2019 lada granta: LADA Granta седан — Официальный сайт LADA

Семейство Granta — Официальный сайт LADA

Granta коммерческая

от 872 000 ₽

от 8 563 ₽/мес *

коммерческие автомобили

Это оптимальное соотношение характеристик, важных для любого бизнеса

Подробнее о серии

Granta #CLUB

от 708 900 ₽

от 6 923 ₽/мес *

Специальная серия #CLUB

Для тех, кому нужно от машины что-то еще. Например, это интересный дизайн и комфорт, ставший доступнее.

Подробнее о серии

Granta лифтбек #CLUB

от 728 900 ₽

от 7 124 ₽/мес *

Специальная серия #CLUB

Для тех, кому нужно от машины что-то еще. Например, это интересный дизайн и комфорт, ставший доступнее.

Подробнее о серии

LADA Granta Cross Quest

от 771 900 ₽

от 7 557 ₽/мес *

Специальная серия quest

Для тех, кому нужно от машины что-то еще. Например, это интересный дизайн и комфорт, ставший доступнее.

Подробнее о серии

Granta коммерческая

от 872 000 ₽

от 8 563 ₽/мес *

коммерческие автомобили

Это оптимальное соотношение характеристик, важных для любого бизнеса

Подробнее о серии

Granta #CLUB

от 708 900 ₽

от 6 923 ₽/мес *

Специальная серия #CLUB

Для тех, кому нужно от машины что-то еще. Например, это интересный дизайн и комфорт, ставший доступнее.

Подробнее о серии

Granta лифтбек #CLUB

от 728 900 ₽

от 7 124 ₽/мес *

Специальная серия #CLUB

Для тех, кому нужно от машины что-то еще. Например, это интересный дизайн и комфорт, ставший доступнее.

Подробнее о серии

LADA Granta Cross Quest

от 771 900 ₽

от 7 557 ₽/мес *

Специальная серия quest

Для тех, кому нужно от машины что-то еще. Например, это интересный дизайн и комфорт, ставший доступнее.

Подробнее о серии

Granta коммерческая

от 872 000 ₽

от 8 563 ₽/мес *

коммерческие автомобили

Это оптимальное соотношение характеристик, важных для любого бизнеса

Подробнее о серии

Granta лифтбек

от 620 900 ₽

от 6 039 ₽/мес *

Динамичный стиль и обтекаемые формы — признак автомобиля со спортивным характером. Но лифтбек Granta еще и потрясающе вместителен.

Подробнее о моделиКонфигурировать

Granta универсал

от 624 900 ₽

от 6 079 ₽/мес *

«Универсал» — уже в названии заложена широта характера. И разносторонняя специализация. Конечно, с ориентацией на практичность.

Подробнее о моделиКонфигурировать

*Расчет указанного ежемесячного платежа является предварительным и подлежит уточнению перед или непосредственно при заключении договоров кредитования/страхования, носит исключительно информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями Статьи 437 ч.2 Гражданского кодекса Российской Федерации. Для получения подробной информации обращайтесь к официальным дилерам АО »АВТОВАЗ».

отзывы владельцев, плюсы и минусыLADA Granta 2022 на сайте Autospot.ru

LADA Granta Cross 1.6 MT

В восторге от машины, проехала всего 100 км, но нравится вообще всё, расход бензина, проходимость по снегу, внешний вид, вид салона, вид одометра и тахометра , сигнализацию мне поставил дилер великолепную , спас. ..

LADA Granta Cross — Лада рулит https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/4186/ В восторге от машины, проехала всего 100 км, но нравится вообще всё, расход бензина, проходимость по снегу, внешний вид, вид салона, вид одометра и тахометра , сигнализацию мне поставил дилер великолепную , спас…

Olga Fedorova

1 января 2022 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5.0 0.1 5

LADA Granta седан 1. 6 MT Standard

Весна на дворе.Белая цветовая гамма,становится грязно чёрной. Обнаружил желтые жирные размазанные очаги, непридал значения просто было неприятно. Но узнать таки пришлось позже выбирая уплотнители дверей и загля…

LADA Granta седан — Впечатления через неделю эксплуатации,ещё даже без номеров. https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/3289/ Весна на дворе.Белая цветовая гамма,становится грязно чёрной. Обнаружил желтые жирные размазанные очаги, непридал значения просто было неприятно. Но узнать таки пришлось позже выбирая уплотнители дверей и загля…

Андрей Харчевников

3 апреля 2021 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 4.3

LADA Granta Cross

Добрый день. Приобрели в декабре 2019 года в г.Туле гранту-кросс. Довольны, как подарками от авто салона, так и сейчас. Комплектация радует, особенно блютуз гарнитура и климат контроль. Это вам не просто кондици…

LADA Granta Cross — Гранта-кросс https://autospot. ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/3184/ Добрый день. Приобрели в декабре 2019 года в г.Туле гранту-кросс. Довольны, как подарками от авто салона, так и сейчас. Комплектация радует, особенно блютуз гарнитура и климат контроль. Это вам не просто кондици…

Александр Федин

22 декабря 2020 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5.0 0.1 4

LADA Granta седан 1. 6 MT Comfort

Машина нормальная. НО, приобретал автомобиль в Лермонтове 2-3 месяца назад, потеют задние фары, протекают задние стекла, жрет как мустанг, едешь и слышишь скрип высшего качества пластика, и скрип окон. А так маш…

LADA Granta седан — Гранта https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/3178/ Машина нормальная. НО, приобретал автомобиль в Лермонтове 2-3 месяца назад, потеют задние фары, протекают задние стекла, жрет как мустанг, едешь и слышишь скрип высшего качества пластика, и скрип окон. А так маш…

Георгий Кюльбякидис

16 декабря 2020 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н. в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 2.2

LADA Granta седан 1.6 MT

Всем доброго дня. Решил поделится мнением об авто лада гранта. Когда решил поменять авто долго думал какую именно друзья говорили приору бери классная, остальные калину, но как говорится на вкус и цвет товарища…

LADA Granta седан — Гранта. Чудо или накозание?! https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/3174/ Всем доброго дня. Решил поделится мнением об авто лада гранта. Когда решил поменять авто долго думал какую именно друзья говорили приору бери классная, остальные калину, но как говорится на вкус и цвет товарища…

Эдуард Заруцкий

12 декабря 2020 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 4

LADA Granta Drive Active 1.6 MT Drive Active

Взял 25 ноября 2019 г. , проблем 0, багажник огромный для седана, ездил по кочкам — как по ровной дороге, не знаю как вы, но я советую брать…

LADA Granta Drive Active — Стоит ли брать Гранту FL? https://autospot.ru/brands/lada/grantadriveactive/sedan/review/3141/ Взял 25 ноября 2019 г., проблем 0, багажник огромный для седана, ездил по кочкам — как по ровной дороге, не знаю как вы, но я советую брать…

Роман Леонтьев

4 ноября 2020 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Drive Active 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/grantadriveactive/sedan/spec/

5. 0 0.1 3.7

LADA Granta седан 1.6 MT

Не рекомендую покупать автоваз и данный сервис. Купили в декабре 2019г. Машина начала сыпаться на 5000км, на 20.000 погнуты тормозные диски, шумит сцепление, вибрация при торможении. Порвалась дверная резинка. П…

LADA Granta седан — Не покупайте #овноваз. Поберегите свои деньги и нервы https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/3105/ Не рекомендую покупать автоваз и данный сервис. Купили в декабре 2019г. Машина начала сыпаться на 5000км, на 20.000 погнуты тормозные диски, шумит сцепление, вибрация при торможении. Порвалась дверная резинка. П…

Ирина Владимировна

24 сентября 2020 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 1

LADA Granta седан

Машина за свои деньги хорошая,но коробку передач за все это время АвтоВАЗ та и не победили. Есть не приятное переключения на 2 передачу. …

LADA Granta седан — Гранта https://autospot.ru/brands/lada/granta_generation/sedan/review/2952/ Машина за свои деньги хорошая,но коробку передач за все это время АвтоВАЗ та и не победили. Есть не приятное переключения на 2 передачу….

Иван Кислов

27 февраля 2020 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2011 – 2018, I https://autospot.ru/brands/lada/granta_generation/sedan/spec/

5.0 0.1 4.3

LADA Granta седан

Мы с мужем женаты уже 11 лет. Всё это время я ездила на его машине. Он отвозил меня в салон на процедуры, в бассейн и тренажерный зал, завозил к родителям, когда я хотела их навестить. Как-то муж уехал в команди…

LADA Granta седан — Ценный подарок от любимого мужа https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/2826/ Мы с мужем женаты уже 11 лет. Всё это время я ездила на его машине. Он отвозил меня в салон на процедуры, в бассейн и тренажерный зал, завозил к родителям, когда я хотела их навестить. Как-то муж уехал в команди…

Евгения Смирнова

30 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н. в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 4.7

LADA Granta седан

Привет всем автолюбителям! Хочу поделиться впечатлениями от эксплуатации всеми известной модели – Лада Гранта. До Гранты лет 17 ездил на старенькой Тойоте Корона. Машина меня полностью устраивала: относительно…

LADA Granta седан — Лада не так проста, как кажется https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/2824/ Привет всем автолюбителям! Хочу поделиться впечатлениями от эксплуатации всеми известной модели – Лада Гранта. До Гранты лет 17 ездил на старенькой Тойоте Корона. Машина меня полностью устраивала: относительно…

Евгений Гринев

30 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 3.5

LADA Granta Cross

Многие говорят, в Lada Granta Cross ничего не поменялось. А я заявляю с уверенностью – поменялось и многое. Что действительно стало другим в этом автомобиле, так это роботизированная коробка. Получив новую проши…

LADA Granta Cross — Изменения на лицо https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/2820/ Многие говорят, в Lada Granta Cross ничего не поменялось. А я заявляю с уверенностью – поменялось и многое. Что действительно стало другим в этом автомобиле, так это роботизированная коробка. Получив новую проши…

Захар Савельев

30 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5. 0 0.1 4.3

LADA Granta Cross

Lada Granta Cross – хочу поделиться впечатлениями об интерьере и экстерьере. По всему остальному выражать свои исключительно предвзятые мысли, думаю, не имеет смысла. Данная ниша полностью себя оправдывает и реа…

LADA Granta Cross — Лада Гранта Кросс – обновленный и улучшенный универсал https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/2817/ Lada Granta Cross – хочу поделиться впечатлениями об интерьере и экстерьере. По всему остальному выражать свои исключительно предвзятые мысли, думаю, не имеет смысла. Данная ниша полностью себя оправдывает и реа…

Касьян Сорокин

30 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5.0 0.1 4.2

LADA Granta седан

К отечественному автопрому всегда относился с презрением. Считал, что наши конструкторы ничего толкового разработать не могут. Надоело слушать мнения других и решил прочувствовать на своей шкуре, что такое чудо…

LADA Granta седан — За что заплатил, то и получил https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/2814/ К отечественному автопрому всегда относился с презрением. Считал, что наши конструкторы ничего толкового разработать не могут. Надоело слушать мнения других и решил прочувствовать на своей шкуре, что такое чудо…

Леонид Волков

30 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5. 0 0.1 3.8

LADA Granta седан

К Гранте стал присматриваться несколько лет назад, когда эта марка стала реально самой продаваемой машиной. Для меня это не только признак популярности, но и прямой указатель на то, что запчастей будет много и о…

LADA Granta седан — Доступная машина https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/2773/ К Гранте стал присматриваться несколько лет назад, когда эта марка стала реально самой продаваемой машиной. Для меня это не только признак популярности, но и прямой указатель на то, что запчастей будет много и о. ..

Аркадий Субботин

28 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 4

LADA Granta Cross

Свою гранту я приобрёл всего три месяца назад, только завершил обкатку и прошёл нулевое ТО. Первые впечатления от машины очень положительные, так и хочется сказать: «Могут же, когда хотят». Во-первых, внешний ви…

LADA Granta Cross — Бюджетный семейный автомобиль https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/2555/ Свою гранту я приобрёл всего три месяца назад, только завершил обкатку и прошёл нулевое ТО. Первые впечатления от машины очень положительные, так и хочется сказать: «Могут же, когда хотят». Во-первых, внешний ви…

Николай Кузьменко

13 октября 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5.0 0.1 4. 7

LADA Granta лифтбек 1.6 MT Люкс

Кто бы что не говорил, Гранта- отличная машина, особенно лифтбек. Да, простой салон, да все в ней сделано дешево, но я на ней уже почти 100 тысяч километров откатался и меняю только расходники. Динамики в ней хв…

LADA Granta лифтбек — Отличная машина! https://autospot.ru/brands/lada/granta_generation/liftback/review/890/ Кто бы что не говорил, Гранта- отличная машина, особенно лифтбек. Да, простой салон, да все в ней сделано дешево, но я на ней уже почти 100 тысяч километров откатался и меняю только расходники. Динамики в ней хв…

Павел Н.

21 июня 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta лифтбек 2022 https://autospot.ru/brands/lada/granta_generation/liftback/spec/

5.0 0.1 4

LADA Granta лифтбек 1.6 MT Люкс

В декабре, 2 года назад, решила заменить свою Ладу Калину, на что-то более красивое. Еще отталкивалась от размера багажника и цены. Конечно, хотелось бы ездить на Лексусе или Рэндж Ровере, но, к сожалению, финан. ..

LADA Granta лифтбек — Гранта — устраивает полностью! https://autospot.ru/brands/lada/granta_generation/liftback/review/889/ В декабре, 2 года назад, решила заменить свою Ладу Калину, на что-то более красивое. Еще отталкивалась от размера багажника и цены. Конечно, хотелось бы ездить на Лексусе или Рэндж Ровере, но, к сожалению, финан…

Zhenya Kolesov

1 июня 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta лифтбек 2022 https://autospot.ru/brands/lada/granta_generation/liftback/spec/

5.0 0.1 4.3

LADA Granta Cross 1. 6 MT Comfort

В конце весны 2019 года купил Ладу Гранту Кросс в рыжем цвете Аурум. Оформлял предзаказ, поэтому одним из первых сел за руль этого красавца. Выбрал комплектацию Комфорт. Заплатил около 600 тыс. Движок 1,6 литра,…

LADA Granta Cross — Речь не о понтах https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/1991/ В конце весны 2019 года купил Ладу Гранту Кросс в рыжем цвете Аурум. Оформлял предзаказ, поэтому одним из первых сел за руль этого красавца. Выбрал комплектацию Комфорт. Заплатил около 600 тыс. Движок 1,6 литра,…

Pier Cardin

30 мая 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н. в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5.0 0.1 4.7

LADA Granta седан 1.6 MT Comfort

Автомобиль Lada Granta покупал для поездок в деревню, поэтому при выборе машины понравился тот факт, что салон очень вместительный. Комплектацию выбрал самую максимальную – Люкс. На тот момент в 2014 году она ст…

LADA Granta седан — Лада Гранта для поездок в деревню самое то https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/review/1779/ Автомобиль Lada Granta покупал для поездок в деревню, поэтому при выборе машины понравился тот факт, что салон очень вместительный. Комплектацию выбрал самую максимальную – Люкс. На тот момент в 2014 году она ст…

Олег Рязанцев

29 мая 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta седан 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot.ru/brands/lada/granta/sedan/spec/

5.0 0.1 4.3

LADA Granta Cross 1.6 RT Comfort

Долго присматривался к гранте и решил все же поверить в наш автопром. Кстати, не ошибся. Машиной полностью доволен. Пересел со старенькой иномарки, которая вымотала душу и кошелек частыми ремонтами. Стоил выбор…

LADA Granta Cross — Первые дни владения мрачные, потом ничего https://autospot.ru/brands/lada/granta_cross/wagon/review/1988/ Долго присматривался к гранте и решил все же поверить в наш автопром. Кстати, не ошибся. Машиной полностью доволен. Пересел со старенькой иномарки, которая вымотала душу и кошелек частыми ремонтами. Стоил выбор…

Максименко

24 мая 2019 г.

LADA

Granta 2022 LADA Granta Cross 2022 2018 – н.в., I Рестайлинг https://autospot. ru/brands/lada/granta_cross/wagon/spec/

5.0 0.1 5

Lada Granta 2019 — новая модель Гранты в кузове универсал, хэтчбек и кросс

АвтоВАЗ уже занимается разработкой нового поколения своей самой доступной модели, о чем сообщил президент компании Николя Мор в ходе Петербургского международного экономического форума летом 2017 года, и по некоторым данным концепт новинки могут представить уже через пару лет. Новая модель Lada Granta 2019 года примерит на себя современный вазовский Х-дизайн, а во второй генерации возможно даже будет базироваться на технической основе «Весты» или «Логана»!

Данное предположение, впрочем, вполне совпадает со стремлением отечественного автогиганта сократить количество используемых платформ до минимума, чтобы не загружать инженерный штат дополнительной работой и более рационально использовать ресурсы. Другой же вазовский автомобиль, также ожидающий кардинального обновления, внедорожник Lada 4х4 должен переехать на шасси B0 и таким образом стать техническим клоном кроссовера Renault Duster.

Известно, что в Тольятти еще некоторое время назад создавали более объемную модификацию модели Lada Granta в новом кузове универсал, причем, в Сети даже появлялись некие шпионские фотографии подобных прототипов, но официальных заявлений по поводу запуска новинки в серию не было. По всей видимости производитель ожидал 2018 года, который по слухам должен был стать последним в жизненном цикле модели-близнеца «Калины», чтобы универсал на базе новой «Гранты» 2019 модельного года смог прийти на замену «ягодному сараю». Собственно, эти предположения позже подтвердились: Kalina прекратила существование в качестве самостоятельной модели, а существующие хэтчбек и универсал, включая версию кросс, после рестайлинга влились «грантовское» семейство, которое теперь по сути состоит из пяти кузовных модификаций.

Учитывая, что решение о завершении жизненного цикла «Приоры» было принято еще раньше, «Гранта» после рестайлинга останется единственной вазовской моделью, базирующеся еще на старом «восьмерошном» шасси, берущим происхождение с начала 80-ых годов прошлого века. Как уже отмечалось выше, данная «тележка» способна продержаться на конвейере еще пару-тройку лет, пока модель не будет адаптирована под новую техническую основу.

Следует отметить, что на устаревшей переднеприводной вазовской платформе также выпускаются автомобили японской марки Datsun, и в случае отказа от этого шасси седан on-DO и хэтчбек mi-DO и вовсе могут прекратить свое и так достаточно непродолжительное существование. Другое дело — окажется ли востребованным универсал Lada Granta 2019 в новом кузове Х на шасси от «Весты», если аналогичная модель вагонной компоновки Vesta SW уже существует? Вероятно, автомобиль будет иметь несколько иную концептуальную стилистику — что-то в духе кросс-хэтчбека Xcode, однако, перспективы появления такой новой модели видятся на более поздние сроки, а именно на 2020-2021 годы.

Спортивное же исполнение перелицованной Lada Granta с приставкой Sport выйдет летом 2019 года, причем, заряженная модификация будет представлена в двух кузовах: седан и хэтчбек. Вазовская «зажигалка» получит 120-сильный двигатель, модернизированную «спортивную» подвеску и более мощные дисковые тормоза. Кроме того, тольяттинцы планируют выпустить и некое промежуточное исполнение спортивной Гранты — так называемую «подогретую» версию под названием Drive Active с доработанными под активное вождение подвеской и рулевым управлением и с особым стилистическим оформлением, но с обычными моторами мощностью 98 и 106 л.с.

Помимо новой «Лады Гранты» другими ожидаемыми новинками АвтоВАЗа на 2019 модельный год являются вседорожный седан Vesta Cross, высокий хэтчбек повышенной проходимости Xray Cross и оспортивленная версия «Иксрея» Xray Sport.

Из технических же новшеств отечественного автогиганта в перспективе планируется установка на «Весту» бесступенчатого вариатора от Nissan, а также идут переговоры с Renault о запуске в производство в Тольятти классического «автомата» с гидротрансформатором вместо слишком нерасторопного «робота». Пока же подобной 4-диапазонной автоматической трансмиссией японской фирмы Jatco комплектуются некоторые модификации «Калины» и «Гранты», а также автомобили марки Datsun. Кроме того, производитель намерен вернуться к идее установки на свои модели двигателя с турбонаддувом.

Незадолго до начала продаж обновленного и пополненного семейства «Гранты» все автомобили в кузовных модификациях седан, лифтбек, универсал, хэчтбек и кросс-универсал показали журналистам. На видео ниже представлен обзор рестайлинговой модели Lada Granta в новом кузове 2019 модельного года, подготовленный изданием «За рулем».

Как работает Black Fret — Черный лад

Black Fret основан на простом предположении, что вместе мы можем изменить ситуацию к лучшему. Любители музыки и те, кто любит свое сообщество, присоединяются к Black Fret, чтобы стать «Покровителями местной музыки». Их ежегодные членские взносы используются для финансирования наших грантов и мероприятий каждый сезон. Взносы составляют всего 750 долларов США на человека за год членства с любой даты, когда вы присоединитесь. Взносы могут выплачиваться ежегодно или ежемесячно (с 20-процентной надбавкой) в рамках годового обязательства.

Эти членские взносы в сочетании с нашими ценными спонсорами, гражданскими грантами и другими источниками финансирования позволили Black Fret с 2013 года выделить более 2,1 млн долларов в виде прямых выплат и грантов артистам и еще 1,5 млн долларов в виде выплат местным музыкальным предприятиям. В Остине , каждый год выбирается двадцать групп на 8 сезонов с 2013 по 2021 год, всего 160 групп. Сиэтл был запущен в разгар глобальной пандемии COVID-19 в 2020 году, но все же предоставил гранты в размере 50 000 долларов США десяти группам из Сиэтла.На сегодняшний день Black Fret оказал положительное влияние на жизни сотен отдельных музыкантов.

Каждый артист, номинированный отделением Black Fret, получит грант. Получив награду, группы могут использовать эти средства для развития своей музыкальной карьеры так, как они считают наиболее нужным и эффективным. Мы предоставляем наставничество от местных и национальных профессионалов музыкальной индустрии, чтобы помочь нашим артистам убедиться, что получаемые ими гранты оказывают максимально возможное влияние.

Гранты Black Fret присуждаются за художественное мастерство.Каждый сезон музыканты и группы выдвигаются на рассмотрение членами Black Fret, консультативным советом музыкальной индустрии, бывшими получателями грантов и избранными медиа-партнерами.

Рассмотрение вопроса о гранте от Black Fret возможно только при получении номинации от избирательных округов Black Fret, как указано выше. Не существует незапрошенного процесса подачи заявок, с помощью которого группа может получить грант Black Fret. Скорее, это сообщество Black Fret признает этих артистов и выбирает их в каждой главе каждый сезон.

Каждое отделение Black Fret проводит целый сезон мероприятий для наших членов, создавая захватывающий опыт, который делает всех наших членов частью музыкальной сцены своего отделения. Узнайте больше о том, каково быть участником Black Fret.

Black Fret Seattle объявляет получателей гранта на 2020 год

МУЗЫКАЛЬНАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ КОМПАНИЯ ПРЕДОСТАВИТ 50 000 ДОЛЛАРОВ США В виде ГРАНТОВ МУЗЫКАНТАМ ИЗ СИЭТЛА.

После распределения более 1,75 млн долларов среди музыкантов в Остине, штат Техас, с 2013 года отделение в Сиэтле официально открылось в феврале 2020 года, что стало первым шагом на пути к тому, чтобы стать национальной организацией.

 Black Fret с гордостью объявляет о распределении 50 000 долларов США среди десяти музыкантов и групп из Сиэтла, выполняя свою миссию по поддержке создания и исполнения местной музыки с помощью этого первого гранта.

Black Fret — это общественная благотворительная организация 501 (c) 3, основанная в Остине, штат Техас, в 2013 году, которая выделила музыкантам Остина более 1,75 миллиона долларов в виде грантов и гонораров за выступления. Black Fret предоставляет участникам серию уникальных музыкальных впечатлений, где они могут услышать лучшие и самые яркие из новых местных музыкальных произведений и поддержать развитие местных музыкантов.Сиэтл является первым из новых отделений за пределами Остина, и он уверен, что эти первоначальные гранты в размере 50 000 долларов станут началом многолетней поддержки.

Black Fret Seattle официально запущен 29 февраля 2020 года, как раз в тот момент, когда в Сиэтле начала публично появляться информация о пандемии COVID-19. Масштабы воздействия этого события нельзя было предвидеть, и государственный порядок приюта остановил все мероприятия и массовые собрания, поставив под угрозу миссию Black Fret.

«Мы знали, что музыканты нашего города не могут дождаться улучшения ситуации.Вся отрасль была остановлена ​​как вкопанный, поэтому мы ускорили процесс предоставления грантов, чтобы попытаться оказать помощь там, где мы могли», — сказал исполнительный директор Black Fret Seattle Бен Лондон. «Пандемия очень сильно ударила по нам как организации, но еще сильнее она ударила по нашим музыкантам. Мы просто не могли оправдать приостановку нашей программы до окончания пандемии».

Имея это в виду, Black Fret в июле начал процесс выдвижения кандидатур и голосования, чтобы определить, кто станет десятью получателями гранта 2020 года.Восемьдесят один артист и группа из Сиэтла были номинированы на рассмотрение членами и консультантами Black Fret, десять из которых стали нашими артистами Black Fret 2020, и группы были номинированы на рассмотрение участниками и консультантами Black Fret, десять из которых стали нашими артистами Black Fret 2020.

Получатели гранта Black Fret Seattle 2020:

Bearaxe, Chong The Nomad, Whitney Mongé, Naked Giants, Sera Cahoone, Smokey Brights, Stephanie Anne Johnson and the Hidogs, The Black Tones, Tomo Nakayama и Tres Leches.

Каждый артист/группа получит грант в размере 5000 долларов, который они могут использовать по своему усмотрению для развития своей карьеры. Наши артисты Black Fret Seattle 2020 поделились своими мыслями о влиянии этого гранта:

«Как музыкант в наше время, поддержка, которую вы нам оказываете, поистине невероятна», — сказала Сера Кахун.

Алайя Д’Алессандро из Tres Leches отметила: «Мы потеряли много концертов из-за COVID. Эти 5000 долларов позволят нам вернуться в студию звукозаписи, чтобы закончить наш второй альбом и быть готовыми к турне, когда это будет безопасно.

«Мы действительно намерены использовать эти деньги для развития группы. У нас есть несколько новых синглов в работе, и это дает возможность записать и выпустить их», — сказали Райан Девлин и Ким Уэст из Smokey Brights.

«Мы запустили Black Fret, чтобы помочь поддержать и возвеличить музыкантов Остина с мечтой представить эту программу в других городах», — сказал основатель Black Fret Колин Кендрик. «Я не могу передать вам, как приятно видеть, как наша мечта воплощается в жизнь. . Отделение в Сиэтле — это первый шаг к расширению нашей программы по всей стране и помощи музыкантам по всей стране.

Концертная серия «Черный лад»:

Музыканты 2020 года примут участие в десятинедельной серии концертов, которые будут транслироваться в прямом эфире с Nectar, начиная со среды, 9 сентября, в 20:00 по тихоокеанскому стандартному времени с участием Кочевника Чонга.

Каждое шоу будет приносить пользу какой-либо местной некоммерческой организации. Первые четыре шоу пройдут в сентябре в течение четырех сред, а дополнительные даты последуют позже.

Среда 9/9 Кочевник Чонг (Проект Бамия)
Среда 16/9 Голые гиганты (Ферма выращивания корней)
Среда 23/9 Стефани Энн Джонсон и Хидоги (Канал 253) Акции сейчас)

АУДИО И ВИДЕО ПЛЕЙЛИСТЫ:

Видео – https://www.freqsho.com/index.html#/playlistPlayback/5f3f56a32f46661f007d2cc6
Аудио – https://open.spotify.com/playlist/0AbK543RprvGfxXXliTUgU?si=ix4WXs2wSl2BSnfqOn5e0g

О BLACK FRET
Основанная в 2013 году, Black Fret является общественной благотворительной организацией 501(c)3 со штаб-квартирой, чья миссия состоит в том, чтобы дать местным музыкантам возможность создавать и исполнять новую великолепную музыку. Организация представляет собой инновационную эволюцию старинной модели патронажа симфонических оркестров, ориентированную на поддержку популярной местной музыки. Ежегодные членские взносы Black Fret составляют 1500 долларов в год, которые можно вносить единовременно или ежемесячными платежами.Членство не облагается налогом на 80% и дает право на участие в благотворительных программах для сотрудников. В обмен на ежегодные взносы участники будут вознаграждены выступлениями некоторых из лучших артистов города на широком спектре частных мероприятий, включая ежемесячные шоу в интимных местах и ​​ежегодное гала-мероприятие под названием Black Fret Ball. Те, кто хочет стать членом Black Fret Seattle, могут зарегистрироваться на http://www.blackfret.org/SEATTLE. Все членства предоставляют члену и гостю доступ к десяти предстоящим мероприятиям Black Fret 2020 года, включая Black Fret Ball.По всем вопросам обращайтесь по адресу [email protected]

.

---

---

Быстрее, чем звук: Black Fret Ball возвращается на сцену с 250 тысячами долларов для художников Остина: последние новости о двух местных музыкальных некоммерческих организациях, стремящихся к расширению — Музыка

Дизи Браун на балу Black Fret Ball (Фото Яны Бирчум)

После изобретательных усилий по оцифровке в течение 2020 года, таких как подключение артистов к платным виртуальным концертам «счастливый час» и участие в South от Southwest Online , возвращение Black Fret Ball позволило музыкантам делать то, что у них получается лучше всего.

Многие из тех, кто впервые выступил на сцене Moody Theatre , получатели грантов пошли ва-банк на сеты из двух песен. После долгого успеха дебюта BLK VINTAGE , BLK ODYSSY предложили прекрасное смягченное исполнение при поддержке двух струнников. Сопровождая Джеймса Робинсона , танцовщица Чандра Вашингтон надела блестящий костюм-маску и швырнула в воздух 100 долларов наличными. Зак Персон смело бросил не один, а два гитарных медиатора мягко сидящим донорам, завершив запись «Can’t Stop Running».»

Вынужденная сократить гранты в прошлом году из-за пандемии, некоммерческая организация вернулась к своей восьмой ежегодной вечеринке. На вечере было вручено 252 000 долларов 20 художникам из Остина, то есть каждый получил не менее 12 000 долларов. В соответствии с моделью Black Fret , после разблокировки средств за счет записи, выступления и участия в благотворительности, местные жители могут использовать доллары по своему усмотрению.

Организация надеется помочь художникам за пределами Остина, начиная с филиалов в Сиэтле и Колорадо.

«Подобно тому, как мы разговаривали с сотнями музыкантов перед запуском в Остине, мы хотели узнать мнение многих людей, прежде чем мы действительно выйдем на национальный и международный уровень», — сказал соучредитель хостинга Мэтт Отт , ссылаясь на целевая группа сформирована из студентов UT-Austin MBA. «Я хочу, чтобы это была организация, которая раздает миллионы долларов в год в виде грантов, а не несколько сотен тысяч».

На местном уровне Black Fret в основном поддерживается за счет ежегодных взносов своих членов, начиная с 750 долларов, и спонсорской помощи.Как выразился Отт, грантовые доллары признают «широту, глубину, разнообразие и крутизну, а также тот факт, что каждая из этих групп заслуживает полного бака бензина». Некоммерческая организация наградила значительно больше чернокожих артистов, чем в прошлые годы, что составляет почти половину получателей.

2021 класс читается: American Dreamer , Clarence James , DearkBird , Deezie Brown , Eimaral SOL , GARRY и Isska Forsyth , Harry Edohoukwa , Jake Lloyd , Джеймс Робинсон , Jon MUQ , Jonathan Terrell , Lisa Morraell , MOTENKO , Nané , PAT Byrne , PR Newman , PROMO Alien , BLK ODYSSY , Преподобный Фью и Зак Персон .

Гарри Эдохуква на балу Black Fret Ball (Фото Яны Бирчум)

Darkbird получил самый большой отклик у публики с эффектным синтезаторным синглом восьмидесятых «Heartbeat», присоединившись к Lumineers -y автору песен Пэту Бирну и театральным рокерам Nané в качестве получателей гигантских грантов в размере 16 000 долларов, выбранных участниками.

По обе стороны раздельного этапа победители оделись соответственно. Гарри Эдохоуква надел сапоги на каблуках и элегантный костюм, чтобы соответствовать его эпическим волнам хип-хопа и рока, заканчивающимся «Зомби». Самый молодой лауреат вечера, шляпа-ведро Кларенса Джеймса , сочеталась с восхитительно громоздкими, илистыми психоделическими инди-звуками. Электрически непринужденный исполнитель Дизи Браун прогуливался в солнцезащитных очках и комбинезоне, украшенном его логотипом 5th Wheel Fairytale, и произнес единственную за ночь благодарственную речь:

«Ребята, вы были огромным благословением для меня и моей семьи в течение всего этого года.COVID чуть не сломал нас.»

Надевание поп-суперспособностей, Примо-инопланетянин заявил: «Для этой песни я собираюсь стрелять лазерами из своей вагины» перед «KWIW» (эксклюзив с распроданного винилового релиза, выпущенного ранее в этом году). Богатый тембр певицы сыграл превосходный Cher в триумфальном финале «Believe» вместе с лидером группы Nané и Paige DeChausse из Reverent Few. Танцевальная группа огромной группы продемонстрировала широкомасштабное воздействие ночи, в то время как клавишник Брауна незаметно передал косяк бродячему оператору с камерой.

Ищите этот ролик на YouTube , премьера которого состоится в эту субботу в 19:00, и поддержите или станьте участником на blackfret.org.

Окружной прокурор округа Трэвис Хосе Гарса выступает 2 декабря в Green Jay (ранее Beerland). (Фото Рэйчел Раско)

Фонд SIMS борется со смертью от передозировки на бесплатном тренинге 16 декабря

Более 240 жителей округа Трэвис погибли из-за передозировки наркотиков в 2020 году, что на 30% больше, чем в 2019 году.Согласно годовому отчету Медицинского эксперта округа Трэвис , это делает передозировку второй по значимости причиной смерти в результате несчастного случая в прошлом году.

В прошлую субботу серия концертов «Вместе безопаснее» привлекла внимание к недавнему всплеску смертности от передозировок в Остине. Через Mohawk , Empire и Green Jay , Blackillac принес туманную машину, а Lord Friday the 13th вокалист Felix прототипически надел наколенники и плащ.Пожертвование- бесплатные шоу, собранные для фонда SIMS Foundation в Остине, который предоставляет услуги по восстановлению психического здоровья и зависимости от психоактивных веществ для представителей музыкальной индустрии и членов их семей.

Совместное мероприятие поддерживает Трэвис Окружной прокурор округа Хосе Гарза , недавние усилия по снижению смертности от передозировок. На пресс-конференции на прошлой неделе Гарза сказал, что предварительные данные о передозировке за 2021 год показывают, что «этот кризис ухудшается с каждым днем ​​и с каждым месяцем».»

«Нам придется пересмотреть нашу собственную политику и, возможно, наши законы», — сказал он. «Мы не можем арестовывать и преследовать в судебном порядке наш выход из этого кризиса. Если мы серьезно относимся к снижению числа смертей, связанных с передозировкой, в нашем сообществе, мы должны начать лечить расстройство, связанное со злоупотреблением психоактивными веществами, как кризис общественного здравоохранения».

В рамках этих усилий окружная прокуратура выделила SIMS более 15 000 долларов из своего дискреционного фонда. С 2018 года SIMS предоставляет музыкальному сообществу бесплатное обучение, в том числе обучение тому, как применять спасительный налоксон (он же Наркан ).Некоммерческая организация предлагает «Восстановление от употребления психоактивных веществ 101 с обучением налоксону» 16 декабря с 14:00 до 16:00 по телефону Antone’s .

Чтобы зарегистрироваться, напишите исполнительному директору Пэтси Долан Буресса по адресу [email protected] до 13 декабря. Тренинги открыты для всех членов музыкального сообщества и членов их семей и будут предлагаться в третью среду каждого месяца.

«Нам в SIMS очень повезло, что мы не потеряли ни одного клиента из-за передозировки», — сказал Буресса о последних годах. «Но мы действительно наблюдали огромное увеличение количества рецидивов, которые происходили среди наших нынешних клиентов, и увеличение числа клиентов, ищущих поддержки по вопросам, связанным с употреблением психоактивных веществ».

SIMS также планирует выйти за пределы Остина. В июле некоммерческая организация запустила «Вызов основателя по сбору средств», чтобы заручиться поддержкой для расширения в другие города — предварительно Хьюстон, Даллас и Сан-Антонио, затем Детройт, Денвер, Боулдер и Роли. Усилие чествует соучредителя Дона Эллисона , который умер в апреле и был отцом музыканта из Остина Симса Эллисона , чье самоубийство в 1995 году вдохновило на создание организации.Внесите свой вклад на simsfoundation.org/donate.

Перекрёстные помехи

Калифорнийское трио Хаим отыграло концерт-сюрприз в прошлую субботу после предварительного показа новой Лакричной пиццы режиссера Пола Томаса Андерсона . Алана Хаим играет главную роль в комедийной драме с участием ее сестер по группе, выход которой намечен на 25 декабря. внутренняя гостиная Highball .После забавного фальстарта в «Summer Girl» Даниэль Хаим пошутила: «Это большое давление, ясно? Мы давно не играли».

HAIM устроила неожиданное выступление победителям конкурса Licorice Pizza в Остине, штат Техас, в Alamo Drafthouse 🍿 pic.twitter.com/Rpq3dhKIoH

— Новости и обновления HAIM (@HAIMthebandnews) 5 декабря 2021 г.

Музыкальное голосование Austin Music Awards 2021–2022 продолжается. Голосуйте сейчас за свои любимые группы, площадки и музыку до 31 января.

Black Fret приедет в Сиэтл в следующем году, обещая новый способ поддержки артистов

KEXP Sound & Vision выходит в эфир каждую субботу утром с 7 до 9 утра по тихоокеанскому времени и включает интервью, артистизм, комментарии, идеи и разговоры, которые рассказывают более широкие истории через музыку и иллюстрируют, почему музыка и искусство имеют значение. Вы также можете услышать больше историй в новом подкасте Sound & Vision. Новые серии выходят каждый вторник. Подпишись сейчас.

---

Black Fret приедет в Сиэтл в январе 2020 года. Услуга основана на членстве: люди платят ежегодный взнос за интимные живые выступления, а в конце года деньги от этих членских взносов передаются музыкантам. В прошлом году Black Fret выделил гранты в размере 20 000 долларов США 10 музыкантам и меньшие гранты в размере 5 000 долларов США еще 10 музыкантам в родном городе некоммерческой организации Остин, штат Техас. Ведущая Sound & Vision Эмили Фокс поговорила с исполнительным директором Black Fret Seattle Беном Лондоном об услуге и о том, почему она расширяется в Сиэтле.

Об идее Black Fret:

Предпосылка заключалась в том, что [Black Fret] считал, что местная музыка должна поддерживаться так же, как исторически поддерживалась опера, симфония и балет. Итак, они создали эту организацию, которая создавала опыт, опыт живой музыки для доноров, которые затем, в свою очередь, объединялись в форме грантов для музыкантов для поддержки таких вещей, как запись, гастроли или своего рода профессиональное развитие, которое атрофируется в текущий музыкальный ландшафт.

О доставке Black Fret в Сиэтл:

Музыка – неотъемлемая часть культуры нашего города. Но в то же время наш город переживает беспрецедентный рост. Есть экономические факторы, которые мешают музыкантам выживать. И когда стоимость жизни достигает паритета с такими местами, как Лос-Анджелес или Сан-Франциско, мы видим, что все больше наших музыкантов направляются в эти места, потому что существует восприятие или реальность, что у них больше возможностей.И лично я не хочу жить в городе, где музыка не играет большой роли.

О финансовой ценности такой услуги, как Black Fret, в современной музыкальной индустрии:

Я вижу молодых музыкантов или музыкантов в целом – проблемы, с которыми они сталкиваются в мире. Что-то вроде тройной угрозы роста стоимости жизни, демократизации записанной музыки, когда доход от потоковой передачи не был достигнут, и изменений в концертном бизнесе, когда местные артисты на самом деле не отправляются в национальные туры, как когда-то в поддержку выступлений. .Итак, как можно построить карьеру, когда все, что ты делаешь, это вкладываешь деньги, а денег на самом деле не так уж много?

О том, как выглядит успех Black Fret:

Я думаю, что Black Fret может добиться успеха, если мы сможем привлечь все сообщество, чтобы собраться вместе и понять, что мы не можем ждать, пока идеальное решение упадет с неба, что, если мы все немного вложимся, мы сможем гарантировать, что это продолжает оставаться жизненно важным регионом для музыки, искусства и культуры, и мы обязаны жить здесь.Мы платим налоги за улицы. Мы платим налоги за пожарных и полицию. Это не налог. Но если мы будем поддерживать наше искусство и культуру, то это повысит качество нашей жизни.

 

Black Fret: Музыкальная некоммерческая организация оказывает финансовую (и отраслевую) поддержку музыкантам Сиэтла

Бен Лондон уже несколько десятилетий присутствует на музыкальной сцене Сиэтла, как музыкант, так и на должностях в музыкальной индустрии, среди прочего, в MoPOP, The Grammys и Hewlett Packard. Так что он знает о иногда тернистом пути, по которому идут творческие люди из Сиэтла.

С этой целью он помогает организовать Black Fret, успешную некоммерческую организацию, ориентированную на музыкантов, в Сиэтл. Миссия: передать средства, отраслевой опыт и рекомендации начинающим музыкантам из Сиэтла. «У вас здесь идеальный шторм из-за роста стоимости жизни и демонетизации записанной музыки», — говорит он. «Мы все хотим, чтобы этот город оставался музыкальным. И хотя это здорово, что у музыкантов теперь есть зоны бесплатной загрузки в городе для выступлений, это [само по себе] не будет удерживать их в городе.Им нужны деньги».

Сиэтлец, недавно отметивший свое 30-летие в качестве жителя лондонского города, несколько лет работал соло-гитаристом и вокалистом в любимой местной рок-группе Alcohol Funnycar, испытав на себе неопределенность жизни музыканта. «Я помню, даже когда здесь было дешево жить, как трудно было себе это позволить. А сейчас все гораздо сложнее», — говорит он.

К концу десятилетия ажиотаж крупных лейблов, из-за которого Alcohol Funnycar оказался на расстоянии вытянутой руки от успеха крупных лейблов, иссяк.После этого Лондон начал карьеру, кульминацией которой стала его работа в качестве исполнительного директора Black Fret Seattle.

Наиболее важной из его должностей, связанных с музыкой (по крайней мере, на Тихоокеанском Северо-Западе), была его работа в MoPOP, тогда известном как EMP/Experience Music Project. Он стал одним из ключевых архитекторов SoundOff!, молодежного конкурса групп, который за 19 лет своего существования стал ценным инкубатором местных музыкальных талантов. «Когда мы запустили SoundOff!, некоторые из моих друзей-музыкантов думали, что это банальная битва групп, — говорит Лондон, — но теперь это стало настоящим заведением, и молодые группы настраивают на это свои часы.Лондон видит подобное потенциальное долголетие в Black Fret.

Черный лад Остин. (фото Дэйва Педли)

Корни организации зародились в Остине, штат Техас, в 2013 году как детище поклонников музыки Остина (и соучредителей того, что впоследствии станет Музыкальным фондом Остина) Мэтта Отта и Колина Кендрика. Связь Лондона с этим началась в прошлом году, когда он был в Остине в гостях у друзей и встретил участников, которые посетили Black Fret Ball организации. «Они упомянули об этой организации, которая давала музыкантам гранты на запись и гастроли, — говорит он, — и я подумал, как бы мы могли сделать что-то подобное здесь.”

Первоначально Лондон рассматривал возможность начать с нуля и создать на местном уровне отдельную, не связанную с этим программу грантов. Но беседа с Оттом и Кендриком навела на мысль о настоящем сиэтлском отделении Black Fret. «Я встретился с Мэттом и Колином, и они сказали мне, что уже хотят привезти сюда [Black Fret]». Лондон заявляет. «Мы поняли, что просто имеет смысл объединить усилия».

Реакция коллег-музыкантов последовала незамедлительно. «Сразу после того, как мы анонсировали Black Fret, мы услышали поток музыкантов, говорящих: «Спасибо», — говорит Лондон.

Годовой цикл

Black Fret Seattle продлится с января по декабрь, а номинанты будут выбраны совместно участниками и консультативным комитетом профессионалов музыкальной индустрии. Поле постепенно сузилось, частично благодаря живым выступлениям, спонсируемым Black Fret. В конце года участники голосуют за получателей грантов.

Лондонский Black Fret Seattle все еще занимается тонкой настройкой с прицелом на то, что флагманское отделение организации в Остине сделало для музыкальной экосистемы этого города: около 1.За последние пять лет музыкантам было вручено 5 миллионов долларов, и усилия организации также помогли получить более двух миллионов дохода для звукорежиссеров и съемочной группы, работающих на концертах в Остине.

Сегодня Black Fret Austin насчитывает 500 участников и дает более сорока концертов в год в районе Остина. В прошлом году флагманская организация Остина выделила 250 000 долларов в виде грантов в виде десяти грантов по 20 000 долларов и десяти грантов по 5 000 долларов.

Лондон говорит, что Black Fret Seattle начнет с меньшего размера, первоначально с дюжиной мероприятий Black Fret в год и целью членства в 100 членах (на данный момент их всего около двадцати членов). Количество и сумма грантов Сиэтла по-прежнему подлежат уточнению, но они будут установлены к моменту полного запуска Black Fret Seattle в январе.

Членские взносы Black Fret Seattle составляют шесть платежей по 250 долларов каждый в год, что дает участнику право на два входа на каждое выступление.80% членских взносов не облагаются налогом, а взносы учитываются для корпоративного соответствия. Лондон признает, что членские взносы предназначены не для каждого бюджета, «но за эти деньги вы получаете пару билетов, чтобы увидеть лучших и ярких местных жителей, выступая на специально организованных мероприятиях только для членов клуба в уникальных местах». он говорит. «Это не просто стопка билетов на дюжину концертов в одном месте».

Люди, которые в состоянии присоединиться, также склонны немного постарше, что Лондон считает ценным и восторженным источником поддержки. «Во многом музыкальная индустрия забыла о людях старше 30 лет, — говорит он. «Часто это люди, которые любят музыку, но по причинам работы или семьи не всегда могут попасть на концерты».

Исполнительный директор Black Fret Seattle Бен Лондон. (Фото любезно предоставлено Black Fret)

Концерты Black Fret расписаны на шесть месяцев вперед, обычно по субботам, и проходят с 7 до 10 вечера, представляя лучшее из обоих миров. «Таким образом, вы можете увидеть две отличные группы, а затем вернуться домой в респектабельное время, если вас беспокоит няня или работа на следующий день, — говорит Лондон, — или если вы все еще хотите остаться дома, у вас есть все остальное. вечер впереди, чтобы сделать это.

Цель

Black Fret — дать музыкантам инструменты, необходимые им для продвижения вперед в индустрии, а также средства, которые помогут им в этом. «Мы не просто выписываем чек, — говорит Лондон. «Наш Консультативный совет будет состоять из различных профессионалов музыкальной индустрии, которые смогут помочь музыкантам с тем, на что потратить эти деньги». Это включает в себя все: от покупки оборудования до затрат на запись, гастролей и маркетинга. «Таким образом, когда артист или группа переходят на следующий уровень с крупным лейблом или издателем, у них есть определенные рычаги влияния и опыт.

Black Fret вызвали много положительных отзывов в музыкальном сообществе Сиэтла: не кто иной, как Майк Маккриди из Pearl Jam, написал в Твиттере: «Мне нравится, когда поддерживают новых артистов! С нетерпением ждем возможности увидеть, как #BlackFretSeattle оставит свой след в Сиэтле! Я полностью поддерживаю это». Но Лондон признает, что впереди его ждет путешествие.

«Во-вторых, мы раздадим один доллар некоторым артистам, но не всем, это будет проблемой. Но я лучше сделаю что-нибудь, чтобы помочь музыкантам, чем ничего не сделаю», — говорит он.«Это не решение , а решение , которое быстро принесет деньги и помощь художникам».

И несмотря на все опасения по поводу того, что статус Сиэтла как музыкального города и культурного центра находится под угрозой из-за вторжения технологического бума, Лондон остается в равной степени открытым и оптимистичным. «Музыкальная сцена Bay Area — это настоящая поучительная история, — говорит он. «И вместо того, чтобы потерять всех наших артистов из-за роста стоимости жизни и необходимости восстанавливать сцену с нуля, мы должны сделать все возможное, чтобы спасти музыкальную сцену, которая у нас уже есть.

«Существует преобладающее смирение с тем, что Сиэтл только что умер, — добавляет Лондон. «Но у нас должно быть агентство для нашего собственного культурного будущего. Нам его никто не даст. Мы должны создавать вещи, которые поддерживают наше музыкальное сообщество».

Дополнительную информацию о Black Fret и о том, как присоединиться к Black Fret Seattle, можно найти на веб-сайте Black Fret здесь.

Рационометрический зонд FRET, основанный на активности, выявляет вызванные онкогенами изменения в лабильных пулах меди, вызванные измененным метаболизмом глутатиона фундаментальные процессы, такие как транспорт кислорода, дыхание и метаболизм, рост и дифференцировка клеток и передача сигналов (2⇓⇓⇓–6).

В дополнение к прочно связанным пулам меди, скрытым в активных центрах металлопротеинов, новые данные свидетельствуют о наличии лабильных пулов меди, которые относительно слабо связаны с низкомолекулярными лигандами (7). Лабильные пулы меди способствуют увеличению числа динамических сигнальных путей переходных металлов (8), включая нервную коммуникацию (9⇓–11), обоняние (12, 13), липолиз (6), циклы покоя-активности (14) и киназные пути. участвует в передаче сигнала и онкогенезе (5, 15). Действительно, нарушение регуляции меди может привести к аберрантным событиям окислительного и нитрозативного стресса, которые сопровождают заболевания, охватывающие рак (5, 16), сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (3, 17), диабет и ожирение, а также генетические болезни Менкеса и Вильсона. расстройства (18⇓⇓–21).

Дихотомия меди сигнал/стресс мотивирует разработку новых химических инструментов, помогающих расшифровать более широкий вклад меди в физиологию и патологию. В этом контексте флуоресцентные (6, 10, 11, 14, 22⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓–38), биолюминесцентные (39) и магнитно-резонансные томографы (40⇓–42) для визуализации лабильных пулов меди со специфичностью к металлу и степени окисления, особенно при использовании совместно с дополнительными методами измерения общего содержания металлов (22, 43, 44), включая масс-спектрометрию с индуктивно-связанной плазмой с лазерной абляцией (LA-ICP-MS) (45 ⇓–47), наномасштабная масс-спектрометрия вторичных ионов (38, 48) и рентгеновская флуоресцентная микроскопия (10, 49, 50) могут дать целостную картину гомеостаза металлов для данной биологической модели.В соответствии с этим химическим ограничением в разработке флуоресцентных зондов является то, что подавляющее большинство индикаторов меди на сегодняшний день реагируют только изменением интенсивности флуоресценции одного цвета, что может усложнить количественные измерения пулов меди и/или сравнение уровней меди в разных средах. биологических образцов из-за потенциальных изменений в поглощении зонда наряду с помехами, возникающими из-за независимых от меди явлений, таких как неоднородность толщины образца и интенсивности света (51, 52). Чтобы решить эту проблему, логометрические датчики, использующие спектральные изменения возбуждения/излучения на двух или более длинах волн, в принципе могут обеспечивать внутреннюю самокалибровку для неоднородной нагрузки датчика и ограничивать интерференцию между различными образцами (53⇓⇓⇓–57). Однако большинство ратиометрических флуоресцентных индикаторов меди, о которых сообщалось на сегодняшний день, в значительной степени ограничены отсутствием специфичности к степени окисления и/или снижением общей интенсивности флуоресценции при обнаружении меди (31⇓⇓⇓⇓⇓–37).

Теперь мы представляем разработку, синтез и биологическое применение логометрического флуоресцентного медного индикатора первого поколения, флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) медного зонда-1 (FCP-1).Этот сенсорный зонд, основанный на активности, использует хемоселективное Cu(I)-зависимое окислительное C-O расщепление трис[(2-пиридил)метил]аминовой (ТРА) единицы (28, 58, 59), связывающей донорную флуоресцеиновую и акцепторную единицы родамина. (Схема 1). Высокая специфичность FCP-1 к металлам и степени окисления для Cu(I), наряду с его двухцветным ратиометрическим ответом FRET, позволяет использовать его для мониторинга динамических изменений в лабильных пулах Cu(I) в живых клетках. Благодаря самокалибровке, обеспечиваемой его логометрическим ответом, FCP-1 был способен надежно обнаруживать снижение эндогенных уровней лабильного Cu(I) в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), лишенных высокоаффинного переносчика меди Ctr1 ( Ctr1 ^-/- ) относительно конгенеров дикого типа.Дальнейшие эксперименты выявили колебания лабильных уровней Cu(I), но не общего уровня меди, при окислительно-восстановительном стрессе, вызванном генетическими изменениями в путях биосинтеза глутатиона. Интересно, что дефицит лабильных пулов Cu(I) был обнаружен при введении онкогенных BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , связывая лабильную дисрегуляцию меди с онкоген-зависимым окислительно-восстановительным статусом. Способность FCP-1 отслеживать лабильные пулы Cu(I) с помощью логометрического ответа обеспечивает отправную точку для дальнейших исследований окислительно-восстановительного вклада в передачу сигналов переходных металлов.

Результаты и обсуждение

Дизайн, синтез и характеристика FCP-1.

Вдохновленный бионеорганическими модельными соединениями TPA, которые демонстрируют Cu(I)-зависимую химию окислительного расщепления (28, 58, 59), наша конструкция FCP-1 на схеме 1 соединяет донор флуоресцеина FRET и акцептор родамина FRET с чувствительным к меди TPA компоновщик. Изменения в лабильных уровнях Cu(I) будут модулировать внутримолекулярную эффективность FRET и приводить к различным интенсивностям флуоресценции донора и акцептора на 2 разных длинах волн, которые могут быть откалиброваны логометрическим способом.При более низких уровнях Cu(I) зонд остается интактным с более высоким FRET и излучением с преобладанием родамина, при этом более высокие уровни Cu(I) приводят к зависимому от меди окислительному расщеплению линкера TPA и более низкому FRET и эмиссии с преобладанием флуоресцеина.

Синтез FCP-1 начинается с получения метилового эфира флуоресцеина, функционализированного 2-бромметилпиридином ( 2 ), и родамина, функционализированного пиколиламинами ( 5 ; схема 2). Соединение 2 было синтезировано в 2 стадии из ранее описанного метилового эфира флуоресцеина путем нуклеофильного замещения на 6-(бромметил)-2-пиридинметанол и последующего бромирования метилового спирта.Параллельно был получен нозил-защищенный пиколиламин ( 3 ) путем монозамещения бис(хлорметил)пиридина из 4-нитро- N -(2-пиридинилметил)бензолсульфонамида, а затем проведена реакция с пиперазинил-функционализированным родамином (Pz-родамином). позволить себе 4 . Затем с нозильной группы 4 снимают защиту тиофенолом и K ₂ CO ₃ с получением 5 . Имея в руках ключевые фрагменты 2 и 5 , мотив TPA может быть получен путем нуклеофильного замещения 2-бромметильной группы на 2 пиколиламинами на 5 в основных условиях, что дает окончательный логометрический зонд FCP-1. который был охарактеризован с помощью ЯМР ¹ H и ¹³ C{ ¹ H}, МС высокого разрешения и МС с использованием жидкостной хроматографии (ЖХ-МС; SI Приложение , рис.С1). Зонд Cu(I) на основе интенсивности FL-TPA был приготовлен в качестве контрольного соединения с тем же триггером чувствительности на основе Cu(I)-зависимой активности и каркасом флуоресцеина, но без логометрического ответа (схема 2).

Схема 2.

Синтез ФЦП-1 и контрольного зонда ФЛ-ТПА.

Реакционная способность и селективность FCP-1 по отношению к меди.

Известно, что внутриклеточная среда восстанавливается и содержит высокие концентрации биомолекул, что приводит к скоплению макромолекул (60, 61).Таким образом, чтобы имитировать аспекты этих свойств in vitro, мы оценили FCP-1 в буфере PBS, содержащем глутатион (2 мМ) и полиэтиленгликоль (ПЭГ)-400 (40%, об./об.). FCP-1 показал максимумы поглощения при 465, 493 и 552 нм с молярными коэффициентами экстинкции 20 000, 22 100 и 40 000 M ^-1 см ^-1 соответственно ( SI Приложение , рис. S2). Первые 2 максимума поглощения соответствовали поглощению флуоресцеинового фрагмента, так как аналогичные максимумы поглощения при 460 и 489 нм были обнаружены в спектрах поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S2) и сообщается о метиловом эфире флуоресцеина в моноклетке (62, 63), тогда как наименьшее поглощение энергии при 552 нм происходит из группы родамина ( SI Приложение , рис. S2). Было обнаружено, что при фотовозбуждении при 458 нм FCP-1 излучает при 526 и 576 нм (рис. 1 —), что соответствует сигнатурам флуоресцеина и родамина соответственно. Примечательно, что строительный блок Pz-родамина демонстрирует лишь слабое поглощение при 458 нм ( SI, Приложение , рис. S2). Вместе со значительным вкладом низкоэнергетической флуоресценции от возбуждения от 450 до 500 нм, которая находится в области поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S3), данные подтверждают возникновение FRET от донора флуоресцеина к акцептору родамина. При использовании FL-TPA в качестве эталонного донорного соединения FRET ( SI, Приложение , рис. S4) с предположением, что тушение донорной флуоресценции происходит только в результате процесса FRET, эффективность FRET в кассете FCP-1 оценивается в 84%. .

Рис. 1.

Фотофизические свойства и селективность Cu(I) FCP-1 в водных буферных растворах. ( A ) Изменения в скорректированных спектрах излучения FCP-1 (5 мкМ) в водном буферном растворе.( Врезка ) Изменения логометрической эмиссии FCP-1, F ₅₂₆ / F ₅₇₆ с Cu(I) (10 мкМ) с течением времени. ( B ) Скорректированные спектры излучения FCP-1, измеренные при различных концентрациях. ( C ) Существенных изменений коэффициента выбросов F ₅₂₆ / F ₅₇₆ при различных концентрациях FCP-1 не наблюдается. ( D ) Изменение отношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ FCP-1 (5 мкМ) к различным биологически значимым ионам металлов, а также кобальт(II)-содержащему витамину B ₁₂ . Черные столбцы представляют логометрическую эмиссионную реакцию, наблюдаемую при добавлении конкурирующих ионов металлов (1 мМ для Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ и Ca ²⁺ и 10 мкМ для всех других d- блокировать ионы металлов, а также витамин B ₁₂ ) через 15 мин. Красные столбцы представляют собой логометрический отклик эмиссии при последующем добавлении 10 мкМ Cu(I) через 15 мин. Легенда: 1, Na ⁺ ; 2, К ⁺ ; 3, Mg ²⁺ ; 4, Са ²⁺ ; 5, Мп ²⁺ ; 6, Fe ²⁺ ; 7, 10 мкМ Co ²⁺ ; 8, 1 мкМ Co ²⁺ ; 9, витамин В ₁₂ ; 10, Ni ²⁺ ; 11, Cu ⁺ ; 12, Zn ²⁺ .( E ) Спектры эмиссии и ( F ) F ₅₂₆ / F ₅₇₆ коэффициент эмиссии (черный) FCP-1 (5 мкМ) или FCP-1 с добавлением (красный) Cu (II) (10 мкМ), (синий) Cu(II) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) или (голубой) Cu(I) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) через 15 мин. Все спектры были получены в водном буфере (PBS с 2 мМ GSH и 40 об.% ПЭГ-400) с λ _ex = 458 нм.

После добавления Cu(I) FCP-1 показал увеличение эмиссии флуоресцеина при 526 нм с сопутствующим снижением флуоресценции родамина при 576 нм (рис.1 А ). Анализ ЖХ-МС подтверждает образование фрагментов метилового эфира флуоресцеина ( P1 ) и родамин-ТРА ( P2 ) при добавлении Cu(I) к раствору FCP-1 ( SI Приложение , рис. S5) и аэробные условия необходимы для инициирования спектральных изменений излучения ( SI Приложение , рис. S6), что соответствует Cu(I)-опосредованному окислительному расщеплению связи C-O бензилового эфира на линкере TPA FCP-1. Это расщепление С-О приводит к отделению донора флуоресцеина от акцептора родамина и, следовательно, к снижению внутримолекулярной эффективности FRET с логометрическим изменением спектра излучения (рис.1 А ). Рационометрическое изменение флуоресценции FCP-1 при 526 и 576 нм ( F ₅₂₆ / F ₅₇₆ ) было быстрым и достигло насыщения после приблизительно . 30 мин в присутствии двукратного избытка Cu(I) (10 мкМ). Примечательно, что соотношение F ₅₂₆ / F ₅₇₆ FCP-1 показало линейную зависимость доза-реакция с добавлением Cu(I) от 0,01 до 1 мкМ ( SI Приложение , рис. S7 A A ), подчеркивая способность FCP-1 обнаруживать уровни Cu(I) в этом диапазоне по логометрическому изменению флуоресценции.FCP-1 показал высокую чувствительность к Cu(I), о чем свидетельствуют заметные изменения спектра излучения при 10 нМ Cu(I) ( SI Приложение , рис. S7 B ) и предел обнаружения 16,7 нМ на основе метод 3σ из 5 независимых экспериментов (64, 65). Более интересно, что базальный коэффициент эмиссии FCP-1 F ₅₂₆ / F ₅₇₆ не показал существенных изменений при различных концентрациях зонда (от 0,5 до 20 мкМ; рис. 1 B и C ) .Эта внутренняя самокалибровка является преимуществом, так как было обнаружено, что FCP-1 менее флуоресцирует при более высоких концентрациях, предположительно из-за самогашения, что является обычной проблемой, обнаруживаемой у флуорофоров ( SI Приложение , рис. S8) (66). . Действительно, незначительные изменения в логометрической эмиссии FCP-1 указывали на то, что FRET происходил в основном по внутримолекулярному механизму, а независимая от концентрации логометрическая флуоресценция FCP-1 дополнительно подчеркивает его потенциал в сравнительной визуализации лабильных пулов Cu(I) в биологических образцах с помощью избежание возможных осложнений, возникающих из-за различий в поглощении зонда, толщине образца и интенсивности света.

Рационометрическое изменение флуоресценции FCP-1 было селективным по отношению к Cu(I) по сравнению с другими биологически значимыми ионами металлов, за исключением свободного Co(II) в концентрации 10 мкМ, который незначительно изменил флуоресценцию FCP-1 (рис. 1 D ). Примечательно, что эта концентрация экзогенного Co (II) намного выше, чем физиологически значимые уровни лабильного Co (II), поскольку известно, что этот ион металла прочно связан с белками. Действительно, FCP-1 не показал существенных изменений в логометрическом сигнале в присутствии 10 мкМ кобаламина (витамин B ₁₂ ) (67), который является преобладающей формой Co(II) в системах млекопитающих, предполагая, что вмешательство в обнаружение Cu(I) по FCP-1 из Co(II) в биологических образцах должно быть пренебрежимо мало. Конкурентные эксперименты также показали способность FCP-1 обнаруживать Cu(I) в растворах, содержащих другие биологически значимые ионы металлов (рис. 1 D ). Помимо селективности по металлам, логометрический отклик FCP-1 зависит от степени окисления Cu(I), поскольку зонд не реагирует логометрически на Cu(II) (рис. 1 E и F ). В подтверждение этой селективности по степени окисления совместная инкубация FCP-1 с Cu(II) и избытком глутатиона, который легко восстанавливает Cu(II) до Cu(I), привела к эмиссионным спектрам и F ₅₂₆ F ₅₇₆ , которое идентично полученному при обработке FCP-1 Cu(I) и избытком глутатиона (рис.1 E и F ). Эта специфичность степени окисления важна для применения FCP-1 для визуализации динамических изменений во внутриклеточных лабильных пулах Cu(I) при окислительно-восстановительном стрессе и онкогенной трансформации, которые мы опишем позже.

Наконец, FCP-1 не реагирует на Ag(I), который является близким аналогом Cu(I), но не обладает мощной кислородозависимой окислительно-восстановительной активностью ( SI Приложение , рис. S9). Ввиду низкой растворимости Ag(I) в присутствии ионов хлора и других галогенидов, буферный раствор NaH ₂ PO ₄ (50 мМ, pH 7.4) использовали вместо раствора PBS в этих сериях экспериментов. Действительно, в присутствии Ag(I) не наблюдалось существенного изменения отношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ , в то время как Cu(I) индуцировало патентное увеличение F ₅₂₆ / F ₅₇₆ соотношение FCP-1 в том же буферном растворе ( Приложение SI , рис. S9). Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемые логометрические изменения флуоресценции FCP-1 при добавлении Cu(I) объясняются окислительно-восстановительной активностью Cu(I).Кроме того, было обнаружено, что присутствие восстанавливающих агентов имеет решающее значение для запуска опосредованных Cu(I) логометрических изменений флуоресценции FCP-1 ( SI, Приложение , рис. S10), и действительно аналогичные изменения флуоресценции также наблюдались при использовании аскорбата. вместо 2 мМ глутатиона (GSH) в качестве восстановителя ( SI Приложение , рис. S11). Наряду с наблюдаемым увеличением уровней GSSG (окисленная форма GSH) с сопутствующим падением уровней GSH (восстановленная форма) при добавлении Cu(I) к раствору смеси FCP-1 и GSH ( SI Приложение , Инжир.S5 A ), эти данные подтверждают роль восстанавливающих агентов в «рециркуляции» окислительно-восстановительных соединений Cu(I) для связывания с рецептором TPA и запуска последующего основанного на активности расщепления связи C-O бензилового эфира на компоновщик. Этот разрыв связи происходит главным образом по окислительному механизму, поскольку при добавлении Cu(I) в анаэробных условиях не наблюдается значительных спектральных изменений излучения ( SI Приложение , рис. S6). Получение фрагментов метилового эфира флуоресцеина и родамина-ТРА ( SI Приложение , рис.S5) приводит к снижению внутримолекулярной эффективности FRET и увеличению соотношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ .

FCP-1 может отображать лабильные пулы Cu(I) в живых клетках.

Учитывая селективный и чувствительный ответ FCP-1 на металлы и степени окисления на Cu(I), мы попытались применить этот зонд для логометрической флуоресцентной визуализации лабильных пулов Cu(I) в живых клетках. С этой целью клетки HEK 293T подвергали воздействию различных доз CuCl ₂ (от 25 до 300 мкМ), тщательно промывали для удаления избытка меди из среды, а затем инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в течение 45 мин и визуализировали. .Клетки с добавлением меди показали статистически значимое дозозависимое увеличение отношения F _{зеленого} / F _{оранжевого} по сравнению с контрольными клетками-носителем (фиг. 2 B ). Напротив, клетки HEK 293T с дефицитом меди, полученные обработкой непроницаемым для мембран хелатором меди, батокупроинсульфонатом (BCS; 100 мкМ), промытыми и впоследствии инкубированными с FCP-1 (5 мкМ), показали статистически значимое снижение F. _{зеленый} / F _{оранжевый} соотношение по сравнению с контрольными клетками (рис.2 C и D ). Наблюдаемое увеличение и снижение лабильных уровней Cu(I) при добавлении меди (CuCl ₂ ) и лечении истощением меди (BCS) соответственно, измеренное с помощью визуализации FCP-1, было подтверждено дополнительными измерениями ICP-MS общих уровней меди. показывая ожидаемое увеличение и уменьшение общего пула меди (рис. 2 E ). Контрольные эксперименты показали, что клетки оставались жизнеспособными, на что указывало окрашивание ядер ( SI Приложение , рис.С12 и С13). Эти данные показывают, что FCP-1 способен визуализировать как увеличение, так и уменьшение лабильных пулов Cu(I) в живых клетках с помощью ратиометрического считывания флуоресценции.

Рис. 2.

Ратиометрическая флуоресцентная визуализация лабильных уровней Cu(I) в живых клетках с использованием FCP-1. ( A ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HEK 293T, предварительно обработанных контрольным растворителем-носителем или различными концентрациями CuCl ₂ в полной среде в течение 18 часов. Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 минут, а затем визуализировали.( B ) Средние сотовые логометрические коэффициенты выбросов, представленные F _{зеленым} / F _{оранжевым} , как определено из экспериментов по визуализации в A , выполненных в трех экземплярах. ( C ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HEK 293T, предварительно обработанных контрольным растворителем-носителем или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 часов. Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 минут, а затем визуализировали. ( D ) Средние клеточные логометрические коэффициенты выбросов FCP-1, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , как определено из экспериментов C , выполненных в трех экземплярах. A и C отображаются псевдоцветом и относятся к базовому контролю для этого эксперимента и независимо друг от друга. λ _ex = 458 нм. ( E ) Измерение ICP-MS для определения общих клеточных уровней ⁶³ Cu в клетках HEK 293T при добавлении и истощении меди по сравнению с контролем (с нормализацией различных количеств клеток по общему клеточному уровню ³¹ P). Столбики погрешностей обозначают стандартный вывод (SD; n = 3).* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 и ***** P < 0,00001.

FCP-1 может отслеживать различия в лабильных уровнях Cu(I) в генетической клеточной модели неправильной регуляции меди.

Установив, что FCP-1 чувствителен к эндогенным пулам лабильных Cu(I) в базовых условиях и может реагировать на изменения в пулах лабильных Cu(I) при фармакологическом добавлении и/или истощении меди, мы попытались изучить применение FCP-1 для визуализации изменений в эндогенных лабильных пулах Cu(I) посредством генетических манипуляций.С этой целью мы выполнили сравнительную визуализацию FCP-1 в клетках эмбриональных фибробластов мыши, которые либо богаты медью ( Ctr1 ^+/+ MEF), либо дефицитны по меди ( Ctr1 ^-/- ). MEFs) путем нокаута высокоаффинного переносчика меди CTR1 (68⇓–70). Как и ожидалось, CTR1 ^{+ / + + / + + / + + / +}

0 MEF, инкубированные с FCP-1 Выставленные более высокие F _Green / F

/ R Ctr1 CTR1 ^{— / —} MEFS ( P < 0.01; 3 A и B ), что указывает на то, что FCP-1 может точно обнаруживать относительное снижение эндогенных уровней лабильного Cu(I) в клетках с дефицитом поглощения меди.

Рис. 3.

FCP-1 позволяет проводить сравнительную визуализацию лабильных уровней Cu(I) в живых клетках с измененными уровнями экспрессии высокоаффинного белка поглощения меди CTR1. ( A ) Кондиционная флуоресцентная микроскопия Изображения CTR1 CTR1

7 + / + + / + + / + и Ctr1

— / — MEFS, обработанные управлением растворителем, CUCL ₂ (100 или 300 мкм) или BCS (500 мкМ) в полной среде в течение 8 ч, промывали полной средой и PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин, а затем визуализировали с λ _ex = 458 нм. ( B ) Средние клеточные логометрические коэффициенты выбросов FCP-1, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , как определено из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Конфокальная флуоресцентная микроскопия изображений Ctr1 ^+/+ MEF и Ctr1 ^-/- MEF, инкубированных с FL — Затем клетки визуализировали с λ _ex = 488 нм. ( D ) Средняя интенсивность клеточной флуоресценции FL-TPA, F _FL-TPA , определенная из экспериментов, проведенных в трех повторностях с λ _ex = 488 нм.Столбики погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 и **** P < 0,0001.

Для дальнейшего подтверждения способности FCP-1 отслеживать дифференциальные уровни лабильного Cu(I) в клетках, Ctr1 ^+/+ MEF, инкубированные с различными концентрациями CuCl ₂ , показали дозозависимое увеличение в соотношении FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} . Напротив, статистически значимых изменений в соотношениях F _{зеленый} / F _{оранжевый} не наблюдалось в Ctr1 ^-/- MEF, инкубированных с FcCl 9 2 Инжир.3 A и B ). Тем временем жизнеспособность клеток сохранялась, что подтверждается окрашиванием ядер DRAQ5 ( SI, Приложение , рис. S14 и S15). Разница логометрического флуоресцентного ответа FCP-1 на экзогенную добавку меди между MEF дикого типа и MEF с нокаутом Ctr1 согласуется с неэффективным поглощением меди, а не с изменениями оттока меди при лечении Ctr1 ^-/- МЭФ с мембранонепроницаемым хелатором меди БКС приводили к снижению отношения F _{зеленого} / F _{оранжевого} , подобно тому, что наблюдается в Ctr1 ^{+/+ 9037 MEF3 A и B ). Дополнительные измерения ICP-MS подтверждают, что общие базальные уровни меди в Ctr1 −/− MEF ниже, чем Ctr1 +/+ MEF ( SI, Приложение ). Важно отметить, что логометрический ответ FCP-1 является ключом к его способности различать базальные и пониженные уровни лабильного Cu(I). Действительно, контрольный зонд FL-TPA, который демонстрирует флуоресцентный ответ «включения» без логометрической самокалибровки, не смог различить различия в базальных лабильных уровнях Cu(I) в Ctr1 +/+ MEF. и Ctr1 −/− MEF (рис.3 C и D ), при этом обнаруживая изменения в лабильной меди при добавлении экзогенной меди ( SI Приложение , рис. S17). Этот результат можно объяснить потенциальными различиями в загрузке зонда в 2 клеточные линии MEF, что еще больше подчеркивает самокалибрующийся характер логометрического зонда FCP-1 как критической функции для точного определения уровней аналита в различных биологических образцах. Наконец, мы проверили, может ли FCP-1 разрушить лабильные пулы меди, измерив уровни белка CCS в MEF, обработанных FCP-1 или BCS, последний в качестве положительного контроля для снижения содержания меди в клетках и повышения стабильности белка CCS. Действительно, уровни белка CCS не изменились в клетках, обработанных концентрацией FCP-1, достаточной для визуализации клеточных лабильных пулов Cu, в то время как обработка BCS увеличивала CCS, как и ожидалось ( SI, Приложение , рис. S18), подтверждая, что FCP-1, сам по себе не изменяет клеточные уровни меди в этих условиях. Данные демонстрируют, что FCP-1 может контролировать базальные уровни эндогенного лабильного Cu(I) и истощение таких пулов в ответ на снижение поглощения меди клетками с помощью генетических или фармакологических средств.}

FCP-1 определяет динамическое изменение лабильного Cu(I) по сравнению с общими пулами меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе.

Принимая во внимание специфичность состояния окисления FCP-1 по отношению к Cu(I), мы исследовали влияние клеточного окислительно-восстановительного статуса на лабильные пулы Cu(I), которое остается недостаточно изученным. Во-первых, мы подтвердили способность FCP-1 обнаруживать изменения в лабильных уровнях Cu(I) в клетках HeLa при обработке CuCl ₂ и BCS (рис. 4 A ). Затем мы отслеживали эффект добавления аскорбата, который является мощным восстановителем, на внутриклеточные лабильные пулы Cu(I).Интересно, что мы наблюдали статистически значимое увеличение соотношения FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} , что свидетельствует об увеличении уровней лабильного Cu(I) в обработанных аскорбатом клетках по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 В ) (31). Поскольку сопутствующие измерения ICP-MS не показали изменений общего уровня меди в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными носителями (рис. 4 C ), увеличение F _{зеленого} / F _{оранжевого} может быть объясняется повышением уровня лабильного Cu(I).Несколько потенциальных факторов могут способствовать этому наблюдению в ответ на этот экзогенный восстанавливающий агент, включая сдвиг в глобальном или локальном окислительно-восстановительном балансе Cu(I)/Cu(II), пониженную клеточную или субклеточную способность буферировать Cu(I) и /или релокализация/рекомпарментализация лабильных пулов Cu(I).

Рис. 4.

FCP-1 идентифицирует изменения лабильного Cu(I), но не общего содержания меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе. Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa, предварительно обработанных ( A ) контролем растворителя, CuCl ₂ (200 или 300 мкМ) или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 ч или ( B ) контролем растворителя, аскорбатом (1 мМ) или BSO (1 мМ) в полной среде в течение 4 часов.Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин и визуализировали с λ _ex = 458 нм. На гистограммах показана средняя клеточная логометрическая эмиссия FCP-1, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , определенная из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Общие клеточные уровни ⁶³ Cu определяли с помощью экспериментов ICP-MS (с нормализацией различных количеств клеток по общему клеточному уровню ³¹ P). Столбики погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 и **** P < 0,0001 и не показывают изменений ни при лечении аскорбатом, ни при обработке BSO.

Имея в руках эти результаты, мы затем попытались использовать FCP-1 для изучения потенциальных связей между поддержанием лабильных пулов Cu(I) и эндогенными центральными окислительно-восстановительными медиаторами в клетке. В этом контексте глутатион (GSH) является вездесущим природным антиоксидантом и ключевой малой молекулой для поддержания надлежащего окислительно-восстановительного статуса клетки (71).Определяющая скорость стадия биосинтеза GSH включает глутаматцистеинлигазу (GCL), которая может ингибироваться бутионинсульфоксимином (BSO) (72). Интересно, что мы наблюдали, что соотношение FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} было выше в обработанных BSO клетках HeLa по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 B ), что указывает на увеличение лабильных Уровни Cu(I) при блокировке синтеза GSH. Более того, общие внутриклеточные уровни меди существенно не отличались между клетками, предварительно обработанными BSO, и контрольными клетками, как показано с помощью ICP-MS (фиг.4 C ), показывая, что динамические изменения происходят в лабильном пуле Cu(I), а не в общем увеличении или уменьшении общего пула меди. В целом, мы предостерегаем от чрезмерной интерпретации этих данных как подтверждающих простую и прямую модель комплексообразования Cu(I)-глутатион, хотя было обнаружено, что водные растворы FCP-1 и Cu(I) показывают более высокие значения F ₅₂₆ / Соотношения F ₅₇₆ при более низких концентрациях GSH in vitro ( SI Приложение , рис. S19), переменные значения константы диссоциации и стехиометрии медь-лиганд, полученные в различных буферных условиях, предполагают более сложное взаимодействие между путями металлического и окислительно-восстановительного гомеостаза (7 , 22, 73). Действительно, GSH является не только восстанавливающим агентом, но также сообщается, что он взаимодействует с металлошаперонами, такими как ATOX1, или металл-буферными/поглощающими белками, такими как металлотионеин, с образованием комплексов, которые могут прочно связывать медь (73⇓⇓–76). Следовательно, наблюдаемое увеличение лабильных уровней Cu(I) в результате дефицита GSH может действовать через более сложные косвенные механизмы, что требует дальнейшего изучения.

Для дальнейшего изучения корреляции между лабильным пулом Cu(I) и измененным метаболизмом GSH мы подготовили для исследования 2 клеточные линии MEF, где одна линия демонстрирует более низкие уровни общего GSH за счет стабильного генетического нокдауна эндогенного Gclc (каталитическая субъединица фермент, ограничивающий скорость GCL в синтезе GSH), а другая линия демонстрирует более низкие уровни GSH и более низкое соотношение восстановленного и окисленного GSH (GSH/GSSG) посредством нокдауна глутатионредуктазы ( Gsr ; НАДФН-зависимый фермент, расщепляющий дисульфидная связь на 2 окисленных молекулах GSH) (71, 77). Как и ожидалось, нокдаун эндогенного Gclc , опосредованный короткой шпилечной РНК (кшРНК) (рис. 5 A и B ), значительно снижал общий уровень GSH до степени, аналогичной MEF, обработанным BSO, который сильно ингибирует ферментативную функцию GCLC. , по сравнению с нецелевым скрембл-контролем ( Scr ) MEF (рис. 5 C ). Важно отметить, что в этих клетках с нокдауном Gclc не наблюдается значительных изменений в соотношении GSH/GSSG, несмотря на более низкие уровни общего GSH (рис.5 Д ). Напротив, генетический нокдаун Gsr с помощью кшРНК значительно снижал как общий уровень GSH, так и соотношение GSH/GSSG, в то время как обработка ингибитором GSR кармустином (бис-хлорэтилнитрозомочевина, BCNU) лишь значительно снижала соотношение GSH/GSSH (рис. 5). C–F ), что указывает на колебания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса в сторону более окислительной среды при отсутствии способности регенерировать GSH из GSSG.

Рис. 5. Визуализация

FCP-1 показывает увеличение или истощение лабильных пулов Cu(I), вызванное генетическими изменениями общего глутатиона (GSH) или соотношения восстановленного/окисленного глутатиона (GSH/GSSG).( A ) Нормализованная экспрессия qPCR Gclc мРНК и ( B ) иммуноблот-детекция GCLC или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих нецелевую контрольную кшРНК ( Scr ) и Gclc кшРНК. ( C и D ) Количественное определение общего клеточного глутатиона (GSH, микромолярный) или отношение GSH к GSSG (GSH/GSSG) ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA, Gsr , или Scr , обработанный 1 мМ BSO или 0.1 мМ BCNU. Уровни GSH и GSH/GSSG определяли с использованием набора для анализа GSH/GSSG-Glo, а результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11). ( E ) экспрессия qPCR Gsr мРНК и ( F ) иммуноблот-детекция GSR или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr и Gsr кшРНК. ( G ) Репрезентативные конфокальные флуоресцентные изображения MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA, инкубированные FCP-1.( H ) Количественное определение нормализованной средней флуоресценции FCP-1 ( F _{зеленый} / F _{оранжевый} ) ± SEM. Данные взяты из анализа 98 отдельных клеток. ( I ) Предлагаемая модель изменений в ферментах биосинтеза глутатиона и окислительно-восстановительного стресса, влияющих на биодоступность лабильных пулов Cu(I). ( J ) Общие уровни Cu (частей на миллион, ppm), определенные с помощью ICP-MS в MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc кшРНК или Gsr кшРНК на массу образца ± стандартная ошибка среднего ( n = 6) .Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. * P < 0,05, ** P < 0,01 и **** P < 0,0001; нс, статистически незначимо.

После подтверждения успешного манипулирования либо уровнями GSH, либо соотношением GSH/GSSG FCP-1 применяли для исследования относительных уровней лабильного Cu(I) в этой панели генетически определенных клеточных линий. Клетки с нокдауном Gclc показали более высокое соотношение FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} по сравнению с клетками Scr , в то время как более низкое значение FCP-1 F _{зеленый} Соотношение _{оранжевый} наблюдали в клетках с нокдауном Gsr по сравнению с контролем (фиг.5 G и H ). Поскольку нокдаун Gclc ингибирует фермент, участвующий в определяющей скорость стадии биосинтеза GSH, и имитирует фармакологическое лечение с помощью BSO (рис. 4 B ), мы приписываем наблюдаемое увеличение F _{зеленому} / F _{. отношение оранжевого} к снижению общего уровня GSH. Минимальное изменение отношения GSH/GSSG в этой клеточной линии с нокдауном Gclc предполагает, что общее окислительно-восстановительное состояние клетки не затрагивается, и вместо этого указывает на снижение уровней лабильных Cu(I)-буферных систем (рис. 5 I ). Включены потенциальные аддукты GSH-металлошаперон или GSH-металлотионин, оба из которых могут влиять на слабосвязанные пулы Cu(I) по сравнению с прочно связанными. С другой стороны, нокдаун-клетки Gsr показали более низкое соотношение GSH/GSSG (рис. 5 D ), что отражает более общую окислительную внутриклеточную среду и может привести к сдвигу динамического баланса Cu(I/II). ) пулов, что приводит к снижению уровня лабильного Cu(I) (рис. 5 I ). Хотя общие уровни GSH также снижаются в клетках с нокдауном Gsr , что может в некоторой степени повышать биодоступность лабильного Cu(I), статистически значимое снижение соотношения FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} относительно контроля указывает на общий лабильный дефицит Cu(I) и предполагает, что окислительно-восстановительный вклад большего количества GSSG по сравнению с GSH является доминирующим фактором.Поскольку механизм обнаружения на основе активности FCP-1 основан на кислородозависимой окислительно-восстановительной реакции с Cu(I), мы провели дополнительную серию контрольных экспериментов с использованием ранее описанного медного флуоресцентного зонда включения, Copper Fluor-4 (CF4). , который действует по прямому обратимому механизму, основанному на связывании Cu(I) (14). CF4 показал повышенную флуоресценцию в нокаутных клеточных линиях Gclc , но снизил флуоресценцию в нокаутных клетках Gsr , что хорошо согласуется с результатами, полученными с FCP-1 ( SI Приложение , рис.S20), обеспечивая дополнительную поддержку изменений в лабильных пулах Cu(I), вызванных изменениями статуса GSH и GSH/GSSG. Наконец, в то время как лабильные пулы Cu(I) изменяются в MEF без Gclc или Gsr , никаких изменений в общем содержании меди при измерении с помощью ICP-MS не наблюдалось (рис. 5 J ). Эти эксперименты показывают, что лабильные пулы Cu(I) могут увеличиваться и/или истощаться глутатион-зависимым образом в зависимости как от общего уровня GSH, так и от окислительно-восстановительного отношения GSH/GSSG.

Онкогенные мутации BRAF

^V600E и KRAS ^G12 приводят к лабильному дефициту Cu(I), частично обусловленному снижением экспрессии GSR и сниженной способностью регенерировать GSH.

Отметив растущие связи между сигнальными путями меди и киназы, участвующими в онкогенезе, мы затем попытались применить идентификацию перекрестных помех медь-глутатион к онкогенезу. Действительно, быстрая пролиферация, связанная с онкогенезом, требует от раковых клеток увеличения энергетического метаболизма и запуска клеточных механизмов для ответа на онкогенный стресс для поддержания неограниченного роста опухоли, выживания и терапевтической резистентности.Например, многие солидные опухоли демонстрируют повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) в ответ на более высокие потребности в энергии и митохондриальную дисфункцию. В результате это вызывает антиоксидантную программу по детоксикации АФК и поддержанию более надежного окислительно-восстановительного баланса (78). Например, MEF, экспрессирующие условные онкогенные аллели KRAS ^G12D или BRAF ^V619E , демонстрируют пониженные уровни внутриклеточных АФК с сопутствующим увеличением экспрессии мРНК генов метаболизма глутатиона Gclc и Gclm (79). Более того, эктопическая экспрессия KRAS ^G12D повышала общий уровень GSH, но снижала соотношение GSH/GSSG. Однако вопрос о том, изменяют ли онкогенные мутации в BRAF или KRAS внутриклеточные пулы лабильного Cu(I) путем нарушения внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса, в частности, посредством глутатионовых путей, остается недостаточно изученным.

Чтобы ответить на этот вопрос, иммортализованные MEF трансформировали с помощью BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , а уровни внутриклеточного лабильного Cu(I) оценивали с помощью ратиометрической визуализации FCP-1.Интересно, что мы наблюдали снижение средней клеточной логометрической флуоресценции как BRAF ^V600E , так и KRAS ^G12D -трансформированных клеток MEF по данным FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый 903 контрольные конгенеры (рис. 6 A и B ). Эти результаты были фенокопированы в экспериментах по визуализации живых клеток с использованием комплементарного зонда CF4, что позволяет предположить, что слабосвязанные пулы внутриклеточного Cu(I) уменьшаются при онкогенной трансформации ( SI Приложение , рис. S21 A и B ). В соответствии с этим мы обнаружили, что стабильность белка CCS, который расщепляется Cu-зависимым образом, повышается в клетках, стабильно экспрессирующих эти онкогены, или при обработке клеток хелатором Cu BCS в качестве положительного контроля, что свидетельствует об истощении лабильных внутриклеточных Медные бассейны (рис. 6 C ). Чтобы определить, отражается ли наблюдаемый лабильный дефицит Cu(I), обнаруженный с помощью изображений FCP-1 и CF4 живых клеток, в изменениях общего уровня Cu в клетках, была проведена ICP-MS на контроле, BRAF ^V600E — или KRAS ^{. G12D} -экспрессирующие MEF, и эти клетки показали неизмененные уровни общего Cu (фиг.6 D ), подтверждая, что лабильный пул Cu(I) избирательно изменен, а не общий пул Cu. Кроме того, уровни транскриптов Ctr1 в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D остаются такими же, как и в контрольных клетках, что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение уровней лабильного Cu(I) не связано с изменениями клеточного импорта Cu (рис. 6). Е ). Хотя уровни транскриптов Atp7a были незначительно ниже как в клетках BRAF ^V600E , так и в клетках KRAS ^G12D (фиг.6 F ), эти изменения в экспрессии мРНК Atp7a могут отражать клетки, чувствительные к более низким биодоступным уровням Cu(I). В качестве альтернативной гипотезы дифференциальной экспрессии переносчиков Cu CTR1 и ATP7A для снижения лабильных уровней Cu(I) недавние исследования установили, что снижение уровней CTR1 или введение поверхностно-доступных мутаций в MEK1, который функционирует ниже онкогенного BRAF ^V600E , поскольку подход к нарушению связывания Cu снижал передачу сигналов, управляемую BRAF ^V600E , и рост опухоли (5, 80).Таким образом, взаимодействие Cu-MEK1/2 имеет важное значение для BRAF ^V600E -управляемой передачи сигналов и онкогенеза, а снижение лабильных уровней Cu в MEF, трансформированных BRAF ^V600E , потенциально может быть вызвано повышенной доставкой Cu к MEK1/2 для поддержки гиперактивированного передача сигналов митоген-активируемой протеинкиназы. Чтобы экспериментально рассмотреть эту возможность, MEF, трансформированные BRAF ^V600E , были сконструированы для стабильной экспрессии скремблированной кшРНК или Mek1 кшРНК с РНК-опосредованным интерференционно-устойчивым MEK1 дикого типа или Cu-связывающим мутантом MEK1 (MEK1 ^CBM ). и ратиометрическую флуоресценцию FCP-1 в этих клеточных линиях сравнивали с нетрансформированными MEF.В то время как экспрессия BRAF ^V600E снижала экспрессию F зеленого / F оранжевого примерно на 20%, снижение сохранялось в присутствии MEK1 дикого типа и MEK1 ^CBM , что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение в присутствии MEK1 дикого типа и MEK1 ^CBM лабильный пул Cu(I) не зависит от связывания MEK1/2 Cu ( SI Приложение , рис. S22).}

Рис. 6.

Онкогенный BRAF ^V600E и KRAS ^G12D приводят к уменьшению лабильных пулов Cu(I) за счет снижения уровней Gsr и увеличения экспрессии CCS. ( A ) Представитель Ratiometic Ise-Cell Визуализация FCP-1 на МЭФ, стабильно экспрессируя Nontargeting Control Shrna ( SCR ), BRAF ^V600E CDNA, или KRAS

7 G12D CDNA. ( B ) Количение среднего флуоресценции FCP-1 ( F _F F 7 Orange ) ± SEM от MEFS стабильно экспрессирует SCR , BRAF V600E CDNA, или KRAS ^G12D кДНК.Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. Данные взяты из анализа 105 или более отдельных клеток. ( C ) Обнаружение иммуноблота CCS или актина в МНФС. Количественное определение: ΔCCS/ACTIN нормализовано до Scr . Результаты трех независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t .( D ) Количественная оценка средних уровней Cu (части на миллион, PPM) Обнаружены ICP-MS от MEFS стабильно экспрессируют SCR , BRAF , BRAF ^V600E CDNA, или KRAS G12D CDNA на массу образца ± стандартная ошибка среднего ( n = 5). Результаты сравнивались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. ( e и e и f ) qpcr Выражение CTR1 или ATP7A мРНК от МЭФС стабильно экспрессирует SCR , BRAF , BRAF ^V600E CDNA, или KRAS ^G12D CDNA.( н = 4). Результаты сравнивались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. ( G и H ) Количественное определение общего клеточного глутатиона (GSH, мкМ) или отношения GSH к GSSG (GSH/GSSG) ± SEM из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^{3 V600E или кДНК KRAS G12D . Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11).Данные взяты из 4 биологических повторов, проведенных в трех повторностях. ( I и J и J ) QPCR Эксплуатация GSR или GSR мРНК от МЭФС стабильно экспрессирует SCR , BRAF , BRAF}

CDNA, или KRAS

7 G12D CDNA. Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n = 4). Данные взяты из 4 биологических повторов, проведенных в трех повторностях.( K ) Обнаружение иммуноблота GCLC, GSR или актина в МЭФ, стабильно экспрессия SCR , BRAF V600E

0 CDNA, или

KRAS ^G12D CDNA. Количественное определение: ΔGCLC/ACTIN или ΔGSR/ACTIN, нормализованные к Scr . Результаты трех независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t . ( L ) проточный анализ цитометрии уровня роли, количественно, количественный со средним визумиком Cellrox Зеленая флуоресцентная интенсивность ± SEM от MEFS стабильно экспрессирует SCR , BRAF BRAF

0 CDNA, или KRAS

0 G12D кДНК. Результаты сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета ( n ≥ 11). * P < 0,05, ** P < 0,01 и **** P < 0,0001; нс, статистически незначимо. ( M ) Предполагаемые эффекты онкогенной активации BRAF ^V600E или KRAS ^G12D на биодоступность лабильных пулов Cu(I).

Учитывая наши общие результаты, которые показывают, что Cu(I) кажется менее биодоступным в контексте онкогенной трансформации, мы предположили, что различия в метаболизме глутатиона могут быть движущей силой фенотипа.С этой целью мы протестировали общие уровни GSH и отношения GSH/GSSG в MEF, трансформированных онкогенными BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , и обнаружили, что экспрессия любого из онкогенов увеличивает общий уровень GSH, хотя статистически значимо только в KRAS ^G12D. клеток (рис. 6 G ). К нашему удивлению, отношения GSH/GSSG были значительно ниже в BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , стабильно экспрессирующих MEF, по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 H ).Поскольку MEF, трансформированные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , фенокопировали генетический нокдаун Gsr в отношении сниженной логометрической флуоресценции от FCP-1 и уменьшенного отношения GSH/GSSG, уровни мРНК Gsr и экспрессия белка были допрошен. При нормализации к контрольным клеткам уровни транскриптов Gsr были значительно снижены при стабильной экспрессии либо BRAF ^V600E , либо KRAS ^G12D , тогда как уровни транскриптов Gclc оставались относительно неизменными среди них (фиг.6 I и J ). Параллельно с уровнями транскрипта Gsr экспрессия белка GSR была снижена в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Напротив, уровни белка GCLC были выше в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Чтобы дополнительно подтвердить связь между онкогенезом, гомеостазом меди и изменениями экспрессии фермента метаболизма глутатиона, как BRAF ^V600E , так и KRAS ^G12D значительно увеличили уровни зеленой флуоресценции CellROX (рис. 6 L ), предполагая, что онкогенная трансформация увеличивает АФК и, в свою очередь, уменьшает лабильный пул Cu(I). Из этих данных мы делаем вывод, что клетки, трансформированные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , обнаруживают лабильный дефицит Cu(I) отчасти из-за сниженных уровней Gsr и повышенных уровней АФК, которые оба могут способствовать более окисленному клеточной среде из-за невозможности регенерировать GSH (рис. 6 M ).

Заключительные замечания

Сложное и динамическое взаимодействие между лабильным и общим пулами металлов оказывает влияние на гомеостаз металлов и дисрегуляцию металлов в здоровых и болезненных состояниях.Медь представляет собой яркий пример этой дихотомии сигнал / стресс, поскольку ее мощная окислительно-восстановительная активность делает ее важным питательным веществом, но та же самая химическая реактивность делает потерю гомеостаза меди опасной для окислительно-восстановительного баланса клетки. Чтобы удовлетворить потребность в новых химических инструментах для исследования лабильных пулов меди, которые будут использоваться в сочетании с дополнительными традиционными методами определения общего содержания меди, мы разработали FCP-1, логометрический FRET-зонд первого поколения, основанный на активности, который позволяет селективно визуализировать лабильные Cu(I) накапливается в живых клетках с самонастраивающимся ответом. FCP-1 использует классический мотив бионеорганического лиганда TPA для Cu(I)-зависимого расщепления, чтобы регулировать FRET между единицами донора флуоресцеина и единицами акцептора родамина дозозависимым образом, обеспечивая высокую специфичность металла и состояния окисления для Cu(I). Благодаря своему логометрическому ответу FCP-1 способен визуализировать динамические изменения уровней лабильного Cu(I) в живых клетках при добавлении меди и/или хелатировании, а также отслеживать снижение уровней эндогенного лабильного Cu(I) в клетках с дефицитом MEF. в транспортере меди CTR1.Действительно, логометрическое считывание FCP-1 с внутренней самокалибровкой по 2 сигнатурам излучения является ключевой отличительной чертой для мониторинга базальных уровней лабильного Cu(I) в разных клеточных линиях, так как контрольный зонд FL-TPA использует те же триггер на основе активности, но реагирует только в режиме интенсивности при 1 считывании эмиссии, не может различать лабильный статус Cu(I) между линиями CTR1 дикого типа и линиями нокаута CTR из-за изменчивости загрузки зонда.

На этом фоне мы применили FCP-1 для визуализации изменений в лабильных пулах Cu(I) в условиях окислительно-восстановительного стресса, уделяя особое внимание связи между гомеостазом меди и глутатиона.Действительно, мы наблюдали повышенные уровни лабильного Cu(I) в нокдаунных клетках Gclc , которые обладают меньшим количеством общего GSH по сравнению с соответствующими контролями дикого типа, тогда как мы обнаружили более низкие уровни лабильного Cu(I) в Gsr . нокдаун клеток по сравнению с контрольными конгенерами. Эти данные визуализации отслеживают значительное снижение отношения GSH/GSSG в клетках с нокдауном Gsr , но не в клетках с нокдауном Gclc . Более того, мы выявили снижение соотношения GSH/GSSG в MEF, трансформированных онкогенным BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , что, в свою очередь, вызывает лабильный дефицит Cu(I).В сочетании с тем фактом, что общие уровни меди остаются неизменными в нокдауне Gclc или Gsr и онкогенных клеточных линиях BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , и что мы также наблюдаем более высокую экспрессию белка CCS, который может прочно связывать медь. и более низкие уровни лабильного Cu(I), логометрические измерения флуоресценции FCP-1 показывают, что онкогенная трансформация избирательно влияет на пул лабильного Cu(I) по сравнению с общим пулом меди. Выявив связи между пулом лабильного Cu(I), метаболизмом глутатиона и онкогенной трансформацией, эта работа обеспечивает отправную точку для дальнейшего изучения того, как и почему истощение уровней лабильного Cu(I) может способствовать развитию и прогрессированию рака.Наконец, это исследование мотивирует разработку зондов на основе активности для логометрического обнаружения более широкого набора целевых аналитов в биологических условиях, где самокалибровка может оказаться полезной.

Китай. физ. лат. (2019) 36(3) 038701

Прямое наблюдение за связыванием молекул клеточной адгезии Усовершенствования для манипулирования ДНК с помощью оптического пинцета Сочетание манипулирования одиночными молекулами и обнаружения одиночных молекул Количественное моделирование и оптимизация магнитных пинцетов Динамический комплекс репарации ДНК, наблюдаемый с помощью коррелятивных наноманипуляций с одной молекулой и флуоресценции Пара магнитных пинцетов высокого разрешения с подсветкой эванесцентного поля полного отражения и ее применение в исследовании геликазы ДНК Исследование процесса G-квадруплекса с разрешением Блума с использованием магнитного пинцета высокого разрешения с подсветкой полного внутреннего отражения Изучение биологии с помощью силы: измерения отдельных молекул с высоким разрешением с помощью оптического пинцета Практическое руководство по одномолекулярному FRET Магнитный пинцет: микроманипуляция и измерение силы на молекулярном уровне ДНК-хеликазы семейства PIF1 подавляют опосредованную R-петлей нестабильность генома в генах тРНК Pif1 семья hehe Дрожжевая ДНК-хеликаза Pif1p преимущественно раскручивает РНК-ДНК-субстраты Размотка и перемотка: двусторонняя спираль?

1
[2]	Marshall B T, Long M, Piper J W, Yago T, McEver RP and Zhu C 2003 Nature 423 190
[3]	Li C и Li J 2015 Китай. физ. лат. 32 108702
[4]	Кордова Дж. К., Дас Д. К., Мэннинг Х. В. и Ланг М. Дж. 2014 Curr. мнение Структура биол. 28 142
[5]	Lipfert J, Hao XM and Dekker NH 2009 Biophys. J. 96 5040
[6]	Graves E T, Duboc C, Fan J, Stransky F, Leroux C M and Strick T R 2015 Nat.Структура Мол. биол. 22 452
[7]	Wang S, Zheng H Z, Zhao Z Y, Lu Y and Xu CH 2013 Acta Phys. Грех. 62 168703 (на китайском языке)
[8]	Zhao Z Y, Xu C H, Li J H, Huang X Y, Ma J B and Lu Y 2017 Acta Phys.Грех. 66 188701 (на китайском языке)
[9]	Capitanio M и Pavone F S 2013 Biophys. J. 105 1293
[10]	Roy R, Hohng S and Ha T 2008 Nat.Методы 5 507
[11]	Gosse C and Croquette V 2002 Biophys. J. 82 3314
[12]	Tran PLT, Pohl TJ, Chen CF, Chan A, Pott S and Zakian VA 2017 Nat. коммун. 8 15025
[13]	Paeschke K, Bochman M L, Garcia P T, Cejka P, Friedman K L, Kowalczykowski S C and Zakian V A 2013 Nature 497 458
[14]	Boulé J B and Zakian V A 2007 Nucl.Кислоты рез. 35 5809
[15]	Li J H, Lin W X, Zhang B, Nong D G, Ju H P, Ma J B, Xu C H, Ye F F, Xi X G, Li M, Lu Y, Dou S X 2016 Nucl. Кислоты рез. 44 4330

.