он. «Ему неоднократно задавался вопрос о том, кто был за рулем. Ефремов заявил, что это был он»,— сказал свидетель. По его словам, артист неоднократно заявил, что виноват. «»Я дурак, что напился, виноват» — подобные слова были произнесены Ефремовым не менее пяти раз»,— отметил сотрудник ДПС. «Скажите, с вашей точки зрения, пьяные всегда говорят правду после ДТП?» — уточнил у полицейского адвокат Пашаев. Судья Елена Абрамова сняла этот вопрос как не имеющий отношения к делу.

В свою очередь, адвокат потерпевших Александр Добровинский сообщил журналистам, что у него имеется подтверждение того факта, что за рулем внедорожника находился Михаил Ефремов. «Я вел собственное расследование, на этой видеозаписи Ефремов выходит из машины с водительского сидения»,— заявил адвокат. Он отметил, что данная запись не приобщена к материалам дела.

Отметим, прокурор также заявила во время заседания, что считает доказанным тот факт, что иномаркой во время ДТП управлял актер: по ее словам, об этом свидетельствуют частицы ДНК господина Ефремова на подушке безопасности. Гособвинитель также сообщила, что в салоне джипа были обнаружены гашиш и гашишное масло. Впрочем, адвокат Эльман Пашаев заявил, что они актеру не принадлежат.

Алексей Соковнин


Эндокринологический центр «Обновление» в Ярославле. Профессиональная команда врачей.

Фомин
Андрей Аполлонович

Главный врач МЦ «Обновление», к.м.н., хирург высшей категории, сердечно сосудистый хирург, телемедицинские консультации

Пампутис
Сергей Николаевич

д.м.н., профессор
кафедры хирургии ЯГМУ,
хирург высшей категории,
хирург-эндокринолог,
телемедицинские консультации

Першаков
Даниил Романович

к.м.н.,
алголог, хирург,
сердечно-сосудистый хирург,
врач ультразвуковой диагностики,
телемедицинские консультации

Парусова
Наталья Игоревна

к.м.н.,
ревматолог,
терапевт высшей категории,
врач функциональной диагностики,
телемедицинские консультации

Гуляев
Юрий Юрьевич

кардиолог, аритмолог,
терапевт, врач функциональной диагностики,
телемедицинские консультации

Бутаков Константин Вячеславович — ортопед, травматолог, отзывы пациентов и запись на прием на Infodoctor.ru

Стаж 29 лет

Отлично

Информация о враче

Ортопед, травматолог Бутаков Константин Вячеславович — запись на прием, время работы и цены. На сайте Infodoctor.ru пациенты оставили несколько отзывов посетителей о враче со средним рейтингом 4.4. Записывайтесь онлайн или по телефону и оставляйте отзывы о специалисте.

Нашли неточность в описании или ошибку?

Сообщите нам

Отзывы

Не добавлено ни одного отзыва. Будьте первыми.

Спасибо, Ваш отзыв принят. После проверки модератором он появится на сайте.

Ваша оценка *

Поставьте оценку врачу

Образование

Ярославская государственная медицинская академия (лечебное дело) – 1992г.

Ярославская государственная медицинская академия (травматология и ортопедия) – 2014г.

Опыт работы

Общая практика: Высшая категория

Академия МУБиНТ, Международная академия бизнеса и новых технологий — Учёба.ру

Я б в нефтяники пошел!

Пройди тест, узнай свою будущую профессию и как её получить.

Химия и биотехнологии в РТУ МИРЭА

120 лет опыта подготовки

Международный колледж искусств и коммуникаций

МКИК — современный колледж

Английский язык

Совместно с экспертами Wall Street English мы решили рассказать об английском языке так, чтобы его захотелось выучить.

15 правил безопасного поведения в интернете

Простые, но важные правила безопасного поведения в Сети.

Олимпиады для школьников

Перечень, календарь, уровни, льготы.

Первый экономический

Рассказываем о том, чем живёт и как устроен РЭУ имени Г.В. Плеханова.

Билет в Голландию

Участвуй в конкурсе и выиграй поездку в Голландию на обучение в одной из летних школ Университета Радбауд.

Цифровые герои

Они создают интернет-сервисы, социальные сети, игры и приложения, которыми ежедневно пользуются миллионы людей во всём мире.

Работа будущего

Как новые технологии, научные открытия и инновации изменят ландшафт на рынке труда в ближайшие 20-30 лет

Профессии мечты

Совместно с центром онлайн-обучения Фоксфорд мы решили узнать у школьников, кем они мечтают стать и куда планируют поступать.

Экономическое образование

О том, что собой представляет современная экономика, и какие карьерные перспективы открываются перед будущими экономистами.

Гуманитарная сфера

Разговариваем с экспертами о важности гуманитарного образования и областях его применения на практике.

Молодые инженеры

Инженерные специальности становятся всё более востребованными и перспективными.

Табель о рангах

Что такое гражданская служба, кто такие госслужащие и какое образование является хорошим стартом для будущих чиновников.

Карьера в нефтехимии

Нефтехимия — это инновации, реальное производство продукции, которая есть в каждом доме.

Характеристика биологических особенностей радиозащитной активности двухцепочечной РНК, выделенной из Saccharomyces сerevisiae

TY — JOUR

T1 — Характеристика биологических особенностей радиозащитной активности двухцепочечной РНК, выделенной из Saccharomyces сerevisiae

, Генрих С. ​​

AU — Николин Валерий П.

AU — Попова Нелли А.

AU — Проскурина Анастасия С.

AU — Кисаретова Полина Е.

AU — Таранов, Олег С.

AU — Дубатолова, Татьяна Д.

AU — Долгова, Евгения В.

AU — Гончар, Екатерина А.

AU — Кирикович, Светлана Сергеевна

AU — Ефремов , Ярослав Р.

AU — Байбородин Сергей I.

AU — Романенко Маргарита В.

AU — Мещанинова Мария I.

AU — Вениаминова Алия Г.

AU — Колчанов Николай A.

AU — Шурдов Михаил Александрович

AU — Богачев Сергей Сергеевич

N1 — Информация о финансировании: Работа поддержана Министерством науки и высшего образования России через Институт цитологии и генетики [проект госбюджета № 0324-2019-0042-С-01, госрегистрация № AAAA-A17-117071240065-4] и РФФИ. Фундаментальные исследования [грант № 18-34-00205]. Микроскопический анализ был поддержан российским бюджетным проектом Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН [№ 0310-2019-0005]. Работа по химическому синтезу РНК была поддержана российским бюджетным проектом Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН [№ AAAA-A17-117020210021-7].Авторы выражают благодарность профессору Сергею В. Нетесову за техническую поддержку, лаборатории иммуногенетики Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН за предоставленные клетки XL1-Blue MRF, Радиоизотопному отделу ИЦиГ СО РАН, Проточной цитометрии Shared Учреждение ИЦиГ СО РАН и Центр коллективного пользования по микроскопии биологических объектов СО РАН.

PY — 2020/9/1

Y1 — 2020/9/1

N2 — Цель статьи: Защита от ионизирующего излучения — важнейший компонент в лечении злокачественных новообразований, обслуживании атомных реакторов и устранении ситуации, связанные с неконтролируемыми радиоактивными загрязнениями.В этой связи открытие новых эффективных радиопротекторов, а также новых принципов защиты живых организмов от высоких доз радиации является важнейшим фактором, определяющим новые подходы в медицинском и техническом использовании радиации. Материалы и методы. Подопытных животных облучали γ-излучателем (Cs137) в дозе 9,4 Гр. Радиозащитные свойства некоторых агентов (тотальная РНК, одноцепочечная РНК, двухцепочечная РНК и B-190) оценивали по показателям выживаемости / смертности экспериментальных животных в пределах 30–90 дней.Патоморфологическое исследование внутренних органов под электронным микроскопом проводили на 9–12-е сутки после облучения. Клонирование и другие молекулярные процедуры выполнялись в соответствии с общепринятыми протоколами. Для оценки интернализации меченой нуклеиновой кислоты клетки костного мозга инкубировали с двухцепочечной РНК, меченной флуоресцентным красителем 6-FAM. Клетки с интернализованной двухцепочечной РНК анализировали с помощью микроскопа Axio Imager M1. В другом эксперименте клетки костного мозга после инкубации с двухцепочечной РНК окрашивали антителами против CD34, меченными Cy5, и анализировали с помощью микроскопа Axioskop 2.Результаты. В данном исследовании охарактеризованы некоторые биологические особенности радиозащитного действия двухцепочечной РНК. Было показано, что 160 мкг двухцепочечной РНК на мышь защищают экспериментальных животных от абсолютно смертельной дозы γ-излучения 9,4 Гр. В разных экспериментах 80–100% облученных животных выживают и доживают до естественной смерти. Было обнаружено, что радиозащитные свойства двухцепочечной РНК не зависят от ее последовательности, но строго зависят от ее двухцепочечной формы.Более того, двухцепочечная РНК должна иметь «открытые» концы молекулы, чтобы проявлять свою радиозащитную активность. Выводы. Эксперименты показывают, что радиозащитный эффект двухцепочечной РНК тесно связан с ее интернализацией в гемопоэтические стволовые клетки, которые в дальнейшем повторно заселяют паренхиму селезенки облученных мышей. Активно пролиферирующие предшественники образуют селезеночные колонии, которые в дальнейшем служат основой для восстановления кроветворения и иммунной функции и определяют выживаемость животных, получивших смертельную дозу радиации.

AB — Цель статьи: Защита от ионизирующего излучения — важнейший компонент в лечении злокачественных новообразований, обслуживании атомных реакторов и разрешении ситуаций, связанных с неконтролируемыми радиоактивными загрязнениями. В этой связи открытие новых эффективных радиопротекторов, а также новых принципов защиты живых организмов от высоких доз радиации является важнейшим фактором, определяющим новые подходы в медицинском и техническом использовании радиации.Материалы и методы. Подопытных животных облучали γ-излучателем (Cs137) в дозе 9,4 Гр. Радиозащитные свойства некоторых агентов (тотальная РНК, одноцепочечная РНК, двухцепочечная РНК и B-190) оценивали по показателям выживаемости / смертности экспериментальных животных в пределах 30–90 дней. Патоморфологическое исследование внутренних органов под электронным микроскопом проводили на 9–12-е сутки после облучения. Клонирование и другие молекулярные процедуры выполнялись в соответствии с общепринятыми протоколами.Для оценки интернализации меченой нуклеиновой кислоты клетки костного мозга инкубировали с двухцепочечной РНК, меченной флуоресцентным красителем 6-FAM. Клетки с интернализованной двухцепочечной РНК анализировали с помощью микроскопа Axio Imager M1. В другом эксперименте клетки костного мозга после инкубации с двухцепочечной РНК окрашивали антителами против CD34, меченными Cy5, и анализировали с помощью микроскопа Axioskop 2. Результаты. В данном исследовании охарактеризованы некоторые биологические особенности радиозащитного действия двухцепочечной РНК.Было показано, что 160 мкг двухцепочечной РНК на мышь защищают экспериментальных животных от абсолютно смертельной дозы γ-излучения 9,4 Гр. В разных экспериментах 80–100% облученных животных выживают и доживают до естественной смерти. Было обнаружено, что радиозащитные свойства двухцепочечной РНК не зависят от ее последовательности, но строго зависят от ее двухцепочечной формы. Более того, двухцепочечная РНК должна иметь «открытые» концы молекулы, чтобы проявлять свою радиозащитную активность.Выводы. Эксперименты показывают, что радиозащитный эффект двухцепочечной РНК тесно связан с ее интернализацией в гемопоэтические стволовые клетки, которые в дальнейшем повторно заселяют паренхиму селезенки облученных мышей. Активно пролиферирующие предшественники образуют селезеночные колонии, которые в дальнейшем служат основой для восстановления кроветворения и иммунной функции и определяют выживаемость животных, получивших смертельную дозу радиации.

KW — B-190

KW — Двухцепочечная РНК

KW — двухцепочечные разрывы

KW — колонии селезенки

UR — http: // www.scopus.com/inward/record.url?scp=85088827783&partnerID=8YFLogxK

UR — http://www.scopus.com/inward/citedby.url?scp=85088827783&partnerID=8YFLogxK

0203 U2

DO — 10.1080 / 09553002.2020.1793020

M3 — Артикул

C2 — 32658564

AN — SCOPUS: 85088827783

VL — 96

SP — 1173

International EP — 1191 JO

International Journal of Radiation

JF — Международный журнал радиационной биологии

SN — 0955-3002

IS — 9

ER —

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере уже в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Доставка и обработка экзогенной двухцепочечной ДНК в мышиных CD34 + гематопоэтических клетках-предшественниках и изменения их клеточного цикла при комбинированной обработке циклофосфамидом и двухцепочечной ДНК

Ранее мы сообщали, что фрагменты экзогенной двухцепочечной ДНК могут быть интернализованы мышами. клетки костного мозга без какой-либо трансфекции.Наш настоящий анализ показывает, что только 2% клеток костного мозга поглощают фрагменты внеклеточной экзогенной ДНК. Из них ~ 45% клеток соответствуют CD34 + гемопоэтическим стволовым клеткам. Принимая во внимание, что стволовые клетки CD34 + составляли 2,5% от общей популяции клеток в проанализированных образцах костного мозга, эти данные показывают, что до 40% клеток CD34 + легко интернализируют фрагменты внеклеточной экзогенной ДНК. Это говорит о том, что интернализация фрагментированной дцДНК является общей характеристикой низкодифференцированных клеток, в частности CD34 + клеток костного мозга.

Когда линеаризованная плазмидная ДНК использовалась в качестве источника экзогенной ДНК, мы наблюдали, что экзонуклеолитический процессинг и лигирование концов двухцепочечной ДНК происходили в клетках костного мозга, в которых эта ДНК была интернализована. Мы также извлекли «гибридные» плазмиды, которые включают ген устойчивости к канамицину, из экзогенной плазмидной ДНК и фрагментов плазмид из энтеробактерий хозяина, что наводит на мысль о событиях рекомбинации, происходящих при интернализации ДНК.

Клетки CD34 + составляют особую популяцию клеток костного мозга, интернализирующую внеклеточную ДНК.Анализ клеточного цикла клеток CD34 +, обработанных только циклофосфамидом или в комбинации с дцДНК, предполагает, что эти клетки обладают различными биологическими ответами на эти обработки. А именно, в то время как после обработки циклофосфамидом стволовые клетки костного мозга задерживаются в фазах S – G2, комбинированная обработка циклофосфамидом + дцДНК без каких-либо задержек приводит к прогрессированию клеточного цикла. Это указывает на то, что когда геном подвергается репарации межцепочечных сшивок, инъекция фрагментированной экзогенной дцДНК приводит к немедленному восстановлению целостности генома.Мы наблюдаем, что обработка клеток только циклофосфамидом или комбинированной циклофосфамидом + дцДНК приводит к двум различным волнам апоптоза в предшественниках CD34 +. Мы также показали, что инъекции циклофосфамида и циклофосфамида + дцДНК способствуют делению клеток CD34 + в определенные периоды времени.

Конъюгированные нитрозоалкены как акцепторы Михаэля в реакциях образования углерод-углеродных связей: обзор и перспективы

Прекурсоры сопряженных нитрозоалкенов

Способ образования α-нитрозоалкенов важен для успешного связывания с конкретным нуклеофилом и предотвращения побочных реакций.Существует несколько источников α-нитрозоалкенов, как показано на схеме 1. Обычными предшественниками α-нитрозоалкенов являются α-галогеноксимы 1 (или галогензамещенные нитрозосоединения [11,12]), которые подвергаются депротонированию / элиминированию галогенидов при обработке основание [13] (схема 1, реакция (1)). Недостатком этого метода является то, что NSA образуются быстро и достигаются высокие стационарные концентрации, способствующие полимеризации. Кроме того, необходим избыток нуклеофила, поскольку он также служит основанием.Более мягкий метод был предложен Данией, использовавшей α-галогеноксимы silyl ehers 2 в качестве предшественников конъюгированных нитрозоалкенов при обработке TBAF при низких температурах (схема 1, реакция (2)) [14–16]. Важно отметить, что скорость образования нитрозоалкена может контролироваться объемностью силильной группы. Другой способ получения нитрозоалкенов заключается в использовании их стабильных нитрозоацеталей типа 3 ( N , N -бис (силилокси) енаминов) [17,18]. Последние удаляют (Alk 3 Si) 2 O под действием оснований Льюиса, образуя соответствующие нитрозоалкены при низких стационарных концентрациях контролируемым образом.Кроме того, синтетические предшественники нитрозоацеталей 3 представляют собой не галогенкарбонильные соединения, как в случае оксимов 1 и 2 , а алифатические нитропроизводные, которые легко превращаются в енамины 3 путем двойного силилирования с участием внутреннего окислительно-восстановительного процесса [ 19-21]. Это позволяет получать нитрозоалкены, к которым трудно получить доступ по первым двум маршрутам. Tanimoto et al. [22] недавно предложили N -силоксисульфонамиды 4 в качестве стабильных источников ненасыщенных нитрозосоединений (схема 1, реакция (4)).Однако пока этот подход использовался только для получения нитрозоалленов.

Схема 1: Прекурсоры нитрозоалкенов NSA .

Схема 1: Прекурсоры нитрозоалкенов NSA .

Присоединение анионов кислот C – H к сопряженным нитрозоалкенам

Стабилизированные еноляты и их эквиваленты являются наиболее изученными C-нуклеофилами в реакциях присоединения Михаэля с нитрозоалкенами. Первое систематическое исследование в этой области было проведено Оно и соавторами [13,23], которые сообщили о добавлении анионов диэтилмалоната и ацетилацетона к циклическим нитрозоалкенам NSA1a – c , полученным из соответствующих α-хлоркетонов (2-хлорциклогексанон оксим ( 1a ), 2-хлорциклооктаноноксим ( 1b ) и оксим 12-хлорциклододека-4,8-диен-1-она ( 1c ) под действием избытка нуклеофила (Схема 2 ).Было обнаружено, что оксимы 1b и 1c реагируют как с диэтилмалонатом, так и с ацетилацетоном, давая аддукты 5 с выходами от высоких до количественных. Шестичленный циклический оксим 1a давал соответствующие продукты только с умеренными выходами из-за образования нежелательных побочных продуктов и полимеризации α, β-ненасыщенного нитрозосоединения. Этот ранний пример демонстрирует высокую зависимость добавления Михаэля к нитрозоалкенам от структуры субстрата.Однако потребность в избытке нуклеофила значительно ограничивает применение этого протокола.

Схема 2: Реакции циклических α-хлороксимов 1 с 1,3-дикарбонильными соединениями.

Схема 2: Реакции циклических α-хлороксимов 1 с 1,3-дикарбонильными соединениями.

Разработка усовершенствованных методов получения α-нитрозоалкенов привела к более обширным исследованиям их реакций с енолатами. Таким образом, наша группа продемонстрировала, что нитрозоацетали нитрозоалкенов ( N , N -бис (силилокси) енамины 3 ) плавно реагируют с 1,3-дикарбонильными соединениями в присутствии TBAF или DBU с образованием соответствующих оксимов 6 с выходами от умеренных до хороших (схема 3) [24].В процессе, вероятно, участвует промежуточный нитрозоалкен, который образуется под действием TBAF или аниона 1,3-дикарбонильного соединения на N , N -бис (силилокси) енамин 3 . В отличие от производных малоновой кислоты и β-кетоэфиров 1,3-дикетоны в этих условиях давали только сложные смеси продуктов в реакции с N , N -бис (силилокси) енаминами 3 .

Схема 3: С-С-сочетание N , N -бис (силилокси) енаминов 3 с 1,3-дикарбонильными соединениями.

Схема 3: С-С-сочетание N , N -бис (силилокси) енаминов 3 с 1,3-дикарбонильными соединениями.

Нитронат-анионы также реагируют как С-нуклеофилы с N , N -бис (силилокси) енаминами 3 с образованием β-нитрооксимов 7 с хорошими выходами (Схема 4) [20,25].Эффективное связывание DBU-нитронатных солей, полученных из первичных нитросоединений, с енаминами 3 достигалось при –78 ° C под действием TBAF. Однако для менее реакционноспособных вторичных нитронатов реакции проводили при 0 ° C без TBAF, чтобы поддерживать более низкую концентрацию реакционноспособных нитрозоалкенов.

Схема 4: Взаимодействие N , N -бис (силилокси) енаминов 3 с нитронат-анионами.

Схема 4: Взаимодействие N , N -бис (силилокси) енаминов 3 с нитронат-анионами.

В 2010 году Вайнреб и его сотрудники разработали общий протокол для связывания α-нитрозоалкенов со сложными эфирами карбоновых кислот, содержащими электроноакцепторные заместители (CO 2 Et, NO 2 , COCH 3 , SO 2 Ph) при α-положение (схема 5) [26].Нитрозоалкены были получены согласно методике Дании [14] при действии TBAF на эфиры TBS α-хлороксимов 2 . Важно отметить, что эфиры оксима TBS различных галогензамещенных альдегидов и кетонов, включая циклические, были успешно использованы в качестве предшественников нитрозоалкенов с получением оксимов 8 с выходами от хороших до высоких.

Схема 5: Взаимодействие эфиров α-хлороксимов TBS 2 с енолятами сложных эфиров.

Схема 5: Взаимодействие эфиров α-хлороксимов TBS 2 с енолятами сложных эфиров.

Те же авторы использовали преимущество внутримолекулярного присоединения енолятов по Михаэлю к нитрозоалкенам для создания мостиковых и конденсированных карбоциклических систем [27].Например, предложенная стратегия сборки бицикло [3.2.1] октанона 14 основана на комбинации реакции метатезиса с замыканием цикла и внутримолекулярного присоединения малонат-аниона к нитрозоалкеновому звену (схема 6). На первой стадии легкодоступный хлордиен 9 подвергали реакции метатезиса с катализатором Граббса второго поколения. Полученное производное хлорциклогексена 10 окисляли до α-хлоркетона 11 , который затем превращали в эфир α-хлороксима TBS 12 стандартной реакцией оксимирования.Требуемый промежуточный нитрозоалкен был получен из α-галоген-O-силилоксима 12 под действием фторид-аниона при -78 ° C. Стоит обратить внимание на то, что малонат-анион образуется до добавления TBAF из-за высокой нестабильности промежуточного нитрозосоединения NSA2 . По этой методике был получен бициклический оксим 13 с количественным выходом из предшественника 12 . Модификация этой стратегии позволяет получить доступ к различным бициклическим системам, состоящим из пяти-, шести- и семичленных карбо- и гетероциклов.

Схема 6: Сборка бициклооктанона 14 посредством внутримолекулярной циклизации нитрозоалкена NSA2 .

Схема 6: Сборка бициклооктанона 14 посредством внутримолекулярной циклизации нитрозоалкена NSA2 .

Не только малонаты, но и другие СН-кислотные фрагменты, такие как дицианометан и остатки сульфонил-, нитро- и фосфорилуксусной кислоты, могут быть успешно использованы в стратегии, показанной на схеме 6 [28]. Эта общая схема синтеза открывает доступ к множеству замещенных бицикло [2.2.1] гептанов 16 посредством циклизации эфиров α-хлороксима TBS 15 , как показано на схеме 7.

Схема 7: Общая стратегия сборки бицикло [2.2.1] гептанов посредством внутримолекулярной циклизации эфиров α-хлороксима TBS 15 .

Схема 7: Общая стратегия сборки велосипеда [2.2.1] гептанов посредством внутримолекулярной циклизации …

Стереоселективность добавок Михаэля к конъюгированным нитрозоалкенам является важной проблемой, учитывая потенциальное использование этой стратегии в синтезе натуральных продуктов. Вайнреб и соавторы провели всестороннее исследование стереоселективности присоединения конъюгата к α-нитрозоалкенам с использованием как циклических [29], так и ациклических субстратов [30].Они продемонстрировали, что нуклеофильное присоединение C-замещенных эфиров малоновой кислоты 17 к 4- трет--бутилнитрозоциклогексену NSA3 (полученному либо из эфира TBS 18 , либо из свободного оксима 19 ), в основном, протекает с высокой стереоселективностью и дает или исключительно транс -изомеры аддуктов 20 (Схема 8) [29]. Ожидается, что стереоселективность добавления Михаэля не зависит от способа получения нитрозоалкена, а также от относительной конфигурации α-хлороксима.Наблюдаемый стереохимический результат можно объяснить аксиальной атакой нуклеофила на нитрозоалкен NSA3 .

Схема 8: Стереохимия присоединения Михаэля к циклическому нитрозоалкену NSA3 .

Схема 8: Стереохимия присоединения Михаэля к циклическому нитрозоалкену NSA3 .

Более интересно то, что добавление эфиров малоновой кислоты 17 к ациклическим нитрозоалкенам NSA4 (полученным из эфиров оксима TBS 21 ) привело исключительно к анти--аддуктам 22 (схема 9) [30]. Эта стереохимия согласуется с моделью Фелкина – Аня с наиболее стерически сложным заместителем R 1 , лежащим в перпендикулярной плоскости по отношению к двойной связи C = C.Эта закономерность является общей как для нитрозоалкена NSA4 с фенильным заместителем в γ-положении (R 1 = Ph, Схема 9), так и для соединения с более стерически сложным неопентильным заместителем (R 1 = неопентил, Схема 9). .

Схема 9: Стереохимия присоединения Михаэля к ациклическим нитрозоалкенам NSA4 .

Схема 9: Стереохимия присоединения Михаэля к ациклическим нитрозоалкенам NSA4 .

Подобно нитрозолакенам NSA4 , γ-метоксизамещенный нитрозоалкен NSA5 (полученный из TBS-оксимового эфира 23 ) также дает анти--изомер аддукта 24 (схема 10).

Схема 10: Стереохимия присоединения Михаэля к γ-алкокситрозоалкену NSA5 .

Схема 10: Стереохимия присоединения Михаэля к γ-алкокситрозоалкену NSA5 .

Эти модельные исследования демонстрируют высокую стереоселективность присоединения Михаэля как к циклическим, так и к ациклическим сопряженным нитрозоалкенам, имеющим асимметричные центры. Тем не менее, стереохимическая индукция от хирального нуклеофила, а также асимметричный катализ в этих реакциях еще предстоит изучить.

Высокая эффективность и стереоселективность добавления енолята к нитрозоалкенам делают эту стратегию перспективной для применения в полном синтезе, получившем признание с 1970-х годов. Таким образом, Оппольцер и соавторы использовали добавление енолятов по Михаэлю к нитрозоалкенам в своих исследованиях синтеза 3-метокси-9β-эстра (1,3,5 (10)) триен (11,17) диона ( 25 ) (1977) [31] и (+/-) — изокомен (1981) [32].Ключевой стадией образования углерод-углеродной связи в синтезе стероида 25 была стереоселективная реакция α-бромоксима 26 с енолятом лития 27 с образованием оксима 28 через присоединение Михаэля к временному нитрозоалкену NSA6 [ 31]. Оксимный аддукт 28 существовал преимущественно в циклической 1,2-оксазиновой форме (схема 11). Последующее бензилирование оксима 28 и каскад термического ретро- [2 + 2] / [4 + 2] -циклоприсоединения с последующим гидролизом оксиминогруппы дали целевой стероид 25 с желаемой конфигурацией всех стереогенных центров.

Схема 11: Полный синтез Оппольцера 3-метокси-9β-эстра (1,3,5 (10)) триен (11,17) диона ( 25 ).

Схема 11: Полный синтез Оппольцера 3-метокси-9β-эстра (1,3,5 (10)) триен (11,17) диона ( 25 ).

В попытке получить (+/-) — изокомен, Оппольцер и соавторы предложили пенталенон 29 , доступный путем внутримолекулярной альдольной конденсации / удаления дикетона 30 , в качестве ключевого предшественника. Дикетон 30 был получен прямым способом путем CC-сочетания нитрозоалкена NSA7 (полученного in situ из соответствующего α-бромоксима 31 ) с силил енолятом 2-метилциклопентанона и последующим дезоксигенированием полученного оксима 32 с CAN.К сожалению, попытки превратить пенталенон 29 в изокомен не увенчались успехом (схема 12) [32].

Схема 12: Полный синтез (+/−) — изокомена Оппольцером.

Схема 12: Полный синтез (+/−) — изокомена Оппольцером.

Недавно группа Вайнреба использовала преимущество нитрозоалкенов в качестве акцепторов Михаэля для полного синтеза нескольких алкалоидов, таких как (+/-) — алстилобанины A и E, (+/-) — ангустилодин [33] и (+/-) -мирионевринол [34,35] (Рисунок 1).

Рисунок 1: Алкалоиды синтезированы с использованием стереоселективного присоединения по Михаэлю к конъюгированным нитрозоалкенам.

Рисунок 1: Алкалоиды синтезированы с использованием стереоселективного присоединения по Михаэлю к конъюгированным нитрозоалкенам.

В общем синтезе алстилобанинов A, E и ангустилодина в качестве ключевого интермедиата первоначально был выбран функционализированный индол 33 [33].Однако попытки его получения путем присоединения по Майклу замещенного енолята индола 34 к нитрозоалкену NSA8 , полученному in situ либо из соответствующего хлороксима 35 , либо из его эфира TBS 36 , не увенчались успехом (схема 13). Проблема была элегантно решена с использованием дианиона индола 37 как в качестве нуклеофила, так и в качестве основания. Реакция 37 с α-хлороксимом 35 требовала только одного эквивалента нуклеофила и давала аддукт 38 с выходом 99%.Оксим 38 был преобразован в пентациклическое производное 39 , которое служило прямым предшественником целевых алкалоидов алстилобанинов A, E и ангустилодина.

Схема 13: Общий синтез алстилобанинов A, E и ангустилодина Вайнребом.

Схема 13: Общий синтез алстилобанинов A, E и ангустилодина Вайнребом.

Та же самая стратегия была использована для создания тетрациклического ядра аппарицинового класса индольных алкалоидов (см. Схему 14) [36].Здесь сочетание дианиона индола 40 с хлороксимом 35 (через нитрозоалкен NSA8) дает соответствующий аддукт 41 с выходом 97% в виде разделяемой смеси диастереомеров 1: 1. Каждый изомер подвергали циклизации в восстановительных условиях с образованием конденсированной с индолом структуры 1-азабицикло [4.2.2] декана 42 .

Схема 14: Подход Вайнреба к основной структуре алкалоидов аппарицина.

Схема 14: Подход Вайнреба к основной структуре алкалоидов аппарицина.

Конъюгатное добавление малонат-аниона к промежуточному нитрозоалкену NSA9 было использовано в качестве ключевой стадии для создания важного соединения C (7) –C (8) в общем синтезе (+/-) — мироневринола (схема 15) [ 34,35].α-Хлороксим TBS эфир 43 (полученный в 10 стадий из δ-валеролактама) реагировал с диметилмалонат-анионом в условиях Дании через промежуточное соединение NSA9 с получением соответствующего аддукта 44 с выходом 93%. Важно отметить, что оба полученных стереоизомера представляли собой оксим E, Z -изомеры с относительной конфигурацией C-7, такой же, как у мироневринола. Последующее дезоксигенирование и восстановление альдоксима с последующим превращением малонатного звена в формильную группу давало промежуточное соединение 45 , которое подвергали олефинированию по Виттигу.Последующая аза-циклизация промежуточного соединения 46 аза-Сакураем дала трициклическое производное 47 в виде единственного стереоизомера, которое затем превращали в целевой мироневринол стандартными операциями.

Схема 15: Синтез Вайнреба (+/-) — мироневринола посредством стереоселективного конъюгированного добавления малоната к нитрозоалкену NSA9 .

Схема 15: Синтез Вайнреба (+/-) — мироневринола посредством стереоселективного конъюгированного добавления малоната к н …

Добавление металлоорганических реагентов к сопряженным нитрозоалкенам

Добавление металлоорганических соединений к сопряженным нитрозоалкенам является многообещающей стратегией в отношении различных α-разветвленных оксимов.К сожалению, эти реакции на сегодняшний день недостаточно развиты, и до сих пор было опубликовано лишь несколько сообщений об успешном присоединении по Михаэлю металлоорганических соединений к α-нитрозоалкенам.

Среди первых, Оно и соавторы изучили добавление реактивов Гриньяра к α-хлороксимам, полученным из циклических кетонов [23]. В своих экспериментах использовали 2 эквивалента магнийорганического соединения с одним эквивалентом, необходимым для превращения α-хлороксимов в нитрозоалкен (схема 16).Хлорзамещенный оксим циклододека-4,8-диен-1-она 1c действительно дает желаемые аддукты 48 с умеренными выходами, однако эксперименты с оксимом 2-хлорциклогексанона ( 1a ) и оксимом 2-хлорциклооктанона ( 1b) ) оказались безуспешными. Этот ранний результат демонстрирует, что классический способ получения конъюгированных нитрозоалкенов из α-хлороксимов может быть несовместим с дальнейшим конъюгированным добавлением реагентов Гриньяра.

Схема 16: Реакции циклических α-хлороксимов с реактивами Гриньяра.

Схема 16: Реакции циклических α-хлороксимов с реактивами Гриньяра.

Несмотря на эти довольно неутешительные результаты, в 1977 году Кори успешно применил сопряженное присоединение 1-литио-1-бутина к промежуточному нитрозоалкену для введения бутильной группы при атоме C-6 в общий синтез (+/-) — пергидро-гистрионикотоксина ( Схема 17) [37-39].Ключевой предшественник пергидрогистрионикотоксина, диоксим 51 , был получен реакцией α-бромоксима 49 с 10 эквивалентами 1-бутина и 6 эквивалентами бутиллития в ТГФ с последующим гидрированием алкинилоксима 50 . В результате этих превращений желаемый диоксим 51 получается с выходом 77%. Важно отметить, что присоединение нуклеофила к нитрозоалкену NSA10 происходило исключительно транс -стереоселективным по отношению к O -бензилоксоксимному фрагменту.

Схема 17: Синтез Кори (+/-) — пергидрогистрионикотоксина.

Схема 17: Синтез Кори (+/-) — пергидрогистрионикотоксина.

В своих исследованиях полного синтеза эритронолида B (агликона эритромицина B) из интермедиата 52 Кори и его коллеги предложили раскрытие цикла α, β-эпоксиоксимов 53 с реагентами Гилмана в качестве правдоподобного пути. ввести метильную группу в положение C-10 [40] (схема 18).Поскольку добавление происходит в α-положении и необходим избыток (5 эквивалентов) металлоорганического соединения, считается, что реакция протекает через промежуточное соединение нитрозоалкена NSA11 . Реакция оказалась эффективной, давая желаемые β-гидроксиоксимы 54 с высокими выходами (80–90%). Интересно, что с оксимом циклогексенона наблюдалась отличная стереоселективность (образовалось только транс-изомера ), однако замещенные производные оксима циклогексенона, такие как оксимы α, β-эпоксикарвона и эпоксиизофорона, давали диастереомерные смеси продуктов.Хотя не сообщалось, была ли эта стратегия полезной для достижения синтеза эритронолида B, этот результат указывает на то, что медноорганические соединения подвергаются сопряженному добавлению к нитрозоалкенам гораздо более селективным образом по сравнению с литийорганическими и магнийорганическими реагентами.

Схема 18: Добавление реактивов Гилмана к α, β-эпоксиоксимам 53 .

Схема 18: Добавление реактивов Гилмана к α, β-эпоксиоксимам 53 .

Позже Вайнреб с сотрудниками продемонстрировали, что медьорганические реагенты плавно реагируют с α-хлороксимами [41].Таким образом, реакция реактива Гилмана (2 эквивалента) с оксимом 4- ( трет -бутил) -2-хлорциклогексан-1-она ( 19 ) дает соответствующие α-алкил- и α-арилзамещенные оксимы циклогексанона. 55 с высокими выходами и превосходной стереоселективностью (схема 19, реакция (1)). После некоторой оптимизации процедуры (переход с реактива Гилмана на ариллитиоцианкупраты) этот метод был успешно распространен на широкий спектр ациклических α-хлороксимов 1 (схема 19, реакция (2)).Интересно, что арильная группа, а не цианид-анион, передается от ариллитиоцианкупратов к промежуточному нитрозоалкену NSA . Однако для обеспечения завершения реакции требовались еще два эквивалента металлоорганического соединения. Полученные α-арилзамещенные альдооксимы 56 без выделения были превращены в соответствующие нитрилы 57 обработкой DCC в присутствии смеси py / Et 3 N.

Схема 19: Добавление реагентов Гилмана к α-хлороксимам.

Схема 19: Добавление реагентов Гилмана к α-хлороксимам.

Использование других источников нитрозоалкена (см. Схему 1) в реакции с металлоорганическими соединениями очень ограничено.Так, Зеебах и соавторы сообщили о добавлении литийорганических реагентов к O-силилнитронатам 58 , приводящему к α-замещенным оксимам 59 (схема 20) [42]. Вероятно, что при обработке литийорганическим реагентом силилнитронат 58 депротонируется с образованием аниона 60 , который удаляет силилоксианион с образованием нитрозоалкена NSA12 . Сопряженное добавление второго эквивалента литийорганического соединения дает оксимы 59 .Однако оксимы 59 производятся с довольно низкими выходами.

Схема 20: Реакция силилнитроната 58 с литийорганическими реагентами через нитрозоалкен NSA12 .

Схема 20: Реакция силилнитроната 58 с литийорганическими реагентами через нитрозоалкен NSA12 .

В 1996 г. Трост сообщил об использовании сульфонов β-кетоксима 61 в реакции с ацетилидами лития, которая привела к формальному замещению сульфинатной группы по механизму элиминирования-присоединения (схема 21) [43]. Интересно, что в отличие от α-галогеноксимов 1,4-элиминирование в сульфонах 61 с образованием нитрозоалкенов NSA13 протекает только при повышенных температурах (50 ° C), что может обеспечивать относительно низкие выходы продуктов 62 .Кроме того, реакция сульфона 63 с (триметилсилил) ацетилидом лития дает только эноксим 64 .

Схема 21: Взаимодействие сульфонов β-кетоксима 61 и 63 с ацетилидами лития.

Схема 21: Взаимодействие сульфонов β-кетоксима 61 и 63 с ацетилидами лития.

По всей видимости, применение более удобных и селективных источников нитрозоалкенов (т.е.g., простые эфиры TBS α-галогеноксимов 2 ) в реакции с металлоорганическими соединениями могут привести к дальнейшему развитию этой многообещающей методологии.

Добавление аренов к сопряженным нитрозоалкенам

Помимо обычных C-нуклеофилов, нитрозоалкены могут реагировать с нуклеофильными аренами и гетероаренами.Гилкрист и Робертс продемонстрировали, что реакция богатых электронами ароматических соединений с нитрозоалкенами NSA14 дает соответствующие α-арилзамещенные оксимы 66 с выходами от низких до умеренных в виде смесей региоизомеров [44] (схема 22). Нитрозоалкены были получены из соответствующих α-галогеноксимов 65 после обработки Na 2 CO 3 . Эффективность реакции присоединения зависит как от обогащения электронами ароматического кольца, так и от электроноакцепторного характера заместителя в нитрозоалкене NSA14 .1,3-Диметоксибензол дает соответствующие продукты замещения с наибольшим выходом, а анизол в этих условиях не реагирует.

Схема 22: Электрофильное присоединение нитрозоалкенов NSA14 к электронно-богатым аренам.

Схема 22: Электрофильное присоединение нитрозоалкенов NSA14 к электронно-богатым аренам.

Богатые электронами ароматические гетероциклические соединения, такие как пирролы и индолы, более плавно вступают в реакции с нитрозоалкенами [44-55]).Добавление нитрозоалкенов к пирролам и индолам является удобной и мягкой стратегией функционализации этих гетероциклических систем. Как показано в ранних отчетах Гилкриста [44,45,56], оксиминоалкилирование этих гетероциклов с помощью NSA14 дает α-гетарилзамещенные оксимы 67 и 68 с высокими выходами и хорошей региоселективностью (схема 23). Следует отметить, что образование α-гетероарилоксимов 67 и 68 может происходить не только по Ar-механизму S E , но и по альтернативному пути [4 + 2] -циклоприсоединения / элиминации (для химия циклоприсоединения нитрозоалкенов см. обзоры и отчеты: [6-10,57,58]).

Схема 23: Присоединение нитрозоалкенов NSA14 к пирролам и индолам.

Схема 23: Присоединение нитрозоалкенов NSA14 к пирролам и индолам.

В недавней работе Паласиоса с соавторами описана реакция фосфинилнитрозоалкенов NSA15 (производных от соответствующих α-бромоксимов) с богатыми электронами азотными гетероциклами с образованием аддуктов 69 и сравнение электрофильного ароматического замещения (1) и циклоприсоединение (2) пути обсуждаются [59] (Схема 24).Квантово-химические расчеты показывают, что процесс [4 + 2] -циклоприсоединения (2) термодинамически предпочтителен для нитрозоалкенов, несущих электронодонорную группу R, тогда как присутствие электроноакцепторной группы в том же положении способствует пути электрофильного замещения (1) .

Схема 24: Реакция фосфинилнитрозоалкенов NSA15 с индолом.

Схема 24: Реакция фосфинилнитрозоалкенов NSA15 с индолом.

Пинхо и Мело с соавторами разработали двойное присоединение пирролов (и индолов) к нитрозоалкенам, полученным из α, α’-дигалогеноксимов, в одном реакторе 70 [60-62] (Схема 25).Синтез бис-пирролов 71 осуществляется в воде в качестве растворителя. Как указали авторы, гетерогенные условия могут увеличивать скорость реакции по сравнению с фазой органического растворителя.

Схема 25: Взаимодействие пиррола с α, α’-дигалогеноксимами 70 .

Схема 25: Взаимодействие пиррола с α, α’-дигалогеноксимами 70 .

Описанный метод оксиминоалкилирования С-3 положения индолов имеет большой потенциал для синтеза фармацевтически релевантных соединений и природных продуктов.Так, де Лера и соавторы описали синтез производного индола аналога псаммаплина А 72 , который проявлял более сильную активность, чем исходный природный продукт (схема 26) [63]. При их синтезе 5-бром-1 H -индол был превращен в соответствующий функционализированный оксим 73 под действием этилбромпирувата оксима в присутствии Na 2 CO 3 с выходом 60%. Аддукт превращали в карбоновую кислоту 74 , которую затем использовали в двойном амидировании цистамином с получением целевого соединения 72 после демаскировки оксима.Аналогичным образом получали ряд других аналогов псаммаплина А.

Схема 26: Синтез производного индола аналога псаммаплина А 72 .

Схема 26: Синтез производного индола аналога псаммаплина А 72 .

Восстановление оксимной группы в оксиминоалкилированных индолах обеспечивает прямой доступ к различным замещенным производным триптамина. Таким образом, восстановление аддуктов 68 , полученных из оксима этилбромпирувата и индолов, можно рассматривать как простой и удобный метод получения замещенных триптофанов 75 , как показано на схеме 27 [64].

Схема 27: Синтез триптофанов восстановлением оксиминоалкилированных индолов 68 .

Схема 27: Синтез триптофанов восстановлением оксиминоалкилированных индолов 68 .

Эта синтетическая схема нашла несколько применений в медицинской химии. Таким образом, Park и соавторы успешно использовали аддукты 68 в качестве промежуточных продуктов в синтезе ингибиторов фермента, превращающего фактор некроза опухоли-α 76 [65]. В 2012 году Догерти и его сотрудники использовали этот подход для получения 4,7-дифтортриптофана [66].

Подобная стратегия была успешно применена Оттенхеймом при полном синтезе аналога триптофансодержащего природного алкалоида неоэхинулина B (индол 77 ) [67,68] (Схема 28). На начальной стадии N -метилиндол алкилировали этилбромпируватоксимом и карбонатом натрия с получением аддукта 78 , который затем был превращен в N -производное гидрокситриптофана 79 с помощью аминолиза и восстановления с помощью (CH 3 ) 3 N · BH 3 комплекс [47,49,69].Ацилирование 79 пирувоилхлоридом дает амид 80 , который превращается в диоксопиперазин 81 под действием трифторуксусной кислоты. Последующее удаление воды дало заглавный аналог неоэхинулина B 77 .

Схема 28: Синтез Оттенхейма аналога неоэхинулина B 77 .

Схема 28: Синтез Оттенхейма аналога неоэхинулина B 77 .

Гилкрист [70] использовал оксиминоалкилирование пиррола в качестве начальной стадии в синтезе 1,2-дигидропирролизинонового антибиотика 82 [71-73] (схема 29).Добавление этил-2-нитрозоакрилата (полученного из оксима этилбромпирувата) к пирролу в основных условиях давало продукт 67a с выходом 61%. Последующее восстановление / защита оксима и селективное трифторацетилирование дало 2,5-дизамещенный пиррол 83 , который подвергался циклизации с получением дигидропирролизин-3-она 82 .

Схема 29: Синтез 1,2-дигидропирролизинонов 82 путем присоединения пиррола к оксиму этилбромпирувата.

Схема 29: Синтез 1,2-дигидропирролизинонов 82 путем присоединения пиррола к оксиму этилбромпирувата.

Kozikowski [74,75] использовал преимущество селективного оксиминоалкилирования индолов для построения основной структуры алкалоидов на основе индолактама 84 (активаторы протеинкиназы C), как показано на схеме 30.Используя ту же стратегию, Уэбб [76] и Резник [77] приготовили аналоги телеоцидина, а позже Квик [78] осуществил синтез индолактама V.

.

Схема 30: Стратегия Козиковского для алкалоидов на основе индолактама путем добавления индолов к оксиму этилбромпирувата.

Схема 30: Стратегия Козиковского для алкалоидов на основе индолактама путем добавления индолов к этилбромпирувату …

Тандемные процессы присоединения / циклизации С-нуклеофилов с участием конъюгированных нитрозоалкенов

Для некоторых C-нуклеофилов, обладающих дополнительно электрофильным центром, после присоединения к нитрозоалкенам по Михаэлю может следовать циклизация.Эти процессы имеют синтетическое значение, так как образуются биоактивные пяти- и шестичленные гетереоциклы N – O.

Характерным примером такого процесса является присоединение цианид-анионов к нитрозоалкенам по Михаэлю. Оно и его коллеги [79] сообщили, что реакция NSA , полученного из оксимов циклических хлоркетонов 1 , с цианидом натрия привела к соответствующим конденсированным 5-аминоизоксазолам 86 , а не к ожидаемым α-цианооксимам 85 (схема 31) .Считается, что первоначально образовавшиеся α-цианооксимы 85 подвергаются быстрой циклизации до производных изоксазола 86 . Интересно, что в случае более стерически затрудненного оксима 3-хлорно-камфоры был получен соответствующий α-цианооксим 85a , который не подвергался циклизации до изоксазола. Принимая во внимание тот факт, что циклические хлоркетоны получают хлорнитрозилированием циклических олефинов, общий процесс представляет собой очень простую стратегию превращения алкенов в биоактивные 5-аминоизоксазолы [80].

Схема 31: Присоединение цианид-аниона к нитрозоалкенам и последующая циклизация до 5-аминоизоксазолов 86 .

Схема 31: Присоединение цианид-аниона к нитрозоалкенам и последующая циклизация до 5-аминоизоксазолов 86 .

Наша группа использовала N , N -бис (силилокси) енамины 3 в качестве источников нитрозоалкенов в реакции с триметилсилилцианидом в присутствии триэтиламина в качестве катализатора (схема 32) [81]. Интересно, что начальные продукты присоединения улавливаются TMSCN, образуя стабильные TMS-эфиры α-цианооксимов 87 , которые можно выделить с помощью вакуумной перегонки.Мягкое десилилирование 87 инициирует внутримолекулярную циклизацию до 5-аминоизоксазолов 88 , которые были получены с выходами от умеренных до хороших. Следуя этой схеме синтеза, 5-аминоизоксазолы 88 могут быть легко получены из доступных нитроалканов в три стадии.

Схема 32: Et 3 N-катализируемое присоединение триметилсилилцианида к N , N -бис (силилокси) енаминам 3 , что приводит к 5-аминоизоксазолам 88 .

Схема 32: Et 3 N-катализируемое присоединение триметилсилилцианида к N , N -бис (силилокси) енаминам 3 , что приводит к 5-амино …

Недавно Танимото и его сотрудники [22] сообщили о добавлении TMSCN к промежуточному нитрозоаллену NSA16 , полученному из алленил N -силоксисульфонамида 89 в присутствии TBAF и диизопропилазодикарбоксилата.Интересно, что продукт присоединения , 90, не подвергается циклизации (схема 33).

Схема 33: Добавление TMSCN к алленил N -силоксисульфонамид 89 .

Схема 33: Добавление TMSCN к алленил N -силоксисульфонамид 89 .

В то же время при взаимодействии нитрозоалленов типа NSA16 с малодинитрилом и этилцианоуксусным эфиром были получены производные азафульвена 91 (схема 34) [82]. Примечательно, что образование пятичленного циклического нитрона посредством N-атаки оксима на цианогруппу более предпочтительно по сравнению с шестичленным N – O гетероциклом.

Схема 34: Реакция нитрозоалленов NSA16 с малодинитрилом и этилцианоуксусным эфиром.

Схема 34: Реакция нитрозоалленов NSA16 с малодинитрилом и этилцианоуксусным эфиром.

C-нуклеофилов, обладающих уходящими группами, также использовались в создании гетероциклов N – O с использованием нитрозоалкенов в качестве промежуточных продуктов. Ранним примером является реакция сульфоний-илидов 92 с α-галогенкетоксимами 1 , приводящая к изоксазолинам 93 , описанная Браво [11] и Гилкристом [83] (схема 35).Считается, что процесс протекает через образование промежуточного соединения нитрозоалкена ( NSA ) с последующей формальной реакцией [4 + 1] -аннелирования с илидом (тандемное присоединение по Майклу / внутримолекулярное нуклеофильное замещение диметилсульфида оксимат-анионом в промежуточном продукте 94 ).

Схема 35: [4 + 1] -Анцияция нитрозоалкенов NSA с сульфоний-илидами 92 .

Схема 35: [4 + 1] -Анцияция нитрозоалкенов NSA с сульфоний-илидами 92 .

Добавление сульфоний-илидов к нитрозоалкенам может привести не только к циклическим продуктам, но и к α, β-ненасыщенным оксимам 95 , если отщепление диметилсульфида из 94 происходит быстрее, чем циклизация.Было обнаружено, что селективность циклизации / элиминирования сильно зависит от природы заместителей в илиде 92 . Только когда R 3 представлял собой ацильную или фенацильную группу, наблюдалось исключительное образование изоксазолиновых продуктов 93 .

Илиды трифениларсония были изучены также в реакции с нитрозоалкенами, но были получены более низкие выходы изоксазолинов 93 по сравнению с илидами сульфония [11].

Следуя той же схеме реакции, Ченг с сотрудниками [84] применили диазосоединения 96 вместо сульфоний-илидов 92 в реакции с α-бромкетоксимами 1 (схема 36). Для реакции требуется медный катализатор, который превращает диазосоединение 96 в комплекс карбена металла 97 . Последний реагирует с промежуточным нитрозоалкеном NSA (образованным из α-бромкетоксима 1 ) с образованием изоксазолина 93 с извлечением катализатора.К сожалению, реакция осложняется одновременным [3 + 2] -циклоприсоединением диазосоединений 96 к нитрозоалкенам, приводящим к N -нитрозопиразолам 98 через промежуточные соединения 99 .

Схема 36: Взаимодействие диазосоединений 96 с нитрозоалкенами NSA .

Схема 36: Взаимодействие диазосоединений 96 с нитрозоалкенами NSA .

Существенное усовершенствование этой стратегии образования изоксазолинового кольца было недавно введено Li et al.[85], которые достигли окислительного [4 + 1] -аннелирования нитрозоалкенов с 1,3-дикарбонильными соединениями (схема 37). Оптимальные условия реакции требуют 2 эквивалента карбоната серебра в качестве окислителя и K 2 CO 3 в качестве основания для образования нитрозоалкена из предшественника галогеноксима 1 . Вероятный механизм включает начальное сопряженное присоединение дикарбонильных соединений к нитрозоалкену с последующей опосредованной серебром радикальной циклизацией образующихся оксимов 6 до конечных изоксазолинов 100 .Важно отметить, что реакция хорошо переносится различными заместителями как в галогеноксиме, так и в дикарбонильных соединениях, давая изоксазолины 100 с выходами от умеренных до высоких.

Схема 37: Стратегия тандемного присоединения Майкла / окислительной циклизации к изоксазолинам 100 .

Схема 37: Стратегия тандемного присоединения Майкла / окислительной циклизации к изоксазолинам 100 .

Характеристики дендритных клеток, происходящих из моноцитов, включающие редкую субпопуляцию клеток, способных к естественной интернализации внеклеточной дцДНК., Европейская сеть цитокинов

Настоящее исследование демонстрирует, что полученные из моноцитов дендритные клетки (moDC) продуцировали in vitro. с использованием протокола дифференцировки GM-CSF и IFN-α охватывают редкую (T} 5%) субпопуляцию клеток, демонстрирующих классическую морфологию дендритных клеток и способных к естественному развитию. интернализация внеклеточной собственной ДНК. Мы установили, что антигены DEFB, HMGB1, LL-37 и RAGE, которые опосредуют процесс интернализации ДНК, экспрессируются на поверхности moDC подобно плазматическим дендритным клеткам.Однако, в отличие от последней субпопуляции, эти клетки не продуцируют интерлейкин (IL) -37. Тем не менее, процесс интернализации ДНК не имел прямого отношения к присутствию вышеуказанных антигенов на поверхности этих клеток. Дендритные клетки были разделены на общие популяции и популяции, не усваиваемые ДНК, и продуцирование цитокинов было проанализировано через 24-48 часов после обработки ДНК. Мы показываем, что массивная секреция цитокинов дендритными клетками связана с субпопуляцией, интернализирующей дцДНК.Общий пул IFNmoDC секретирует провоспалительные цитокины «первой волны» (IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α) как через 24, так и через 48 часов. Было обнаружено, что противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-10 индуцируются умеренно, тогда как продукция GM-CSF, GCSF и IFN-γ индуцируется сильно. Обработка moDC дцДНК приводит к усиленной транскрипции IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-8, IL-10 и VEGF на 6 часов. Комбинированная обработка дцДНК + хлорохин оказывает синергетический эффект на транскрипцию только одного из тестируемых генов, при этом провоспалительный цитокин IFN-b демонстрирует наиболее сильную кратную индукцию к 24 часам.

中文 翻译 :


核 细胞 衍生 的 树突 状 细胞 的 特征 包括 能够 自然 胞 外 dsDNA 内部 化 的 罕见 细胞 亚 群。

表明 体外 产生 单 核 细胞 的 树突 状 细胞 (moDCs) 使用 GM-CSF 和 IFN-α 分化 方案 时 , 具有 罕见 的 (T} 5 亚 出 的 树突细胞 形态 并 能够 内 化 DEFB , HMGB1 , LL-37 介 导 DNA 内在 化 过程 的 RAGE moDC 的 表面 表达 , 样 树突 状。与 后者 的 亚 群 相反 , 这些 介 素 (IL) -37。 然而 DNA 化 的 过程 与 这些 细胞 的 没有 没有 细胞 分为 总 群体 群DNA 群体 , 时 48 24 在 48.都 分泌 促 «第一波» 细胞 因子 (IL-2 , IL-6 IL-8 , TNF-α)。 发现 适度 地 诱导 了 抗炎 细胞 因子 IL-4, IL-10 , 而 强烈GM-CSF , GCSF 和 IFN-γ 的 dsDNA 处理 moDCs 会 导致 IFN-α IFN-β IFN-γ IL-8 , IL-10 和 VEGF 6 小时。 组合 dsDNA + 喹 仅 的 一个 基因 的 转录 具有 ​​协同 作用 , 促 炎 细胞 因子 IFN-b 24 小时 内 表现 出 的 的 倍数 IFNmoDC 时间 48 小时 分泌 都炎性 «第一波» 细胞 因子 (IL-2 , IL-6 , IL-8 TNF-α)。 发现 适度 了 抗炎 细胞 因子 IL-4 和 IL-10 , 而 强烈 诱导 了 GM- CSF GCSF 和 IFN-γ。 dsDNA 处理 moDCs 会 导致 IFN-α IFN-β IFN-γ , IL-8 , IL-10 和 VEGF 的 上调 6 小时。 组合 dsDNA + 氯 喹 处理 对测试 的 一个 基因 的 转录 具有 ​​协同 因子 IFN-b 在 24 小时 内 出 最强 的 倍数 诱导 作用 。IFNmoDC 的 库 在 24 和 48 小时 分泌 促 “第一波 ”细胞 因子 (IL-2 , IL-6 , IL-8 TNF-α)。 发现 适度 地 子 IL-4 和 IL-10 , 而 诱导 GM-CSF , GCSF 和IFN-γ dsDNA moDCs-导致 IFN-α IFN-β IFN-γ IL-8 , IL-10 VEGF 的 上调 6 小组合 dsDNA + 处理 处理 仅 测试IFN-b 的 转录 协同 作用 细胞 子 IFN-b 24 小时 内 最强 的 倍数 诱导 作用。 dsDNA, moDCs 会 导致 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-8, IL-10, VEGF, 的, 转录 上调 6 小时。 组合 的 dsDNA + 氯 喹IFN-b, 24, 的 诱导 的 dsDNA, moDCs, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-γ. IL-8 , IL-10 VEGF 的 转录 上调 6 小时。 组合 的 dsDNA + 氯 喹 的 一个 的 转录 具有 ​​促 炎 因子 IFN-b 24 小时 内 表现 出 最强.倍数 诱导 作用。

Профили экспрессии генов опухолевых стволовых клеток из мышиной карциномы Кребса-2 с использованием нового маркера низкодифференцированных клеток

ВВЕДЕНИЕ

Опухолевые стволовые клетки (TISC) были открыты в конце 1990-х годов [1, 2].У них есть набор специфических свойств, общих для стволовых и раковых клеток. Эти клетки способны к самообновлению; они поддерживают состояние плюрипотентности и определяют канцерогенный потенциал трансплантата. Одной из основных особенностей TISCs является их способность образовывать метастазы, что объясняется изменением экспрессии генетической сети, контролируемой эпителиально-мезенхимальным переходом [3].

Понимание молекулярных основ функционирования TISC и разработка подходов к их искоренению связаны с двумя практическими задачами: идентификацией этих клеток в пуле раковых клеток и установлением молекулярного портрета экспрессии генов в этих клетках.Существует несколько способов идентификации TISC в пуле раковых клеток [4–9]. Один из них основан на анализе маркеров клеточной поверхности, специфичных для данного типа клеток [6]. На сегодняшний день не идентифицировано универсального маркера клеточной поверхности, который можно было бы использовать для идентификации TISC при различных формах рака. Другой способ обнаружения TISC основан на их способности выводить липофильные красители, такие как родамин или Hoechst. Именно эти два метода используются для выделения TISC в количестве, необходимом для проведения анализа на микрочипах или RNAseq и для получения молекулярного портрета этого типа клеток.Используя эти два подхода, были созданы молекулярные портреты экспрессии генов нескольких типов TISC [9–15].

В наших исследованиях [16–20] мы охарактеризовали новый маркер низкодифференцированных клеток различного происхождения, в том числе TISC, — способность интернализовать фрагменты внеклеточной двухцепочечной ДНК (например, плазмидную ДНК или меченную FITC / TAMRA Продукты ПЦР) за счет естественного механизма интернализации.

На модели асцитной опухоли Кребса-2 было показано, что клетки TAMRA + запускают рост новой опухоли с аналогичными гистологическими характеристиками.Удаление этих клеток приводит к устранению потенциала приживления клеток и излечению мышей от развитого асцита Кребса-2 [16, 20].

В этом исследовании мы использовали указанный выше маркер для идентификации набора генов, сверхэкспрессированных в клетках TAMRA + Krebs-2. На основании этого был получен молекулярный портрет экспрессии генов в опухолевых клетках TAMRA + Krebs-2, который твердо позиционирует эти клетки как TISC.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интернализация меченных TAMRA фрагментов ДНК клетками Krebs-2, RNAseq

Ранее было продемонстрировано, что асцитные клетки Krebs-2 интернализируют ДНК-зонд, меченный TAMRA, посредством естественного механизма интернализации [16, 20].От 0,1 до 3% клеток Кребса-2 естественным образом способны захватывать внеклеточные двухцепочечные фрагменты ДНК (рис. 1A, 1B). Используя это свойство, популяции клеток, содержащие TAMRA-меченую ДНК и TAMRA– клетки, были выделены из клеток Krebs-2, обработанных TAMRA-ДНК, путем повторной сортировки (BD FACSAria, Becton Dickinson), при этом клетки-мишени TAMRA + стали обогащенными на 50-80%. и с почти 100% чистыми клетками TAMRA — (рис. 1C).

Рис. 1. Анализ интернализации ДНК, меченной TAMRA, в клетки Кребса-2 (Axioskop 2 Plus, Zeiss).( A ) Интернализация меченного TAMRA человеческого Alu -фрагмента в асцитные клетки Krebs-2. ( B ) Интернализация TAMRA-меченной тотальной фрагментированной ДНК человека асцитом Кребса-2. ( C ) Анализ обогащения популяции клеток TAMRA– и TAMRA + Krebs-2 с помощью процедуры сортировки (BD FACSAria, Becton Dickinson).

Для получения и анализа транскриптов РНК применяли программу RNAseq. В результате было получено 2 миллиона чтений.

Обрезка, анализ и сопоставление считываний

На рисунке 2 показаны типичные снимки и показан общий подход к визуальному анализу данных сопоставления, которые в дальнейшем будут называться «профилями выражений».Поскольку было практически невозможно выделить чистую популяцию клеток TAMRA + в количестве, достаточном для выделения РНК и последующего секвенирования РНК (можно было достичь только 10-12-кратного обогащения этой популяции; дополнительные раунды сортировки резко снизили выживаемость клеток и , как следствие, доступность РНК), в то время как чистая популяция TAMRA — была доступна почти неограниченно, мы выбрали только те гены, которые экспрессировались исключительно в клетках TAMRA +.

Рисунок 2: ( A ) Общий вид профилей экспрессии клеток TAMRA + (синий профиль) и TAMRA– (зеленый профиль), наложенных на ген меланорегулина ( Mreg , uc007bkg.2, хромосома 1, — нить) маркировка. Ген состоит из 5 экзонов, представленных в виде прямоугольников с желтым и темно-фиолетовым заполнением. Желтый цвет соответствует некодирующим (непереводимым) последовательностям, темно-фиолетовый — кодирующим последовательностям. Оба профиля содержат пики, которые лежат внутри границ гена, но в случае клеток TAMRA– большинство из них расположены над интронами и поэтому не представляют для нас интереса, в то время как профиль TAMRA + содержит пики, точно соответствующие экзонам. ( B ) Детальный вид профилей экспрессии клеток TAMRA + (синий профиль) и TAMRA– (зеленый профиль), наложенных на ген Cd5l ( Cd5l , uc008psa.2, хромосома 3, + нить) маркировка. 1 — Генная раскладка. Ген состоит из 6 экзонов, которые нарисованы в виде закрашенных прямоугольников над черной линией, которая, в свою очередь, представляет расположение гена над хромосомой. Желтый цвет соответствует некодирующим последовательностям, темно-фиолетовый — кодирующим последовательностям. Экзоны считаются слева направо. 2– Профили экспрессии для TAMRA + (верхний синий профиль) и TAMRA — (нижний зеленый профиль). Высота пиков представляет собой количество считываний, сброшенных в определенную область хромосомы.3 — Детальный вид экзона 3. Показательно, что, несмотря на разрыв внутри границ экзона (отмеченный вертикальными синими линиями), короткие хвосты считываний были точно выровнены по расположению экзона. TAMRA– профиль также содержит одно чтение, которое попало в этот экзон. Мы не можем определить, является ли это событие случайным или нет, поскольку оно не может быть обнаружено по несовпадению нуклеотидов или подтверждено интронными свидетельствами. 4 — Детальный вид соединения экзона 4 с экзоном 5. Показательно, что «после сращивания» профиль экспрессии будет плавным и непрерывным.( C ) Детальный вид профилей экспрессии клеток TAMRA + (синий профиль) и TAMRA– (зеленый профиль), наложенных на маркировку гена Claudin 1 ( Cldn1 , uc007yuz.2, хромосома 16, — цепь). 1 — Генная раскладка. 2 — Профили экспрессии. 3 — «Контрастная полоса». Этот «профиль», который состоит из красных полос, представляющих разницу между двумя профилями экспрессии точно внутри границ экзонов, используется только для большего удобства визуального анализа. Чем выше полоса, тем значительнее разница.Абсолютная разница (один из профилей не содержит считываний, сброшенных на определенный экзон) отображается полной полосой и соответствует 100%. Направление полосы (вверх или вниз) отображает профиль с более низким уровнем выраженности. Видно, что профиль TAMRA — клеток демонстрирует почти полное отсутствие экспрессии. 4 — Детальный вид экзона 3. Профиль TAMRA– содержит единственное считывание, сброшенное на экзон, но его правый хвост лежит за границей экзона, что означает случайный характер этого события.Фактически, у нас есть абсолютная разница между профилями TAMRA + и TAMRA–, но зритель нарисовал ограниченную полосу различия из-за «формального попадания» в профиль TAMRA–.

После первичного визуального осмотра мы получили набор примерно из 300 генов. Для этих генов мы извлекли соответствующие последовательности мРНК, которые в дальнейшем были использованы в качестве целевых последовательностей для повторного картирования общих считываний как из наборов данных TAMRA +, так и TAMRA–. Всего было выполнено 3 раунда картирования с последовательно более строгими порогами специфичности, что позволило нам отфильтровать значительное количество генов, не прошедших тест.Этот шаг был необходим из-за небольшого количества (2 миллиона) считываний, что, в свою очередь, было следствием ранее описанных трудностей. Предполагается, что такое небольшое количество отображенных чтений приведет к ряду «бездомных» чтений, которые иногда могут быть отображены в неправильном месте и, таким образом, давать ложноположительный или ложноотрицательный сигнал.

В результате мы получили набор из 168 генов, которые экспрессировались в клетках TAMRA + и не экспрессировались (или экспрессировались на крайне низком уровне) в клетках TAMRA–.Далее эти гены были подвергнуты анализу КПЦР для дополнительной проверки.

Систематизация генов и их разбивка на функциональные группы

Дополнительная таблица S1 содержит список из 168 генов с их регистрационными номерами GenBank, частотой считываний в клетках TAMRA– и TAMRA +, а также данные экспрессии qPCR для выбранных генов (TAMRA + vs TAMRA — клетки). Кроме того, для некоторых генов предоставляется информация о типе белка и субклеточной локализации в соответствии с классификацией Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

Чтобы определить, участвует ли ген в молекулярных путях, определяющих основные биологические характеристики клетки, были использованы два разных подхода.

Первый подход был основан на данных, полученных в исследовании Dolgova et al. [16], что указывает на то, что клетки TAMRA + обладают свойствами TISC. Это, в свою очередь, указывает на то, что термины онтологии генов (GO), относящиеся к «стволовости» и «раку», должны быть чрезмерно представлены среди генов, специфичных для клеток TAMRA +. Было ли это на самом деле так, было проверено путем сопоставления их свойств, описанных в оригинальных статьях, с указанными выше категориями GO.

«Стволовые» гены

Стволовая клетка характеризуется двумя признаками: способностью асимметрично делиться и способностью развиваться в любые типы клеток тела (признак плюрипотентности), передавая это свойство одной из дочерних клеток. на протяжении многих актов деления клеток.

Асимметричное деление стволовых клеток обеспечивается путями HH, NOTCH и WNT [21–27]. Плюрипотентный статус стволовых клеток в первую очередь поддерживается с помощью системы передачи сигналов ретинола [28].Таким образом, для проверки «стволовости» генов, специфически экспрессируемых в клетках TAMRA +, их рассматривали с точки зрения их участия в поддержании плюрипотентности и асимметричном делении.

Асимметричное деление (первая группа) — Asb4, Nfatc2, Ppap2b, Tcf7l2, Uty, Wnt5a, Dnaja4, Rab37, Thpo, Sox9.

Поддержание плюрипотентности (молекулярные факторы системы регуляции ретинола) (вторая группа) — Zfp39, Abca1, Abca9, Abca13, Aldh2a1, Aldh2l1, Bmper, Crabp2, Cyp2d26, Cyp26a1, Eiff2s3y, Rragd, Rbp7, Rrh.

Другие факторы стволовых клеток (третья группа) — Clec11a, Lhx4, Gtf2a1l, Tbata, Mreg, Slc43a3, Ifi27l2b.

Всего в группе генов, определяющих «стволовые» свойства клеток TAMRA +, обнаружено 34 гена. Способность клеток к асимметричному клеточному делению характеризуется активностью генов WNT-зависимого сигнального каскада (10 генов). Поддержание плюрипотентного состояния во многих делениях определяется сигнальным каскадом ретиноловой системы (17 генов).В каждой группе есть гены, которые известны как ключевые регуляторы этих каскадов. Для группы 1 они включают факторы транскрипции Sox9 , Nfatc2 , Tcf7l2 , Ppap2b и секретируемые цитокины Wnt5a , Thpo . Для второй группы это факторы роста Igf1 и Igf2 . Кроме того, клетки TAMRA + характеризуются экспрессией генов, принадлежащих к другим молекулярным системам стволовых клеток (третья группа).Это фактор роста Clec11a , фактор транскрипции Lhx4 и белки Gtf2a1l , Tbata , Mreg , Slc43a3 , Ifi27l2b .

Гены группы «Рак»

TISC обладают следующими уникальными свойствами, позволяющими им не зависеть от морфогенетических законов, определяющих упорядоченность клеточных систем организма. При делении TISC образуют клетки двух типов. Образуется клетка, полностью идентичная исходным тотипотентным клеткам, плюс коммитированная клетка, способная к множественному, но не бесконечному делению.TISC может вызвать развитие новой опухоли, имеющей те же гистологические характеристики, что и исходная опухоль [29–31]. Кроме того, TISCs способны метастазировать [32–34]. Способность TISCs метастазировать определяется свойством этих клеток претерпевать эпителиально-мезенхимальный переход [35–39]. Происходит ремоделирование цитоскелета и проявляются факторы, изменяющие структуру внеклеточного матрикса в клеточной среде. Таким образом, клетка способна пересекать базальную мембрану и эндотелиальную стенку, перемещаться с током крови, экстравазировать и образовывать новое опухолевое гнездо.В этом процессе TISC последовательно активирует соответствующие генные системы, приобретает свойство избегать атаки иммунной клеточной системы [40] и активирует антиапоптотические гены [41–44]. Кроме того, TISC обладают другими уникальными качествами, такими как способность устранять и нейтрализовать токсины [45–49], взаимодействовать с клетками окружающей стромы и стимулировать их переход к анаэробному дыханию (гликолизу), известному как эффект Варбурга [50–52]. Регуляция роста и дифференцировки опухолевой клетки также связана с метаболизмом Ca2 + и определяется кальций-зависимой протеинкиназой (PKC).Обычно PKC действует как модулятор и уравновешивает процессы роста и дифференциации. Опухолевые клетки неизменно характеризуются сверхактивацией PKC, которая, в свою очередь, вызывает пролиферацию, стимулирует образование фосфотирозина и усиливает неконтролируемое размножение клеток. Известно, что PKC активируется 3-фосфоинозитол-зависимой протеинкиназой (PDK) [53–55]. Кроме того, было описано, что апоптотические пузырьки раковых клеток сливаются вместе вокруг основного тела, образуя так называемые пузырьковые поля, которые обладают свойствами TISC [56].Каждое из вышеперечисленных свойств характеризуется согласованной активностью определенного набора генов. Как и выше, выбранный набор генов был проанализирован на предмет возможного вовлечения в рак на основании литературных данных.

Онкогены, онкосупрессоры — Eef1a2, Per2, Rasgrp3, Sash2, Tal1 .

Гены, характерные для раковых клеток — Oit3, Tnxb, Zfr2, VpreB3, Trim40 .

Подавление иммунитета — Arg2, Vsig4 .

Множественная лекарственная устойчивость, детоксикация — Abca1, Abca13, Aldh2l1, Gstm3.

Антиапоптотические гены — Cd5l, Tnfrsf13c.

Реорганизация цитоскелета — Myo1b, Pdlim4, Ttll2, Tubb1, Trpv4, Upk1b, Cobl, Cp, Dock10.

Реорганизация BM, адгезия, подвижность в тканях — Pde4d, Prg4, Nrcam, Perp, Comp, Igsf3, Pvrl1, S100a14, Adamts2, Acpp, Fcna, Fblim1, Dsc2, Col6a2, Col3a1, Hepacp2, Itga9 .

Распространение через кровоток, выход из кровеносных сосудов — Selp, Lyve1, Cldn1.

Ангиогенез — Pdzd3 (Pdzk1).

Выживаемость в тканях — Wnk2, Gas6.

Обмен кальция — Pdk4.

Всего по литературным данным в категорию «Рак» попали 54 гена.

Гены, относящиеся к цАМФ-зависимому сигнальному пути

Анализ генов, дифференциально экспрессируемых в клетках TAMRA +, позволил нам идентифицировать группу генов, которые так или иначе связаны с цАМФ-зависимым сигнальным путем.Это одна из самых древних (если не самая древняя) сигнальная система, которая широко участвует в различных клеточных процессах, таких как выживание клеток и уклонение от апоптоза, немедленный ранний ответ на митогены, дифференцировка и дедифференцировка клеток, метаболизм липидов. и углеводы. Реконструированная сеть (Рисунок 3) включает более 20% (36 из 168) идентифицированных генов, специфичных для раковых стволовых клеток, которые, среди прочего, обеспечивают достаточную положительную обратную связь для поддержания активности системы (дополнительная таблица S2): Nt5e , Acpp, Pde4d, Pde7b, Igf1, Igf2, Pf4, Gpha2, Prok2, Nts, Wnt5a, Nppa, Adrb3, Fgfr1, Gpr97, Gpr128, Cacna1d, Cp, Pdk4, Riiad1, Trpv4200, Abca1ata, Cd .Kcnq2, Itm2a, Pon1, Tal1, Per2, Slc2a4, Tdo2, Mmp2, Alox15, Mst1.

Рисунок 3: ЦАМФ-зависимая сигнальная сеть. Гены, образующие сигнальное ядро ​​цАМФ, показаны желтым; синий обозначает вышестоящие гены, которые регулируют метаболизм цАМФ и активность сигнального ядра; зеленый — нижестоящие гены, на которые влияет система передачи сигналов цАМФ; розовый — гены, оказывающие ингибирующее действие на сигнальный путь цАМФ; гены, которые могут образовывать положительную обратную связь, показаны красным.

Все гены условно разделены на 3 группы: 1.вышестоящие гены, которые регулируют метаболизм цАМФ и активность сигнального ядра; 2. гены самой сигнальной системы, включающие цАМФ-метаболические ферменты и комплекс PKA; 3. нижестоящие гены, на которые влияет система передачи сигналов цАМФ. Гены с положительной обратной связью показаны красным. Большинство вышестоящих генов влияют на активность аденилатциклазы, но есть ряд из них, которые влияют на PKA и саму родственную систему. Интересно отметить, что Wnt5a использует оба пути: он запускает повышение уровня цАМФ на плазматической мембране и участвует в увеличении каталитических субъединиц PKA.Нижестоящие гены, в свою очередь, образуют 2 группы: 1) функционально активированные, которые включают факторы транскрипции (например, Nfatc2 , который функционально активируется посредством PKA-зависимой инактивации киназы-3β гликогенсинтазы) или любые эффекторы клеточной функции (например, Kcnq2 , который функционально активируется посредством PKA-зависимого фосфорилирования) и 2) транскрипционно активируется, что также включает факторы транскрипции (например, Per2 ) и молекулы, которые участвуют в некоторых клеточных процессах (например, Pon1 ).Клеточные процессы, регулируемые нисходящим потоком, включают транспорт K + ( Kcnq2 ) или Ca2 + ( Trpv4 ), липидный ( Abca1 ) и углеводный ( Amy1 ) метаболизм, а также клеточную дифференцировку и приверженность ( Itm2a ). ) и много других.

Оставшиеся 55 генов — Alas2, Amac1, Ankrd22, Ap1m2, Blnk, Catsperg2, Ccdc8, Ccr3, Cd55, Cplx1, Crabp2, Ddx3y, Dusp13, Fam107a, Fmnl2, Gdf10ng, Ggt7, Gdf10ng, Ggt7 Иглон5, Il10, Il17rb, Inhbe, Jsrp1, Lass4 / Cers4, Lpcat2b, Maged2, Marco, Mycbpap, Nppa, Pdlim3, Ppfia4, Psd2, Pydc4, Pyroxd2, Rab15, Sec14l4, Sec31b, Serb1l, Serb1l, Serb1l3, Serb1l4, SEC31B, Serb1l, Serb1l Slco4a1, Srms, Tdo2, Timp3, Tmem59l, Tmem82, Tnn, Upk3b, Vsig8, Xlr3a также были аннотированы в соответствии с их функциями, описанными в исходных публикациях, без привязки их к молекулярным системам, определяющим свойства TISC.В этой группе можно идентифицировать гены, которые участвуют в метаболических путях в качестве активаторов или репрессоров молекулярных каскадов этих путей. К ним относятся факторы роста ( Gdf6 , Inhbe ), киназа ( Srms ), фактор транскрипции ( Lass4 / Cers4 ) и цитокины ( Il10 , Il17rb ). Некоторые из этих генов недостаточно охарактеризованы с точки зрения их функции и представляют большой интерес, поскольку они могут представлять потенциальные мишени в терапии против TISC (по крайней мере, в контексте раковых клеток Krebs-2).

Следует отметить, что более 40 генов, характерных для TAMRA + TISC Krebs-2 (распределенных по всем группам), входят в список основного набора генов, участвующих в эпителиально-мезенхимальном переходе раковых клеток [3, 38 ] (Дополнительная таблица S2). Список включает две секретируемые триггерные молекулы — Wnt5a и Igf , которые являются ключевыми для этого процесса.

Проверка данных дифференциальной экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени

Для проверки результатов, полученных в экспериментах RNAseq, мы провели кПЦР на кДНК, синтезированной из полиА + мРНК клеток TAMRA + и TAMRA–.Охарактеризована экспрессия основных генов, представляющих интересующие категории. Результаты этого анализа показаны на фиг. 4 и представлены как кратное увеличение экспрессии в клетках TAMRA + по сравнению с клетками TAMRA–.

Рисунок 4: Проверка данных экспрессии генов выбранных генов, идентифицированных в RNAseq, с помощью ПЦР в реальном времени. Гены разделены на основные группы GO: стволовые, рак, метастазирование, контроль метаболизма.

Проведенный анализ подтвердил результаты RNAseq и позволил идентифицировать группу генов, которые сверхэкспрессируются в раковых клетках Krebs-2 .В этой группе выделяются две пары генов: секретируемый фактор роста Igf1 и активированный им фактор транскрипции Nfatc2 , а также цитокин Wnt5 и его нижестоящий целевой фактор транскрипции Tcf7L2 (Рисунок 5).

Фигура 5: ( A ) Распределение всей экспрессии генов клеток TAMRA + Krebs-2 в кПЦР. (B) Список из 22 генов, экспрессия которых в клетках TAMRA + относительно клеток TAMRA– была максимальной при кПЦР.

WNT5, как известно, является триггерной молекулой WNT5-зависимого сигнального пути, тогда как фактор транскрипции TCF712, активированный в результате запуска сигнального каскада WNT, запускает транскрипцию генов генетической сети, определяющих свойства стволовости TAMRA + Krebs. -2 клетки [57–60].В свою очередь, IGF2 является триггерной молекулой сигнального каскада MAPK, где передача сигналов сходится на транскрипционном факторе NFATC2, который индуцирует транскрипцию генов из генетической сети, определяющей раковые свойства клеток [61–63]. В то же время список сверхэкспрессируемых генов не включает ни одного из промежуточных факторов указанных сигнальных путей. Мы полагаем, что TISC могут контролировать поддержание своих стволовых и раковых свойств аутокринным способом, постоянно повышая экспрессию этих молекул.Секретируемые факторы могут обеспечивать пространственную защиту от различных внеклеточных регуляторных молекул или других факторов, в частности регуляторных экзосом. Повышенная локальная концентрация таких факторов может, таким образом, формировать «защитный экран» вокруг клетки и поддерживать постоянную внеклеточную триггерную передачу сигналов [64–66]. Высокая экспрессия специфических факторов транскрипции обеспечивает обязательную активацию строго определенной генетической сети, которая формирует фенотип TISC. Примечательно, что NFATC2 активирует гены, кодирующие секретируемые факторы роста и цитокины ( Wnt5, Igf1, 2, Il-10 ) и гены многофункциональных факторов транскрипции ( Gata6, Tal1, Tcf7L2 ).Одновременно с этим происходит автоактивация Nfatc2 (дополнительная таблица S3). Такой паттерн взаимодействий между проанализированными факторами предполагает, что обе пары белков (IGF1-NFATC2, WNT5-TCF7L2), IL10, GATA6 и TAL1 взаимосвязаны в общей сети активации и, таким образом, запускают и контролируют несколько сигнальных каскадов.

В общем списке сверхэкспрессируемых генов наиболее заметны две группы, составляющие более половины списка и определяющие особенности стволовости клеток — несимметричное деление и плюрипотентность.Повышенная экспрессия таких генов может отражать онтологическую необходимость существования этого типа клеток, в первую очередь контроля и сохранения свойств стволовости, которые обеспечивают клетке множество преимуществ по сравнению с коммитированной соматической клеткой.

Сравнительный функциональный анализ генов, специфически сверхэкспрессируемых в TAMRA + Krebs-2 TISC, в ресурсах базы данных

Затем найденный набор генов сравнивался с текущими базами данных путей / функций для оценки их возможного вклада в регуляцию TISC Krebs-2.Для оценки функциональных ассоциаций был проведен анализ с использованием платформ Ingenuity Pathway Analysis (IPA) и KEGG, которые группируют гены в функциональные группы, а также с использованием системы OPOSSUM для анализа потенциальных мишеней факторов транскрипции.

При скармливании 168 генов, сверхэкспрессируемых в TAMRA + Krebs-2 TISC, IPA сгруппировал их в 4 основные генетические сети (рис. 6). Как и ожидалось, в соответствии с описанным выше ручным анализом, эти гены в первую очередь участвуют в функциях клетки, таких как развитие организма, морфология клетки, и вносят вклад в различные молекулярные системы, определяющие биологические свойства раковой клетки.

Рисунок 6: Гипотетические сети взаимодействия 168 генов, экспрессируемых в TAMRA + Krebs-2 TISC, по оценке IPA. ( A ) Функции клеток, в которых участвуют гены, сверхэкспрессированные в клетках TAMRA + (RNAseq). ( B ) 4 генные сети и объединяющие их функциональные молекулы (схематический вид). ( C ) увеличенное изображение 4 основных генных сетей.

Четыре идентифицированные генные сети связаны между собой функциональными молекулами (киназа PDK4, фосфатаза ACPP и фактор транскрипции TCF7L2), и поэтому они могут составлять общую систему функциональных ассоциаций в TAMRA + Krebs-2 TISCs (Рисунок 6B).

В общем списке генов, обрабатываемых IPA, были идентифицированы группы генов, которые опосредуют, запускают или блокируют определенные генные программы. Были обнаружены следующие категории: факторы транскрипции, киназы, фосфатазы, факторы роста и цитокины (таблица 1).

Таблица 1: Группы генов, участвующих в запуске или блокировке определенных генных программ

27

27

27

9

92 9273 927 927 932 927 9152 9152 927 927 927 927 927 927 927 927 927 927 7

Киназ

Фосфатаз

9000 факторов роста

Факторы транскрипции

Fgfr1

Acpp

9152 9272 9152

9152 9273 927

9272 9273

Pdk4

Dusp23

Gas6

Pf4

Nt5e

Gdf6

Thpo

Lhx4

Srk3

PON1

IGF1

Wnt5a

Nfatc2

Ppap2b

Igf2

Per2

Инхбе

Tal1

Mst1

cf7 9273 932

Sox9

Оказалось, что генные сети, построенные IPA, включают в себя общие клеточные регуляторы транскрипции ( Nfatc2, Tal1, Gata6, Tcf7l2 + ), а также известные факторы роста и киназы. как ключевые индукторы многих важных клеточных сигнальных систем ( Fgfr1, Igf1,2, Mst1, Wnt5 ).

Анализ

OPOSSUM дал список генов-мишеней для факторов транскрипции Nfatc2, Sox9, Tal1 / Gata1, Tal1 / Tcf3, и Tcf7l2 + . Этот анализ предполагает, что 69 генов из 168 находятся под контролем этих факторов, включая собственные гены и гены других факторов транскрипции (дополнительная таблица S3). Обращает на себя внимание активация путем регуляции генов факторов роста и цитокинов, определяющих специфические функции клетки и / или участвующих в поддержании этих функций ( Igf1,2, Mst1, Il10, Wnt5a, Gdf6 ), которые, по их мнению, В свою очередь, активируют указанные факторы транскрипции, образуя петлю активации функции.

Анализ KEGG показывает, что несколько критических сигнальных путей могут быть активными в TAMRA + Krebs-2 TISCs. Эти сигнальные системы определяют как стволовые, так и раковые фенотипы этих клеток. Снова были обнаружены две пары генов, Igf2-Nfatc2 и Wnt5-Tcf7l2 + , которые являются основными игроками в MAPK- и WNT-зависимых сигнальных системах. Известно, что первая пара генов активируется в раковых клетках, а вторая определяет стволовые свойства клетки. Кроме того, NFAT2C является фактором транскрипции таких сигнальных клеточных систем, как цАМФ и VEGF.Можно также упомянуть еще одну интересную пару активируемых генов в TAMRA + Krebs-2 TISC, которые участвуют в mTOR-зависимом сигнальном пути — это Igf1,2 и Eef1a2 . То, что активность этого каскада генов увеличивается в TISCs Krebs-2, подтверждается фактом наибольшей разницы в экспрессии генов Igf1,2 в клетках TAMRA + по сравнению с TAMRA–. Как отмечалось ранее, в TAMRA + Krebs-2 TISCs активация генов, которые кодируют другие факторы роста / цитокины и факторы транскрипции и которые, по-видимому, не участвуют в общем пути, обнаруживается с помощью анализа KEGG.К ним относятся гены Mst1, Il10 , Gata6, и Sox9 , которые являются функциональными компонентами cGTP-, cAMP- и FOXO-зависимых сигнальных каскадов.

ОБСУЖДЕНИЕ

С момента открытия ЦПТИ активно исследуются во многих лабораториях мира. Помимо важности академических знаний об особенностях этого типа клеток, ученых интересует поиск молекулярных факторов, отличающих эти клетки от нормальных стволовых клеток и от коммитированных клеток.Предполагается, что, зная определенные различающие молекулы, которые находятся на вершине сигнальных каскадов, определяющих свойства TISC, можно нацеливать и блокировать эти факторы, тем самым разрушая сигнальные пути и удаляя клетки из патологической ткани, улучшая терапевтический прогноз [67 –69]. В настоящее время проводятся исследования молекулярного паттерна экспрессии РНК генов разных типов клеток, включая TISC, в надежде определить либо молекулярную мишень, общую для всех типов TISC, либо молекулярный фактор, специфичный только для этого типа TISC.Для изготовления препарата TISC используются либо их способность выводить липофильные красители, такие как родамин или Hoechst, либо флуоресцентные антитела для характерного поверхностного маркера.

Известно, что статус TISC определяется активностью генетических платформ, активируемых функционально связанными сигнальными каскадами, формирующими стволовые и раковые свойства этих клеток. Основные молекулы любых описанных сигнальных путей представлены функциональной парой — внеклеточным пусковым лигандом, к которому в первую очередь принадлежат секретируемые факторы роста и цитокины (и их рецепторы), и специфические факторы транскрипции, активируемые ими, которые запускают генную платформу, которая определяет конкретные свойства или функцию клетки.Другие промежуточные и конечные факторы в основном определяют передачу сигнала или связь с другими молекулярными каскадами или специфический функциональный ответ клетки.

Анализ генов, сверхэкспрессируемых в клетках TAMRA +, позволил нам предложить идею аутокринного контроля основных качеств TISC за счет повышенной экспрессии специфических триггерных секретируемых факторов, запускающих сигнальные каскады, которые определяют стволовые и раковые свойства TISC. и проявляются в активации определенных генетических платформ онтологически связанными факторами транскрипции, также характеризующимися повышенной экспрессией.

Мы предположили, что это свойство характерно для других типов ЦПТИ. Мы проанализировали набор генов, полученных на микрочипах и с помощью анализа RNAseq 4 библиотек транскриптомов TISC (таблица 2, дополнительная таблица S2).

Таблица 2: Сравнительный анализ функциональных групп генов в библиотеках транскриптомов, полученных для раковых стволовых клеток нескольких типов рака

9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 914 927 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 915 915 915 9152 915 915 915 915 9152 9152 915 927 9152 915 927 9152 915 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 91522 932 932 915 915 927 932 932 915 915 9152 932

915 915 927 932

915 9152 9152 932 9152 9152 9152 9152 9152 9152 915 ]

9152 9152 9153 9152 9152 9153 927

0 91 527

WNT

Раковые стволовые клетки

Экстраклеточные триггеры

Факторы транскрипции

Активированные сигнальные пути

Это исследование

Мышиные опухоли Кребса-2 932

00 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152 9152

МАПК

Igf 1,2

Tal1

WNT

9152
9152 9152

Gata6

MTOR

MST1

TCF7L2

FOXO

Wnt5a

Sox9

cGTP

cAMP

Карцинома печени человека

IGF BP5

FOSL1

MAPK / ERK

FOXO

[12]

Аденокарцинома яичников человека

EGFR 932 932 9152

EGFR 9273 9279 9152 9152

FZD5, 7, 8

TLE

WNT

PI3K / AKT / mTOR

IL6

RA / UNX

FOX144 927 932 932 915

5915 927 927 932 915 915 915 927 9275

NKX3.1

+

CSF1

LIF

+

NR4a2

+

TGF 1

NRG1

+

PLAGL2

VEGF

NRP2

EGF

Рак простаты человека

CSF2

STAT1

MAPK / ERK

9152
9152
9152
9152 915 NF KB1

WNT

IL6

BTG1

4 927 927 927 927 915
4 927 927 927 914 914 914 915 915 915 927 927 914 927 914 927 914 914 927 914 914 927 915

JAK / стат

Линия клеток остеосаркомы человека

IGF1

NFIX

MAPK

0 9153

0

0 9153

SPI1

MTOR

TFDP1

FOXO

IGF

Библиотека генов [9] была получена для раковых стволовых клеток карциномы печени человека.Для этого типа раковых стволовых клеток выявляются следующие онтологические парные триггерные молекулы и ТФ: внеклеточный активатор / стабилизатор IGF / IGFBP5 в качестве маркера внеклеточного секретируемого фактора роста [70] и фактора транскрипции FOSL1 [71], активирующего специфический генная платформа и, в частности, запускает синтез MMP9, что приводит к реорганизации внеклеточного матрикса. IGF / IGFBP5 является компонентом сигнальных каскадов FOXO, mTOR и MAPK / ERK, FOSL1 входит в систему сигнальных путей mTOR и MAPK / ERK [72].Оба фактора ответственны за активацию генной сети, характеризующей раковые свойства клетки. Активность онтологической пары определяет клеточную инвазию путем ремоделирования структур внеклеточного матрикса, что является одной из характеристик TISC. В клетках этого типа активированные гены связаны с такими биологическими функциями, как множественная лекарственная устойчивость, метаболизм жиров, ангиогенез, пролиферация, транспорт, ответ на воспаление, продукция цитокинов, клеточный цикл и передача сигнала.Наблюдается подавление экспрессии генов, участвующих в развитии органов, ответ на гипоксию, фиксацию нуклеотидов, трансляцию и удлинение, а также гемотаксис.

Транскриптом SP OCC (боковая популяционная клетка из линии клеток рака яичника) описан в [12]. В этот список включены транскрипты 5 основных секретируемых факторов, которые участвуют в биологических клеточных процессах, определяющих раковые свойства клеток. Это LTBP1 , LIF , NRG1 , HB-EGF , IL6 .Транскрипция этих генов предполагает активное состояние таких сигнальных путей, как PI3K / AKT [73], CSF1 [74], AKT / mTOR [75], TGFβ1 [76]. Кроме того, свидетельством активности сигнальных каскадов VEGF, EGF, WNT является экспрессия генов соответствующих рецепторов NRP2 [77], EGFR [78], FZD5, 7, 8 [79–82]. Именно рецепторы FZD необходимы для поддержания плюрипотентного состояния клеток. Кроме того, в списке генов присутствуют факторы транскрипции, связанные функциональными связями с секретируемыми молекулами.Идентифицированы факторы транскрипции NFRB, TLE, NFAT5, RA \ UNX, NKX3.1, NR4a2, которые являются активными молекулами FOXO-, ERK-, MAPK-, WNT-зависимых сигнальных путей. Присутствует фактор транскрипции PLAGL2, выраженный супрессор дифференцировки стволовых клеток и глиальных клеток стволового рака. В то же время PLAGL2 определяет их способность к самообновлению, выражающуюся посредством модуляции WNT / catenin-зависимого сигнального пути [83]. Также было показано, что набор генов, характеризующих активность каскада NOTCH, находится на высоком уровне экспрессии.Активность этого сигнального пути также определяет способность к самообновлению как одну из характеристик стволовости этого типа клеток. Таким образом, триггерные секретируемые молекулы и факторы транскрипции под их контролем, которые определяют стволовые и раковые свойства клеток, также присутствуют в транскриптоме SP OCC.

В общей сложности гены были кластеризованы, характерные для таких биологических процессов, как клеточный цикл, апоптоз, пролиферация, транспорт, трансдукция сигнала, транскрипция и трансляция, метаболизм и модификация белка в анализируемых типах клеток.Такой набор действий характеризует высокую метаболическую активность клеток, что является характерной чертой раковых клеток.

Бирни и его коллеги оценили профиль экспрессии стволовых и раковых клеток при раке простаты человека [84]. Несмотря на небольшое количество охарактеризованных генов, в полученном транскриптоме также идентифицируются секретируемые триггерные молекулы и онтологические факторы транскрипции, определяющие активацию конкретных генных платформ. Секретируемые факторы представлены генами WNT5A, IL6, CSF2, IFNK u IFNGR / 1 и PAPPA [85–88].В этот список входят два фактора транскрипции STAT1 и NFKB1 и модулятор многих факторов транскрипции BTG1 [89–91]. Между факторами прослеживаются следующие онтологические функциональные связи. Секретируемые цитокины IL6, IFNK и IFNGR / 1 активируют два основных сигнальных пути JAK / STAT и MAPK и связаны с классическим онтологическим партнером STAT1. Фосфорилирование STAT1 сопровождается транскрипцией платформы IF / IL6-индуцированных генов, что характеризует развитие иммунного ответа.Кроме того, активация JAK / STAT и MAPK приводит к активации генов, связанных с метастазированием, апоптозом и пролиферацией, что указывает на участие онтологической группы в функционировании раковой клетки [86, 88, 89, 92, 93]. PAPPA и WNT5 связаны с фактором транскрипции NFKB1 онтологическими связями. Паракринная активация NFKB-зависимого сигнального пути может сопровождаться как иммунным ответом (WNT5 [60]), так и изменениями сигнальных каскадов, определяющих выживаемость клетки и поддержание стабильности ее генома (PAPPA [87]).WNT5, как триггерный фактор, напрямую активирует WNT-зависимый сигнальный путь, определяющий одно из основных свойств стволовых клеток — несимметричное деление. CSF2 – GM-CSF — один из факторов, необходимых для пролиферации, дифференцировки и выживания макрофагов и гранулоцитов. Кроме того, было продемонстрировано его участие в раннем развитии эмбриона в поддержании беременности [94–96], что может характеризовать стволовые свойства раковых клеток рака простаты человека.CSF2 активирует AKT1-, ERK1 / 2-, mTOR-, но не JAK / STAT-зависимые сигнальные каскады, которые, как упоминалось ранее, активны во многих раковых стволовых клетках. Таким образом, анализ транскриптома раковых стволовых клеток рака простаты человека согласуется с идеей, что раковые стволовые клетки экспрессируются небольшим набором триггерных молекул и факторами транскрипции, связанными с ними функциональными связями, которые поддерживают и защищают их стволовые и раковые свойства от воздействия окружающих факторов.

Комбинированный анализ в системе KEGG указывает на активность кластеров генов, определяющих подвижность стволовых клеток рака простаты человека. Выявлена ​​группа генов очаговой адгезии и гены, кодирующие белки, разрушающие матрикс-рецепторное взаимодействие.

Используя модель ортотопической мыши, был проанализирован профиль экспрессии генов TISC, выделенных из клеточных линий остеосаркомы человека [10]. Следующие секретируемые триггерные молекулы IGF1, IHH и факторы транскрипции NFIX, NFYB, SPI1, TFDB1 были идентифицированы в полученном профиле экспрессии.Все эти факторы объединены в один регуляторный кластер, в котором определяется как стволовость, так и «раковые» свойства клеток. IGF1-IGFR1 необходим для экспрессии IHH, члена семейства HH генов млекопитающих. IGF-зависимый сигнальный путь модулирует экспрессию IHH , что приводит к контролю над пролиферацией клеток, выживанием, дифференцировкой и продуцированием матрикса в ростовой пластине в ходе постнатального развития [97].В то же время IHH связан с WNT-зависимым сигнальным каскадом и активирует его, снижая уровень антагонистов WNT (LRP, SFRP -) [98, 99]. Аномальная активация IHH-зависимого сигнального пути из-за повышенной экспрессии IGF приводит к дефектам развития и трансформации стволовых клеток в TISC, что приводит к развитию рака. IGF-зависимый сигнальный путь является компонентом FOXO-, mTOR- и MAPK-зависимых сигнальных каскадов, нарушение активности которых также приводит к канцерогенной трансформации стволовых клеток.Таким образом, аномальная экспрессия двух триггерных молекул IGF / IHH может быть одной из причин развития рака и поддержания раковых свойств TISC [99, 100].

Установлены онтологические взаимодействия между анализируемыми факторами транскрипции. SPI1 (PU.1) — ключевой регулятор кроветворения. Снижение экспрессии этого фактора транскрипции приводит к развитию острого миелоидного лейкоза [101]. Функционально он связан с IHH. Совместная экспрессия SPI1 и IHH приводит к появлению самообновляющихся клеток-предшественников лейкемического рака, эритроидных предшественников инфицированных вирусами с последующим возникновением лейкемии [102].E2F1 индуцирует экспрессию NFYB, который вместе с E2F1 регулирует экспрессию многих генов-мишеней. Чрезмерная экспрессия этих генов обнаруживается при остеосаркоме и связана с нечувствительностью к химиотерапии. Комплекс NFYB / E2F1 связывается с FOXO1 / 3 и является фактором FOXO-зависимого сигнального каскада, который активируется в клетках различных видов рака [103]. Другой фактор транскрипции, NFIX, также физически взаимодействует с FOXA1 и регулирует функционирование и выживание гемопоэтических стволовых клеток, а также находится в цепи передачи сигнала FOXO-зависимого сигнального каскада [104, 105].Фактор транскрипции TFDP1 необходим для контроля производительности клеточного цикла и экспрессии генов-мишеней. GATA1 и TAL1 регулируют экспрессию TFDP1 . Амплификация этого гена приводит к нарушению регуляции клеточного цикла и развитию рака [106, 107]. Таким образом, онтологическая пара SPI1 и IHH управляет основным свойством ЦПТИ — самообновлением. Комплекс факторов транскрипции NFYB / E2F1-FOXO1 / 3-NFIX и фактора транскрипции TFDP1 регулирует такие свойства TISC, как аберрантная пролиферация, лекарственная устойчивость и выживаемость.Комбинированное сравнение в системе KEGG показывает, что гены стволовых клеток остеосаркомы человека сгруппированы в группы, характерные для двух биологических процессов: развития костей скелета и подвижности (миграции). Не было обнаружено значимых различий в экспрессии известных маркеров стволовых клеток эмбриона Oct / Nanog .

Проведенный анализ 5 транскриптомов раковых стволовых клеток показывает, что 1) генетические платформы различных типов раковых стволовых клеток различаются; 2) отсутствует одинаково пропорциональная одновременная экспрессия всех генов определенного сигнального пути; 3) TISC аутокринно контролирует постоянство своих стволовых и раковых свойств, поддерживая постоянно высокий уровень экспрессии секретируемых триггерных молекул, которые поддерживают постоянный внеклеточный триггерный сигнал.Высокая экспрессия специфических факторов транскрипции онтологических партнеров триггерных молекул обеспечивает обязательную активацию строго определенной генной платформы, которая формирует специфические свойства TISC.

Вывод из проведенного анализа заключается в том, что для того, чтобы разрушить основные свойства раковых стволовых клеток, необходимо немедленно и одновременно удалить секретируемую часть триггерных молекул и их онтологических партнеров по транскрипции и остановить экспрессию. генов всех участников проявленных факторов, определяющих «стволовые» и «раковые» особенности этого типа ЦПТИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение асцитных клеток Krebs-2, интернализующих ДНК, меченную TAMRA

Alu -TAMRA ДНК представляет собой фрагмент длиной 500 п.н. повтора Alu человека, меченного dUTP-5′-TAMRA с помощью ПЦР [ 16]. Клетки Krebs-2 инкубировали с ДНК Alu -TAMRA (0,5 мкг на 1 миллион клеток в 200 мкл среды RPMI-1640) в течение 1 часа при комнатной температуре. Разделение субпопуляций TAMRA + и TAMRA– выполняли на сортировщике клеток BD FACSAria, оснащенном насадкой 100 мкм, при частоте событий от 2000 до 3500 клеток.Для обнаружения флуоресценции TAMRA использовались лазер 488 нм и канал 585/42 (также известный как канал PE).

Было использовано несколько раундов сортировки клеток на основе проточной цитометрии для получения достаточного количества клеток TAMRA +. Из-за низкого содержания клеток TAMRA + в общей популяции Krebs-2 (обычно ниже 5%) выделение разумного количества чистых клеток TAMRA + было практически невозможно. Наилучший результат, которого нам удалось достичь, — это 80% клеток TAMRA + после прохода сортировки. Многократная повторная сортировка клеток привела к резкому снижению жизнеспособности клеток.Таким образом, наша популяция, впоследствии названная «TAMRA + клетки», состоит из 60–70% клеток TAMRA + и 30–40% клеток TAMRA–. В отличие от клеток TAMRA +, чистая субпопуляция TAMRA– была практически неограниченной.

После сортировки микроскопический анализ процентного содержания клеток TAMRA + выполняли с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 780 NLO (Carl Zeiss, США) в Центре коллективного пользования микроскопией биологических объектов Сибирского отделения Российской академии наук.

Выделение РНК и RNAseq

Суммарную РНК из клеток TAMRA + и TAMRA– выделяли с использованием набора Qiagen RNeasy.Библиотеки были созданы с использованием набора для подготовки образцов РНК Illumina TruSeq, v.2. Библиотеки загружали на Illumina Hiseq2000 с использованием реагентов Truseq v.3. После секвенирования чтения были отсортированы по их индексам с помощью CASAVA 1.8.2. программный комплекс (лаборатория эволюционной геномики кафедры биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва). Два независимых повтора секвенирования ДНК дали 2 миллиона считываний парных концов по 70 п.н. каждое, которые были обработаны как считывания с одного конца для целей картирования.

Анализ считываний и программное обеспечение

Полученные считывания были вырезаны из последовательностей адаптеров с помощью инструмента Trimmomatic из лаборатории Usadel (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) и затем сопоставлены с мышиными хромосомами ( доступно на сайте UCSC Genome Bioinformatics: http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/chromosomes/). В качестве инструмента картографирования использовалось программное обеспечение Softberry’s ReadsMap (Softberry.Inc) [108]. Уникальной особенностью этого инструмента является то, что он сопоставляет определенное чтение с соответствующим контигом (в нашем случае — хромосомой) путем выбора наилучшего выравнивания из пула найденных.В сочетании с другой уникальной функцией, которая позволила нам определять сайты склейки с высокой точностью и тем самым резко минимизировать количество считываемых «хвостов», несоответствующих интронам (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=readsmap- i & group = help & subgroup = pipelines и http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=rnaseq), инструмент ReadsMap создает точные профили сопоставления, которые отражают реальное количество чтений, выровненных с данной позицией в геноме, и фактически можно рассматривать как относящийся к уровню экспрессии гена.Обрезанные считывания доступны в Европейском нуклеотидном архиве (ENA) (http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB15164).

Счетчики считывания были сглажены и масштабированы по логарифму 2 для облегчения визуального анализа генов, имеющих чрезвычайно высокие различия экспрессии (в 10 раз и более). В качестве инструмента визуализации для сравнения профилей и проверки их соответствия аннотированным генам (KnownGenes доступны на сайте UCSC Genome Bioinformatics: http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/database/), программа Softberry’s Sequence Explorer v.2.2.18 (http://www.softberry.com/).

Выбор праймера qPCR

Асцитные опухолевые клетки Krebs-2 были разделены на субпопуляции TAMRA + и TAMRA– и была выделена РНК. КДНК синтезировали для каждой группы с использованием системы обратной транскрипции GoScript (Promega, США). Для каждого гена была выбрана пара праймеров, которая соответствовала области (экзону) наивысшей плотности считывания. Праймеры тестировали на специфичность с использованием общей кДНК Krebs-2 в качестве матрицы.КПЦР в реальном времени выполняли на приборе Applied Biosystems с использованием реагента SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, США) в трех повторностях. Ген β-актина мыши использовали в качестве эталона.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаем благодарность нашим коллегам из лаборатории эволюционной геномики факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ, Москва, за выполнение RNAseq.

Авторы выражают благодарность Татьяне Падве за перевод статьи и Андрею Горчакову за умные критические замечания.

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

ПОДДЕРЖКА ГРАНТА

Работа выполнена при финансовой поддержке ООО «БА-фарма», ООО «Панаген», гранта РФФИ № 15-04-03386 / 16 и Государственного научного проекта № 0324-2015-0003.

ССЫЛКИ

1. Лапидот Т., Сирард С., Формор Дж., Мердок Б., Хоанг Т., Касерес-Кортес Дж., Минден М., Патерсон Б., Калиджури М.А., Дик Дж. Э. Клетка, инициирующая острый миелоидный лейкоз человека после трансплантации мышам SCID.Природа. 1994; 367: 645–648.

2. Bonnet D, Dick JE. Острый миелоидный лейкоз человека организован в виде иерархии, происходящей от примитивной гемопоэтической клетки. Nat Med. 1997; 3: 730–737.

3. Gröger CJ, Grubinger M, Waldhör T., Vierlinger K, Mikulits W. Мета-анализ сигнатур экспрессии генов, определяющих переход эпителия в мезенхиму во время прогрессирования рака. PLoS One. 2012; 7: e51136.

4. Фрисан Т., Левицкий В., Масуччи М. Анализ предельных разведений. Методы Мол биол.2001; 174: 213–216.

5. Раджасекхар В.К. Аналитические методы раковых стволовых клеток. Методы Мол биол. 2007; 407: 83–95.

6. O’Brien CA, Kreso A, Jamieson CH. Раковые стволовые клетки и самообновление. Clin Cancer Res. 2010; 16: 3113–3120.

7. Ху Й., Смит Г.К. ELDA: анализ предельного разведения для сравнения истощенных и обогащенных популяций в стволовых клетках и других анализах. J Immunol Methods. 2009; 347: 70–78.

8. Цао Л., Чжоу Ю., Чжай Б., Ляо Дж., Сюй В., Чжан Р., Ли Дж., Чжан Ю., Чен Л., Цянь Х., У М., Инь З.Субпопуляции сферообразующих клеток со свойствами раковых стволовых клеток в клеточных линиях гепатомы человека. BMC Gastroenterol. 2011; 11:71.

9. Хо Д.В., Ян Ц.Ф., Йи К., Лам CT, Нг МН, Ю В.К., Лау Дж., Ван Т., Ван Х, Янь З., Лю Х., Чжан И, Фань С.Т. Профилирование экспрессии генов стволовых клеток рака печени с помощью секвенирования РНК. PLoS One. 2012; 7: e37159.

10. Райнуссо Н., Ман Т.К., Лау С.К., Хикс Дж., Шен Дж.Дж., Ю А., Ван Л.Л., Розен Дж.М. Идентификация и профили экспрессии генов опухолевых клеток, выделенных из линий клеток остеосаркомы человека, на модели ортотопических мышей.Cancer Biol Ther. 2011; 12: 278–287.

11. Ван Х., Хуанг М., Чжан Д. Ю., Чжан Ф. Глобальное профилирование сигнальных сетей: исследование стволовых клеток рака груди и потенциальной регуляции. Онколог. 2011; 16: 966–979.

12. Ватипадекал В., Саксена Д., Мок С.К., Хаушка П.В., Озбун Л., Биррер М.Дж. Идентификация профиля потенциальной экспрессии генов стволовых клеток рака яичников из папиллярно-серозного рака яичников на поздней стадии. PLoS One. 2012; 7: e29079.

13. Карими-Бушери Ф, Задорожный В, Перевозчик Е, Фахрай Х.Молекулярная целостность и глобальная экспрессия генов стволовых клеток рака груди и легких при длительном хранении и восстановлении. Банк клеточной ткани. 2013; 14: 175–186.

14. Панг Л.Й., Гейтенби Е.Л., Камида А., Уайтлоу Б.А., Хапп Т.Р., Аргайл Д.Д. Глобальный анализ экспрессии генов стволовых клеток остеосаркомы собак показывает новую роль ЦОГ-2 в инициации опухоли. PLoS One. 2014; 9: e83144.

15. Закария Н., Юсофф Н.М., Закария З., Лим М.Н., Бахруддин П.Дж., Факируддин К.С., Яхая Б. Немелкоклеточный рак легкого человека экспрессирует предполагаемые маркеры раковых стволовых клеток и демонстрирует транскриптомный профиль мультипотентных клеток.BMC Рак. 2015; 15:84.

16. Долгова Е.В., Алямкина Е.А., Ефремов Ю.Р., Николин В.П., Попова Н.А., Тыринова Т.В., Козель А.В., Минкевич А.М., Андрушкевич О.М., Завьялов Е.Л., Ромащенко А.В., Байбородин С.И., Таранов О.С. и др. Идентификация раковых стволовых клеток и стратегия их устранения. Cancer Biol Ther. 2014; 15: 1378–1394.

17. Долгова Е.В., Ефремов Ю.Р., Орищенко К.Е., Андрушкевич О.М., Алямкина Е.А., Проскурина А.С., Байбородин С.И., Николин В.П., Попова Н.А., Черных Е.Р., Останин А.А., Таранов О.С., Омигов В.В. и др.Доставка и процессинг экзогенной двухцепочечной ДНК в гематопоэтических клетках-предшественниках CD34 + мыши и изменения их клеточного цикла при комбинированной обработке циклофосфамидом и двухцепочечной ДНК. Ген. 2013; 528: 74–83.

18. Долгова Е.В., Гончар Е.А., Проскурина А.С., Минкевич А.М., Черныч Е.Р., Останин А.А., Ефремов Ю.Р., Байбородин С.И., Николин В.П., Попова Н.А., Колчанов Н.А., Богачев С.С. Свойства факторов интернализации, способствующих захвату внеклеточной ДНК в инициирующие опухоль стволовые клетки линии клеток мыши Krebs-2.Stem Cell Res Ther. 2016; 7:76.

19. Долгова Е.В., Проскурина А.С., Николин В.П., Попова Н.А., Алямкина Е.А., Орищенко К.Е., Рогачев В.А., Ефремов Ю.Р., Дубатолова Т.Д., Прокопенко А.В., Черных Е.Р., Останин А.А., Таранов О.С. и др. Феномен «отсроченной смерти»: синергетическое действие циклофосфамида и экзогенной ДНК. Ген. 2012; 495: 134–145.

20. Гончар Е.А., Долгова Е.В., Проскурина А.С., Минкевич А.М., Ефремов Ю.Р., Таранов О.С., Омигов В.В., Николин В.П., Попова Н.А., Байбородин С.И., Останин А.А., Черных Е.Р., Колчанов Н.А. и др.Стратегия искоренения развитого асцита Кребса-2 у мышей. Oncotarget. 2016; 7: 11580–11594. DOI: 10.18632 / oncotarget.7311.

21. Тайпале Дж., Бичи, Пенсильвания. Сигнальные пути Hedgehog и Wnt при раке. Природа. 2001; 411: 349–354.

22. Торговец А.А., Мацуи В. Нацеливание на ежа — путь раковых стволовых клеток. Clin Cancer Res. 2010; 16: 3130–3140.

23. Уилсон Ч.В., Чуанг, PT. Механизм и эволюция цитозольной передачи сигнала Hedgehog. Разработка. 2010; 137: 2079–2094.

24. Райан К.Э., Чанг С. Секреция ежа и передача сигналов у позвоночных. J Biol Chem. 2012; 287: 17905–17913.

25. Pez F, Lopez A, Kim M, Wands JR, Caron de Fromentel C, Merle P. Передача сигналов Wnt и гепатоканцерогенез: молекулярные мишени для разработки инновационных противораковых препаратов. J Hepatol. 2013; 59: 1107–1117.

26. Morell CM, Strazzabosco M. Передача сигналов Notch и новые терапевтические возможности при заболеваниях печени. J Hepatol. 2014; 60: 885–890.

27.Purro SA, Galli S, Salinas PC. Дисфункция передачи сигналов Wnt и разборка синапсов при нейродегенеративных заболеваниях. J Mol Cell Biol. 2014; 6: 75–80.

28. Khillan JS. Витамин А / ретинол и поддержание плюрипотентности стволовых клеток. Питательные вещества. 2014; 6: 1209–1222.

29. Элисон М.Р., Лин В.Р., Лим С.М., Николсон Л.Дж. Раковые стволовые клетки: на линии огня. Лечение рака Rev.2012; 38: 589–598.

30. Baccelli I, Trumpp A. Развивающаяся концепция рака и стволовых клеток с метастазами.J Cell Biol. 2012; 198: 281–293.

31. Peitzsch C, Kurth I, Kunz-Schughart L, Baumann M, Dubrovska A. Открытие детерминант радиорезистентности, связанных с раковыми стволовыми клетками. Радиотренажер Oncol. 2013; 108: 378–387.

32. Павелич С.К., Седич М., Босняк Х., Спавенти С., Павелич К. Метастаз: новые взгляды на старую проблему. Молочный рак. 2011; 10:22.

33. Валастян С., Вайнберг Р.А. Метастазирование опухоли: молекулярные взгляды и развивающиеся парадигмы. Клетка. 2011; 147: 275–292.

34.Ван Л., Пантел К., Кан Ю. Метастазирование опухоли: внедрение новых биологических представлений в клинику. Nat Med. 2013; 19: 1450–1464.

35. Кьяруги П. Убегание, движение навстречу, следование по пути, протискивание: множество возможностей для перемещения ячеек. Сигнал сотовой связи. 2010; 8:25.

36. Cieślik M, Hoang SA, Baranova N, Chodaparambil S, Kumar M, Allison DF, Xu X, Wamsley JJ, Gray L, Jones DR, Mayo MW, Bekiranov S. Эпигенетическая координация сигнальных путей во время эпителиально-мезенхимальных переход.Эпигенетика хроматина. 2013; 6:28.

37. Цай Дж. Х., Ян Дж. Эпителиально-мезенхимальная пластичность при метастазах карциномы. Genes Dev. 2013; 27: 2192–2206.

38. Венков С., Плиет Д., Ни Т., Кармакер А., Биан А., Джордж А.Л. младший, Нилсон Э.Г. Транскрипционные сети при эпителиально-мезенхимальном переходе. PLoS One. 2011; 6: e25354.

39. Глушанкова Н.А. Изменения регуляции межклеточной адгезии при трансформации опухоли: обзор. [Статья на русском языке]. Биохимия. 2008; 73: 925–934.

40. Бережная Н.М. Роль клеток иммунитета в микросреде опухоли. I. Цитокиновые клетки — участники воспаления. [Статья на русском языке]. Онкология. 2009; 11: 86–91.

41. Маеда С., Йошида Х., Мицуно Й., Хирата Й., Огура К., Ширатори Й., Омата М. Анализ апоптотических и антиапоптотических сигнальных путей, индуцированных Helicobacter pylori. Mol Pathol. 2002; 55: 286–293.

42. Аль-Харби С., Хилл Б.Т., Мазумдер С., Сингх К., Девеккио Дж., Чоудхари Дж., Рыбицки Л.А., Калайчио М., Мацеевски Дж. П., Хоутон Дж. А., Алмасан А.Индекс экспрессии семейства антиапоптотических BCL-2 предсказывает ответ хронического лимфолейкоза на ABT-737. Кровь. 2011; 118: 3579–3590.

43. Gross KL, Oakley RH, Scoltock AB, Jewell CM, Cidlowski JA. Селективная регуляция антиапоптотических генов в клетках остеосаркомы: новый механизм устойчивости к глюкокортикоидам. Мол Эндокринол. 2011; 25: 1087–1099.

44. Halder UC, Bhowmick R, Roy Mukherjee T., Nayak MK, Chawla-Sarkar M. Фосфорилирование приводит в действие апоптотический белок, чтобы активировать антиапоптотические гены: парадигма функции белка матрицы 1 гриппа A.J Biol Chem. 2013; 288: 14554–14568.

45. Холохан С., Ван Шейбрук С., Лонгли Д. Б., Джонстон П. Г.. Устойчивость к лекарствам от рака: развивающаяся парадигма. Nat Rev Рак. 2013; 13: 714–726.

46. Januchowski R, Wojtowicz K, Zabel M. Роль альдегиддегидрогеназы (ALDH) в лекарственной устойчивости рака. Biomed Pharmacother. 2013; 67: 669–680.

47. Хаусман Г., Байлер С., Хирбот С., Лапинска К., Лонгакр М., Снайдер Н., Саркар С. Лекарственная устойчивость при раке: обзор. Раки (Базель).2014; 6: 1769–1792.

48. Чжан Ю.К., Ван Ю.Дж., Гупта П., Чен З.С. Белки с множественной лекарственной устойчивостью (MRP) и терапия рака. AAPS J. 2015; 17: 802–812.

49. Ставровсская А.А., Стромская ТП. Транспортные белки семейства ABC при множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток человека. [Статья на русском языке]. Биохимия. 2008; 73: 735–750.

50. Сюй П.П., Сабатини Д.М. Метаболизм раковых клеток: Варбург и другие. Клетка. 2008; 134: 703–707.

51. Павлидес С., Уитакер-Менезес Д., Кастелло-Крос Р., Фломенберг Н., Виткевич А.К., Франк П.Г., Казимиро М.С., Ван С., Фортина П., Аддя С., Пестелл Р.Г., Мартинес-Аутскорн Ю.Э., Сотгия Ф. al.Обратный эффект Варбурга: аэробный гликолиз в связанных с раком фибробластах и ​​строме опухоли. Клеточный цикл. 2009; 8: 3984–4001.

52. Бонучелли Дж., Уитакер-Менезес Д., Кастелло-Крос Р., Павлидес С., Пестелл Р. Г., Фататис А., Виткевич А. К., Вандер Хайден М. Г., Миньеко Дж., Кьяварина Б., Франк П. Г., Капоцца Ф, Фломенберг Н. и др. . Обратный эффект Варбурга: ингибиторы гликолиза предотвращают опухолевые эффекты связанных с раком фибробластов с дефицитом кавеолина-1. Клеточный цикл. 2010; 9: 1960–1971.

53. Алесси Д.Р., Дик М., Касамайор А., Кодвелл Ф. Б., Моррис Н., Норман Д. Г., Гаффни П., Риз С. Б., МакДугал С. Н., Харбисон Д., Эшворт А., Баунс М. 3-фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа-1 ( PDK1): структурная и функциональная гомология с киназой Drosophila DSTPK61. Curr Biol. 1997; 7: 776–89.

54. Алесси Д.Р., Козловски М.Т., Венг К.П., Моррис Н., Авруч Дж. 3-фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа 1 (PDK1) фосфорилирует и активирует киназу p70 S6 in vivo и in vitro .Curr Biol. 1998; 8: 69–81.

55. Ле Гуд Дж. А., Циглер В. Х., Парех Д. Б., Алесси Д. Р., Коэн П., Паркер П. Дж. Изотипы протеинкиназы C контролируются фосфоинозитид-3-киназой через протеинкиназу PDK1. Наука. 1998; 281: 2042–2045.

56. Джинеш Г.Г., Чой В., Шах Дж.Б., Ли Е.К., Уиллис Д.Л., Камат А.М. Блеббишилдс, программа экстренной помощи для раковых стволовых клеток: образование сфер и туморогенез после апоптоза. Смерть клетки отличается. 2013; 20: 382–395.

57. Fu H, Kesari S, Cai J.Tcf7l2 строго контролируется во время образования миелина. Cell Mol Neurobiol. 2012; 32: 345–352.

58. Сайто-Диаз К., Чен Т.В., Ван Х, Торн К.А., Уоллес Х.А., Пейдж-Маккоу А., Ли Э. Принцип работы Wnt: компоненты и механизм. Факторы роста. 2013; 31: 1–31.

59. Чжао Ц., Дэн И, Лю Л., Ю К., Чжан Л., Ван Х, Хе Х, Ван Дж, Лю Ц., Ву Л.Н., Вэн Ц., Мао М., Ли Дж. И др. Двойное регуляторное переключение посредством взаимодействий Tcf7l2 / Tcf4 со специфическими для стадии партнерами способствует созреванию олигодендроглии.Nat Commun. 2016; 7: 10883.

60. Zhao Y, Wang CL, Li RM, Hui TQ, Su YY, Yuan Q, Zhou XD, Ye L. Wnt5a способствует воспалительным ответам посредством ядерного фактора κB (NF-κB) и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) пути в клетках пульпы зуба человека. J Biol Chem. 2014; 289: 21028–21039.

61. Черч Д. Н., Филлипс Б. Р., Стаки Д. Д., Барнс Д. Д., Буффа ФМ, Манек С., Кларк К., Харрис А. Л., Картер Е. Д., Хассан А. Б.. Зависимость от лиганда Igf2 фенотипов развития Pten (+/-) и опухолевых фенотипов у мышей.Онкоген. 2012; 31: 3635–3646.

62. Дай Дж., Бухуси М., Демьяненко Г.П., Бреннаман Л.Х., Хруска М., Дальва М.Б., Манесс П.Ф. Молекула адгезии клеток, связанных с глией нейронов (NrCAM), способствует топографическому картированию ретиноколликулов. PLoS One. 2013; 8: e73000.

63. Guillaud-Bataille M, Ragazzon B, de Reyniès A, Chevalier C, Francillard I, Barreau O, Steunou V, Guillemot J, Tissier F, Rizk-Rabin M, René-Corail F, Al Ghuzlan A, Assié G , и другие. IGF2 способствует росту клеток карциномы коры надпочечников, но его сверхэкспрессия не изменяет фенотипические и молекулярные характеристики карциномы коры надпочечников.PLoS One. 2014; 9: e103744.

64. Ян Ц., Роббинс PD. Роль экзосом опухолевого происхождения в патогенезе рака. Clin Dev Immunol. 2011; 2011: 842849.

65. Camussi G, Deregibus MC, Cantaluppi V. Роль микровезикул, полученных из стволовых клеток, в паракринном действии стволовых клеток. Biochem Soc Trans. 2013; 41: 283–287.

66. Абд Эльмагид З.Й., Ян Й., Томас Р., Ранджан М., Мондал Д., Мороз К., Фанг З., Резк Б.М., Мопарти К., Сикка С.К., Сартор О., Абдель-Магид А.Б. Неопластическое перепрограммирование полученных от пациента жировых стволовых клеток экзосомами, связанными с раком простаты.Стволовые клетки. 2014; 32: 983–997.

67. Ян З.Дж., Векслер-Рейя Р.Дж. Убейте их там, где они живут: нацелившись на нишу раковых стволовых клеток. Раковая клетка. 2007; 11: 3–5.

68. McDermott SP, Wicha MS. Стволовые клетки рака груди. Мол Онкол. 2010; 4: 404–419.

69. Инсан М.Б., Джайтак В. Новые подходы к нацеливанию на раковые стволовые клетки: текущий сценарий. Mini Rev Med Chem. 2014; 14: 20–34.

70. Güllü G, Karabulut S, Akkiprik M. Функциональные роли и клинические значения белка-5, связывающего инсулиноподобный фактор роста, при различных типах рака.Подбородок Дж. Рак. 2012; 31: 266–280.

71. Кент Л.Н., Руми М.А., Кубота К., Ли Д.С., Соарес М.Дж. FOSL1 является неотъемлемой частью взаимодействия матери и плода. Mol Cell Biol. 2011; 31: 4801–4813.

72. Бенавидес-Серрато А., Андерсон Л., Холмс Б., Клонингер С., Артиниан Н., Башир Т., Гера Дж. MTORC2 модулирует обратную регуляцию активности p38 MAPK через DUSP10 / MKP5, обеспечивая дифференциальные ответы на PP242 в глиобластоме. Гены рака. 2014; 5: 393–406. DOI: 10.18632 / genesandcancer.41.

73.Liang X, Ding Y, Zhang Y, Chai YH, He J, Chiu SM, Gao F, Tse HF, Lian Q. Активация передачи сигналов NRG1-ERBB4 потенцирует опосредованное мезенхимальными стволовыми клетками восстановление миокарда после инфаркта миокарда. Cell Death Dis. 2015; 6: e1765.

74. Чжоу З.Н., Шарма В.П., Бити Б.Т., Ро-Джонсон М., Петерсон Е.А., Ван Ройен Н., Кенни П.А., Уайли Х.С., Кондилис Дж. С., Сегал Дж. Э.. Аутокринная экспрессия HBEGF способствует интравазации рака груди, метастазированию и макрофагально-независимой инвазии in vivo .Онкоген. 2014; 33: 3784–3793.

75. Li X, Yang Q, Yu H, Wu L, Zhao Y, Zhang C, Yue X, Liu Z, Wu H, Haffty BG, Feng Z, Hu W. LIF способствует онкогенезу и метастазированию рака груди через Путь AKT-mTOR. Oncotarget. 2014; 5: 788–801. DOI: 10.18632 / oncotarget.1772.

76. Ge G, Greenspan DS. BMP1 контролирует активацию TGFbeta1 посредством расщепления латентного TGFbeta-связывающего белка. J Cell Biol. 2006; 175: 111–20.

77. Гоэль Х.Л., Чанг С., Пурселл Б., Лив I, Лайл С., Си Х.С., Шей С.К., Адисетийо Х., Рой-Берман П., Коулман И.М., Нельсон П.С., Весселла Р.Л., Дэвис Р.Дж. и др.VEGF / нейропилин-2 регуляция Bmi-1 и последующая репрессия IGF-IR определяют новый механизм агрессивного рака простаты. Рак Discov. 2012; 2: 906–921.

78. Баумдик М., Брюггеманн Ю., Шмик М., Ксури Г., Сабет О., Дэвис Л., Чин Дж. В., Бастиаенс П. И.. EGF-зависимое изменение маршрута рециклинга везикул переключает подавление спонтанного фосфорилирования на передачу сигналов EGFR. Элиф. 2015; 4. pii: e12223.

79. Кармон К.С., Свободный DS. Взаимодействие Wnt7a с Fzd5 и обнаружение активации передачи сигналов с использованием расщепленного eGFP.Biochem Biophys Res Commun. 2008; 368: 285–291.

80. Слейтер П.Г., Рамирес В.Т., Гонсалес-Бийо К., Варела-Наллар Л., Инестроса, Северная Каролина. Рецептор Frizzled-5 участвует в нейрональной полярности и морфогенезе нейронов гиппокампа. PLoS One. 2013; 8: e78892.

81. Асад М., Вонг М.К., Тан Т.З., Чулани М., Лоу Дж., Мори С., Виршуп Д., Тиери Дж. П., Хуанг Р. Я. FZD7 управляет in vitro агрессивностью в подтипе Stem-A рака яичников посредством регуляции неканонического пути Wnt / PCP. Cell Death Dis.2014; 5: e1346.

82. Фернандес А., Хаггинс И.Дж., Перна Л., Брафман Д., Лу Д., Яо С., Гаастерланд Т., Карсон Д.А., Виллерт К. Рецептор WNT FZD7 необходим для поддержания плюрипотентного состояния эмбриональных стволовых клеток человека. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 1409–1414.

83. Чжэн Х, Ин Х, Видемейер Р., Ян Х, Куэйл С. Н., Иванова Е. В., Пайк Дж. Х., Чжан Х, Сяо И., Перри С. Р., Ху Дж., Виньямури А., Ган Б. и др. PLAGL2 регулирует передачу сигналов Wnt, препятствуя дифференцировке нервных стволовых клеток и глиом.Раковая клетка. 2010; 17: 497–509.

84. Бирни Р., Брайс С.Д., Рум С., Дюссупт В., Друп А., Ланг С.Х., Берри П.А., Хайд К.Ф., Льюис Дж.Л., Стоуэр М.Дж., Мейтленд, штат Нью-Джерси, Коллинз А.Т. Профили экспрессии генов стволовых клеток рака простаты человека выявляют провоспалительный фенотип и важность взаимодействий с внеклеточным матриксом. Genome Biol. 2008; 9: R83.

85. Сферруцци-Перри А.Н., Макферсон А.М., Робертс К.Т., Робертсон С.А. Нулевая мутация Csf2 изменяет экспрессию гена плаценты и гликогеновые клетки трофобласта, а также количество гигантских клеток у мышей.Биол Репрод. 2009; 81: 207–221.

86. Кеплер Т. Б., образец C, Худак К., Роуч Дж., Хейнс А., Уолш А., Рамсбург Е. А.. Гены интерферона рукокрылых типов I и II, полученные из следов секвенирования генома с помощью статистического сборщика семейств генов. BMC Genomics. 2010; 11: 444.

87. Энгельманн Дж. К., Аманн Т., Отт-Рётцер Б., Нютцель М., Рейндерс Ю., Рейндерс Дж., Таслер В. Е., Кристл Т., Тойфель А., Хубер К. Г., Офнер П. Дж., Спанг Р., Хеллербранд К. Причинное моделирование рака. Стромальная коммуникация идентифицирует PAPPA как новый секретируемый стромой фактор, активирующий передачу сигналов NFκB при гепатоцеллюлярной карциноме.PLoS Comput Biol. 2015; 11: e1004293.

88. Lissat A, Joerschke M, Shinde DA, Braunschweig T., Meier A, Makowska A, Bortnick R, Henneke P, Herget G, Gorr TA, Kontny U. IL6, секретируемый микросредой опухоли саркомы Юинга, дает антиапоптотические и клеточные -распространение паракринных ответов в клетках саркомы Юинга. BMC Рак. 2015; 15: 552.

89. Сислер Д.Д., Морган М., Радже В., Гранде Р.С., Дерека М., Мейер Дж., Кантвелл М., Щепанек К., Корзун В.Дж., Леснефски Е.Дж., Харрис Т.Э., Кронигер С.М., Ларнер А.С.Преобразователь сигнала и активатор транскрипции 1 (STAT1) ингибирует митохондриальный биогенез в печени и окисление жирных кислот в адипоцитах. PLoS One. 2015; 10: e0144444.

90. Тихон Э., ван Инген Шенау Д., ван Опзиланд Ф., Тирон Ф., Хугербрюгге П. М., Ван Леувен Ф. Н., Шейен Б. Целевое удаление Btg1 и Btg2 приводит к гомеотической трансформации осевого скелета. PLoS One. 2015; 10: e0131481.

91. Voce DJ, Schmitt AM, Uppal A, McNerney ME, Bernal GM, Cahill KE, Wahlstrom JS, Nassiri A, Yu X, Crawley CD, White KP, Onel K, Weichselbaum RR, et al.Nfkb1 представляет собой опухолевый супрессор, специфичный для гаплонедостаточных повреждений ДНК. Онкоген. 2015; 34: 2807–2813.

92. Krämer OH, Knauer SK, Greiner G, Jandt E, Reichardt S, Gührs KH, Stauber RH, Böhmer FD, Heinzel T. Переключатель фосфорилирования-ацетилирования регулирует передачу сигналов STAT1. Genes Dev. 2009; 23: 223–235.

93. Weidle UH, Klostermann S, Eggle D, Krüger A. Взаимодействие интерлейкина 6 / рецептора интерлейкина 6 и его роль в качестве терапевтической мишени для лечения кахексии и рака. Геномика рака. Протеомика.2010; 7: 287–302.

94. Гассон Дж. Молекулярная физиология гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Кровь. 1991; 77: 1131–1145.

95. Поллард Дж. У. Роль колониестимулирующего фактора-1 в воспроизводстве и развитии. Mol Reprod Dev. 1997; 46: 54–60; обсуждение 60–1.

96. Робертсон С.А., Сьоблом К., Джаспер М.Дж., Норман Р.Дж., Симарк РФ. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор способствует транспорту глюкозы и жизнеспособности бластомеров у мышиных доимплантационных эмбрионов.Биол Репрод. 2001; 64: 1206–1215.

97. Wang Y, Cheng Z, Elalieh HZ, Nakamura E, Nguyen MT, Mackem S, Clemens TL, Bikle DD, Chang W. Передача сигналов IGF-1R в хондроцитах модулирует развитие ростовых пластин, взаимодействуя с путем PTHrP / Ihh. J Bone Miner Res. 2011; 26: 1437–1446.

98. Чой С.В., Чон Ду, Ким Дж.А., Ли Б., Джоенг К.С., Лонг Ф., Ким Д.В. Передача сигналов Indian Hedgehog запускает деградацию белка Nkx3.2 во время созревания хондроцитов. Biochem J. 2012; 443: 789–798.

99.Madhala-Levy D, Williams VC, Hughes SM, Reshef R, Halevy O. Сотрудничество между Shh и IGF-I в продвижении миогенной пролиферации и дифференцировки через пути MAPK / ERK и PI3K / Akt требует активности Smo. J. Cell Physiol. 2012; 227: 1455–1464.

100. Уэбб А.Е., Брюнет А. Факторы транскрипции FOXO: ключевые регуляторы клеточного контроля качества. Trends Biochem Sci. 2014; 39: 159–169.

101. Длухосова М., Цурик Н., Варгова Ю., Йонасова А., Зикмунд Т., Стопка Т. Эпигенетический контроль гена SPI1 с помощью CTCF и ISWI ATPase SMARCA5.PLoS One. 2014; 9: e87448.

102. Хегде С., Хэнки П., Полсон РФ. Самообновление лейкозных стволовых клеток при эритролейкемии, вызванной вирусом Фрэнда, требует провирусной инсерционной активации Spi1 и передачи сигналов hedgehog, но не мутации p53. Стволовые клетки. 2012; 30: 121–130.

103. Myatt SS, Lam EW. Новые роли белков форкхед-бокса (Fox) в развитии рака. Обзор природы Рак. 2007; 7: 847–859.

104. Holmfeldt P, Pardieck J, Saulsberry AC, Nandakumar SK, Finkelstein D, Gray JT, Persons DA, McKinney-Freeman S.Nfix — это новый регулятор выживаемости гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников мыши. Кровь. 2013; 122: 2987–2996.

105. Grabowska MM, Elliott AD, DeGraff DJ, Anderson PD, Anumanthan G, Yamashita H, Sun Q, Friedman DB, Hachey DL, Yu X, Sheehan JH, Ahn JM, Raj GV, et al. Факторы транскрипции NFI взаимодействуют с FOXA1 для регулирования экспрессии генов, специфичных для простаты. Мол Эндокринол. 2014; 28: 949–964.

106. Melchor L, Saucedo-Cuevas LP, Muñoz-Repeto I, Rodríguez-Pinilla SM, Honrado E, Campoverde A, Palacios J, Nathanson KL, García MJ, Benítez J.Всесторонняя характеристика амплификации ДНК в 13q34 при раке груди человека показывает, что TFDP1 и CUL4A являются вероятными генами-кандидатами-мишенями. Рак молочной железы Res. 2009; 11: R86.

107. Москович М., Леду М.С., Сяо Дж., Рэмпон Г.Л., Вемула С.Р., Родригес Р.Л., Фут К.Д., Окун М.С. Дистония, лицевой дисморфизм, умственная отсталость и рак груди, связанные с дупликацией хромосомы 13q34 и сверхэкспрессией TFDP1: отчет о клиническом случае. BMC Med Genet. 2013; 14:70.

108. Энгстрём П.Г., Штейгер Т., Сипос Б., Грант Г.Р., Калес А., Рэтч Г., Гольдман Н., Хаббард Т.Дж., Харроу Дж., Гиго Р., Бертоне П.; Консорциум РГАСП.Систематическая оценка программ сплайсированного выравнивания для данных RNA-seq. Нат методы. 2013; 10: 1185–1191.

Ужасные кадры российской «тюрьмы пыток» показывают, как охранники по прозвищу «СС» избивают раздетого сокамерника, пока он кричит.

УЖАСНЫЕ новые видеозаписи показывают «бесчеловечные» условия в российских «изоляторах пыток».

Один ужасающий ролик показывает охранника по прозвищу «СС», избивающего раздетого сокамерника, когда тот кричит от боли.

5

Заключенный Важа Бочоришвили, гражданин Грузии, подвергся пыткам во время съемок и вскоре скончался Фото: East2west News

5

Еще одного заключенного раздевают и избивают сотрудники в форме Фото: East2west News

5

Один из заключенных уложен поперек стол и удары дубинкой в ​​печально известной Ярославской тюрьме ИК-1, к северу от МосквыКредит: East2west News

Во время первого ролика двух униженных заключенных раздевают до нижнего белья и приводят к офицерам в форме.

При отдельных избиениях их кладут на столы и бьют дубинками в печально известной Ярославской тюрьме ИК-1 к северу от Москвы.

Заключенный Важа Бочоришвили, гражданин Грузии, скончался вскоре после пыток.

По данным независимой газеты «Новая газета», которая раскрыла факты пыток, он был вызван на личный досмотр.

После отказа от инвазивного обыска полицейские удерживают Бочоришвили перед тем, как избить его резиновой дубинкой.

Во время ужасающей видеозаписи слышно, как он кричит «Хватит», когда он теряет сознание и падает на пол.

Пока он лежит неподвижно, охранники кричат: «Вставай! Вставай, Бочоришвили! »

Кадры датируются апрелем 2016 года, но их опубликовала «Новая газета» только сейчас.

5

Сергей Ефремов, прозванный СС за привычку бить заключенных по ушам, был причастен к пыткам Бочоришвили, по словам бывших сокамерников Фото: East2west News

5

В окружении толпы тюремщиков и в одних трусах Андрей выступает в защиту своих прав в соответствии с уголовным кодексомКредит: East2west News

После избиения Бочоришвили остался один в карцере, но у него продолжалось сильное кровотечение, сообщает «Новая газета».

Позже 9 мая его перевели в Рыбинскую больницу, но в том же месяце он скончался.

Вторую жертву зовут Андрей Иванов, но она выбрала другое имя.

Согласно «Новой газете», заключенный — мусульманин — расстроился во время обыска, когда его Коран был брошен на пол.

Окруженный толпой офицеров и в одних трусах, он утверждает, что защищает свои права в соответствии с уголовным кодексом, прежде чем его жестоко избили охранники.

Сергей Ефремов, прозванный СС за привычку бить заключенных по ушам, по словам бывших сокамерников, причастен к пыткам Бочоришвили.

Ранее он был приговорен к четырем годам лишения свободы за злоупотребление служебным положением при наказании заключенных, который позднее был сокращен до трех с половиной лет.

КАРНАВАЛЬНОЕ НАПАДЕНИЕ

Флорида Оператор колеса обозрения нападает на маму до того, как его избили в дикой природе

NIGHTMARE

Женщины, которые просыпаются ночью, в ДВА раза чаще умирают молодыми, предупреждают документы

Exclusive

ОЧИСТИТЬ НАСЛЕДНИКА

Чарльз , Уильям и Кейт проводят откровенные переговоры с Гарри во Фрогморе

ДЕНЬ КРАСНОГО ПИСЬМА

Принц Гарри написал Чарльзу «глубоко личную записку» перед похоронами Филипа

Эксклюзив

ПЕРВЫЙ НАБЕГ УБИЙЦА

Подросток, убивший ПК, признается украсть квадроцикл всего за несколько часов до трагедии

Exclusive

BRAWLER BAR BAN

Наследнице Батлина запретили посещать пабы и бары после того, как она поиграла с приятелем в ночном клубе

Кадры появились после того, как офицерам тюрьмы были вынесены условные приговоры в связи с предыдущими утверждениями о пытках на фоне утверждений о том, что власти мягко относятся к жестокости в тюрьмах.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2019 © Все права защищены. Карта сайта