Сравнение лада гранта и лада калина 2: Отличия Гранты и Калины, что лучше Lada Kalina или Lada Granta

Лада Калина или Гранта, сравнение, чем Lada Kalina отличается от Lada Granta

 

Lada Kalina и Лада Granta: разные машины от одного производителя

Хэтчбек Лада Калина имеет более современный дизайн. Седан Лада Гранта отличается оформлением представительского класса. Lada Kalina привлекает новыми бамперами, хромированными накладками над противотуманками, симпатичной светотехникой. Lada Granta имеет более узкие, вытянутые фары головного освещения с небольшими секциями дневных ходовых огней и крупными отражателями галогеновых ламп. Хэтчбек радует хорошей обзорностью и эргономикой. Удобная посадка водителя и просторные сиденья сзади, на которых можно комфортно себя чувствовать даже во время длительной поездки. Гранта может оснащаться регулировкой руля, подогревами стекол, зеркала и дивана, бортовым компьютером и другими полезными опциями.

Технические характеристики оппонентов

Под капотом обоих автомобилей расположены 1,6-литровые бензиновые моторы, максимальная мощность которых достигает 106 лошадиных сил. Возможно наличие механической, автоматической или роботизированной коробки передач. С 98-силовым двигателем комплектуется только автомат, а робот доступен в топовых версиях. При этом хэтчбек на механике отличается мощностью в 82 л. с. Сходные особенности моделей:

  • привод – передний;
  • подвески – пружинные, передние – независимые, задние – полунезависимые;
  • задние тормоза – барабанные;
  • марка топлива – АИ-95;
  • объем топливного бака – 50 л.

В некоторых исполнениях Калина оснащена подушкой безопасности пассажира, сидящего впереди. Модель оснащена функцией индикации температуры наружного воздуха, прикуривателем, противосолнечным козырьком, климатической системой, аудиосистемой, кондиционером. Седан укомплектован датчиками света и дождя, мультимедийным центром с сенсорным дисплеем. В обеих моделях доступна установка алкозамка, не дающего запустить мотор в нетрезвом состоянии. Есть штатные решения для крепления детского кресла.

Где выгодно обновить авто?

Autospot сотрудничает с лучшими автосервисами и салонами. На сайте большой выбор интересных модификаций, которые можно приобрести на выгодных условиях. Жители Москвы и Санкт-Петербурга могут рассчитывать на приятные бонусы. Менеджеры сайта готовы проконсультировать клиентов. Подходящая машина бронируется, чтобы покупатель мог осознанно принять решение. Сервис гарантирует соблюдение договоренностей со стороны продавца. Каждый пользователь получает такие преимущества:

  • скидки на плановое техобслуживание и ремонт;
  • оформление КАСКО по уменьшенной стоимости;
  • мойка за половину цены.

На автоплощадке представлены кредитные программы от известных банков для сравнения. Достаточно только отправить заявку в режиме онлайн, дождаться одобрения и получить требующуюся сумму. Можно подать анкеты сразу в разные финансовые организации, чтобы увеличить шансы. Автокредиты предлагается с пониженными ставками, в отличие от потребительских.

Услуга выкупа авто по Трейд-ин также доступна пользователям платформы. Персональный менеджер внимательно выслушает всю информацию о старом автомобиле и пожелания по новому, подберет автосалон, в котором можно будет пройти профессиональную диагностику, получить оценку и забрать другой автомобиль, доплатив разницу. Чтобы обновить автопарк посредством Autospot в своем городе, нужно заполнить форму, указав марку, характеристики и ценовой диапазон. На рассмотрение будут предложены несколько лотов. Каждую модель можно будет испытать после записи на тест-драйв. Приятным подарком станет скидка до 12%.

Сравнение Mazda 3 и Lada Kalina. Что лучше?

Двигатель и трансмиссия

Количество цилиндров

4

Количество цилиндров

4

Клапанов на цилиндр

4

Клапанов на цилиндр

4

Расположение цилиндров

Рядное

Расположение цилиндров

Рядное

Производительность

Мощность двигателя

116 л. с. при 4000 об/мин

Мощность двигателя

106 л.с. при 5800 об/мин

Крутящий момент

270 Нм при 1600-2600 об/мин

Крутящий момент

148 Нм при 4000 об/мин

Ускорение от 0 до 60 м/ч

10.3 с

Ускорение от 0 до 60 м/ч

13.1 с

Максимальная скорость

194 км/ч

Максимальная скорость

178 км/ч

Объем двигателя

1759 см3

Объем двигателя

1596 см3

Разгон от 0 до 100 км/ч

10. 3 с

Разгон от 0 до 100 км/ч

13.1 с

Расход топлива

Расход топлива (смешанный режим)

4.1-4.2 л/100 км

Расход топлива (смешанный режим)

6.7 л/100 км

Расход топлива на трассе

3.8 л/100 км

Расход топлива на трассе

5. 5 л/100 км

Расход топлива в городе

4.6-4.9 л/100 км

Расход топлива в городе

8.8 л/100 км

Объем топливного бака

51 л

Объем топливного бака

50 л

Подача топлива

Дизель Commonrail

Подача топлива

Многоточечный впрыск

Выбросы

Вес и обьемы

Вместимость багажника со сложенными сидениями

330-334 л

Вместимость багажника со сложенными сидениями

355 л

Вместимость багажника с разложенными сидениями

1019 л

Вместимость багажника с разложенными сидениями

670 л

Максимальная разрешенная масса

1898 кг

Максимальная разрешенная масса

1560 кг

Максимальная масса буксируемого прицепа без тормозов

600 кг

Максимальная масса буксируемого прицепа без тормозов

450 кг

Максимальная масса буксируемого прицепа с тормозами

1300 кг

Максимальная масса буксируемого прицепа с тормозами

900 кг

Количество мест

5

Количество мест

5

Другое

Габариты

Колесная база

2725 мм

Колесная база

2476 мм

Шасси и колеса

Размер шин

195/65 R15; 205/55 R16; 205/50 R17

Размер шин

225/55 R16

Размер колесных дисков

6J x 15; 6J x 16; 6J x 17

Размер колесных дисков

7J x 16

Отзыв владельца автомобиля LADA (ВАЗ) Kalina 2016 года ( II ): Cross 1.

6 MT (106 л.с.)
Ч. 1.  Новое начало

Отдавши Ладу Гранту ("Норма+", 87 л.с., 2012 год, 85 тыс км) в трейд ин,  - отзыв есть тут  - 4/85 Лада Гранта -  https://my.auto.ru/review/61162215/) - - я по старой схеме (без КАСКО) оформил кредит  и купил конечно же.....Ладу.  Ладу Калину Кросс, Норма, 106 л.с., оранжевую. 

Выбор простой. Езжу я большей частью один. На работу - 14,5 км. - это по будням. На "малую родину", где у нас с братом остался дедовский дом, построенный ещё после войны, родители похоронены  -  130 км. Из них - 129 км - по асфальту, 3 км чистят не всегда, а крайний километр - грунтовая дорога, по которой ходит с/х техника, гоняют скот и т.д. 

На Гранте проблем не было. Шкода Октавия Тур (нравится мне) справилась бы тоже хорошо, но и Калина Кросс те же задачи порешает недорого. 

Один месяц уже проездил и первую тысячу откатал. К  Гранте за 4 года привык, ни разу она меня не подвела, в неё, если не считать восстановления после аварии (вина не моя) я вообще не вкладывался, вот с ней и буду сравнивать. 

Ч.2 Качество езды

"+" разница по двигателям - 19 л.с. и эта разница чувствуется. На Гранте можно было разгоняться за счет длинной второй - до 60-70 км /час. Если на 40 км.ч переключиться на третью - двигатель дох, темп разгона терялся. На Калине (хотя и не кручу больше 3 тысяч оборотов - обкатываюсь) можно уверенно разгоняться и на третьей (пятую тоже, кстати, производитель не рекомендует включать до 1500 км).

"+"  коробка. Коробка не воет. Её слышно в тех же местах, где и у Гранты, но это приемлемо. При разгоне не напрягает, при торможении двигателем на второй - чуть громче, но терпимо.  Рычаг коробки не мечется у колена. 

"+" главная пара в коробке. Здесь другое передаточное число. Это также добавляет приемистости.

"-" главная пара в коробке. При равномерном движении на 60 км/час на 3 передаче - обороты 2800- 2900 - это многовато, расход 5,2-5,5 л/100 - по компьютеру.  Если переключиться на 4-ую - обороты будут 2100-2200 - этого мало, хотя расход 4,2-4,5.  Приходится ехать или  50 на третьей, или больше 65 км.ч - на четвертой - а это уже превышение. При нынешних конских штрафах - не айс. Камеры счастья ещё стоят повсюду...

"+" подвеска. Подвеска пожестче, чем у Гранты. На "лежащих полицейских" задок потряхивает, но кажется более собранной что-ли..

"+"  радиус колес 15, литье (у Гранты был 14 литье летом, 14 штампы - зимой)

"-"  радиус колес 15 - штампованных дисков таких для Калины Кросс нет.  Сразу стояли шины Пирелли - Россия, поменял на тех же дисках на Саву. По снегу гребет уверенно, можно трогаться в горку. По льду при торможении начинает строчить АБС.

Ч.3 Интерьер

"+" интерьер качественнее. Пластик в Гранте - даже на вид дешевый, гулкий и неприглядный. Очень легко царапается.  Ручка в бардачке сразу сломалась. В Калине  он смотрится и ощущается попристойнее, царапать пока не пробовал. 

"+" сиденья. В Калине они качественнее. Они набиты лучше, и отделка практичнее - есть кожзам, сидеть удобнее (рост у меня 172 см. ). В Гранте все сидушки были в затяжках, набивка подушки заднего сиденья крошилась.

 

"-" слишком много оранжевого. Надо запрятать в чехлы.

"+" универсал, салон субъективно побольше, лучше чувствуются габариты при парковке.

"-" багажник. Здесь его нет. С багажником Гранты сложно тягаться - 4 своих колеса легко - с запасом - помещались.

"+" спинка сиденья 60:40, легче складывается.

Ч. 4 Комфорт (?)

"+" климатическая установка. В Калине она а) производительнее  б) не такая шумная. В мороз машина прогревается гораздо быстрее. Есть подогрев зеркал. Подогрев передних сидений. Можно ехать через 5 минут, как завелся. Уже тепло, к этому времени лед с лобовухи легко счищается. 

"+" показания температуры ОЖ. В Гранте об этом можно было только догадываться.

"+" концевики стоят на всех дверях. На приборке есть лампочка, если одна из дверей - не закрыта - горит (если поставить на сигнализацию с незакрытой дверью - погудит) В Гранте - концевик только на двери водителя. 

"-" пачкаешься, когда закрываешь дверь багажника. Не за что взяться.

Ч. 5. Разное

"-" щетки отстойные. Чистят плохо. В мороз дубеют. Щетка со стороны пассажира короткая -оставляет много нечищенного стекла перед пассажиром, щетка на пятой двери не прилегает к стеклу, большой свободный ход поводка.

"+" релинги. 

"+" побольше уплотнителей на дверях, шумоизоляция заметно лучше.

"-" звук штатной магнитолы слабоват. В Гранте ставил колонки dls.

"+" когда включаешь задний ход автоматом приглушается звук магнитолы. Мелочь а приятно.

"+" накладки на пороги в салоне. В Гранте выползали ковры постоянно из-под крепления.

"+" обвес. Гранты постоянно страдала от тележек у магазинов, дверями на стоянке царапали, бампера покоцанные - на стоянке 2 раза кто-то притерся. 

"-" полная масса больше 1,5 тонн (всего на пару десятков кг) - увеличение пошлины на допуск к движению

"-" в Беларуси это иномарка.  Повышенная ставка по страховке. Гранта, впрочем, тоже. Если в техпаспорте ВАЗ - для Беларуси это отечественный авто.

"+" гарантия на кузов от сквозной коррозии. У Калины - 6 лет. У Гранты - было 3 года, а на четвертый она прогнила до дыр (см. отзыв 4/85 Лада Гранта), хотя стразу делал антикор.

Примечание: Пока в инструкции по эксплуатации  производитель заявляет, что коррозия по кузову 

1) возможна, 2) не является (!!!???)  показателем качества продукции, тут большого прорыва ждать не приходится.

"?" расход. Пока неясно.  У Гранты было 7.2 - 7.4 л. на 100 км (по компьютеру), 50:50 город-трасса. Здесь - 9.0 (обкатка, по трассе практически не езжу пока)

Ч. 6 Ещё раз о выборе.

Общее впечатление:  Гранта даже в максимальной комплектации - это машина "для совсем бедных" (вариант: вторая машина, но тогда смысла нет в максимальной комплектации, самая простая стоит 5,8 тыс. долларов ).  Калина в средний комплектации - машина "для не совсем бедных", не "полный фарш",  конечно, маленькая, но всё необходимое для гражданской жизни есть.  

Лада Веста=те же агрегаты "+" новая упаковка (кузов) "-" проходимость

Лада Х Рей= тот же двигатель + тележка от Рено (!? - румыны нашли способ увеличить продажи за счет ВАЗа), ездит как Рено Степвей.

Рено -- Дастер великоват, мне незачем как бы (хотя к дизельному присматривался), Степвей - просто не нравится.

Шкода Рапид / ФВ Поло = "+" устойчивость к коррозии "-" проходимость (им Ситроен С-Елисе реальный конкурент - 9,4 сек до 100 км.ч., но быстрее дешевеет, низкая ликвидность б/у).

Пока думаю, что выбор правильный.  В общем, покатаюсь, подожду Ладу Весту универсал кросс 1,8 МКП ...

Слишком маленький, чтобы его увидеть? Не РАДУЙТЕСЬ!

То, что что-то нельзя увидеть, не означает, что это нельзя изучить.

Введение в нанотехнологии — крошечные структуры, которые ученые могут создавать для изучения и решения микроскопических задач.

Дженнифер Стил, доктор философии, заведующая кафедрой и профессор физики, по этой причине любит изучать нанотехнологии. «Мы делаем молоток для очень специальных гвоздей, — объясняет Стил. — Мы смотрим на проблему, для решения которой нужен новый инструмент, и мы разрабатываем структуру, которая поможет нам лучше понять проблему и решение.

Лаборатория Стила в настоящее время изучает перенос энергии флуоресцентного резонанса (FRET) — метод, который ученые могут использовать для измерения относительного расстояния между микроскопическими молекулами, такими как белки в наших клетках, которые находятся на расстоянии всего лишь нанометров или ангстрем друг от друга. FRET может сделать это на основе взаимодействия между парным набором флуоресцентных молекул. Если молекулы находятся достаточно близко друг к другу, одна молекула, донор, отдает свою энергию другой молекуле, акцептору, для создания флуоресцентного сигнала, испускающего яркий свет.«Вы можете использовать эту передачу энергии как своего рода нанометровые линейки — очень, очень точные линейки», — добавляет Стил.

Но, по словам Стила, яркий свет не всегда является достаточно сильным сигналом. Ее работа сосредоточена на усилении этого сигнала. Большая часть текущей работы, связанной с FRET, сосредоточена на использовании инженерных наночастиц, которые имеют один широкий оптический резонанс, который может усиливать сигнал от многих длин волн или цветов света. Однако Стил считает, что это может быть чрезмерным упрощением.Ее группа студентов-исследователей работает над созданием наноструктурированных поверхностей с узкими оптическими резонансами, которые могут двигаться во всем диапазоне длин волн света. Таким образом, они смогут лучше понять физику процесса и, таким образом, смогут лучше усиливать флуоресцентную сигнализацию FRET.

Для поддержки своих исследований Стил получила трехлетний грант в размере 257 090 долларов США от Отдела исследования материалов Национального научного фонда. Грант включает около 70 000 долларов на новое оборудование, а также восемь летних стипендий для студентов Тринити в течение следующих трех лет.Хотя из-за COVID-19 Стил отстает от графика на несколько месяцев, она планирует начать сбор данных предстоящей весной.

«Поскольку большая часть работы для FRET вращается вокруг этих структур, которые имеют один оптический резонанс, а структуры, которые мы делаем, имеют их целый ряд, я чувствовал, что [другие исследователи] не улавливают всей картины». — говорит Стил. «И именно это стремление не пускать этот вопрос в голову дает вам мотивацию написать грант, а затем выполнить работу.Я думаю, что они что-то упускают в интерпретации, и мы собираемся это выяснить».

Аннотация

Фон

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) между вариантами зеленого флуоресцентного белка (GFP) CFP и YFP широко используется для обнаружения белок-белковых взаимодействий. В настоящее время доступно несколько мономерных флуоресцентных белков с красным смещением, которые потенциально повышают эффективность FRET.

Методология/Основные выводы

Чтобы обеспечить параллельное сравнение нескольких комбинаций флуоресцентных белков для обнаружения FRET, желтые или оранжевые флуоресцентные белки были напрямую слиты с красными флуоресцентными белками. FRET от желтых флуоресцентных белков к красным флуоресцентным белкам был обнаружен как с помощью FLIM, так и с помощью дегашения донора при фотообесцвечивании акцептора, что показывает, что mCherry и mStrawberry были более эффективными акцепторами, чем mRFP1. Циркулярные пермутированные варианты желтого флуоресцентного белка показали, что в тандемных конструкциях ориентация дипольного момента перехода влияет на эффективность FRET.Кроме того, было продемонстрировано, что оранжевые флуоресцентные белки mKO и mOrange подходят в качестве донора для исследований FRET. Наиболее благоприятной оранжево-красной парой FRET была mKO-mCherry, которая использовалась для обнаружения гомодимеризации субъединицы p65 NF-κB в одиночных живых клетках с трехкратно более высоким контрастом времени жизни и вдвое более высокой эффективностью FRET, чем для CFP-YFP.

Выводы/значение

Наблюдаемая высокая эффективность FRET пар с красным смещением согласуется с увеличенным радиусом Фёрстера до 64 Å, что значительно выше, чем радиус Фёрстера обычно используемой пары CFP-YFP. Таким образом, пары FRET со смещением в красную сторону предпочтительнее для обнаружения белок-белковых взаимодействий методами FRET на основе доноров в одиночных живых клетках.

Образец цитирования: Goedhart J, Vermeer JEM, Adjobo-Hermans MJW, van Weeren L, Gadella TWJ Jr (2007) Чувствительное обнаружение гомодимеров p65 с использованием красных смещенных и флуоресцентных пар FRET на основе белков. ПЛОС ОДИН 2(10): е1011. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001011

Академический редактор: Вэньцин Сюй, Вашингтонский университет, Соединенные Штаты Америки

Получено: 22 августа 2007 г.; Принято: 20 сентября 2007 г .; Опубликовано: 10 октября 2007 г.

Авторские права: © 2007 Goedhart et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Часть этой работы поддерживается интегрированным проектом ЕС «Молекулярная визуализация» LSHG-CT-2003-503259. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Слияния флуоресцентных белков широко используются для изучения локализации и динамики белков в живых клетках [1], [2]. Разработка спектральных вариантов позволяет изучать множественные слияния флуоресцентных белков одновременно в одной клетке [3], [4]. Более того, спектральные варианты можно использовать для мониторинга белок-белковых взаимодействий или конформационных изменений с помощью переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) [5], [6].FRET — это процесс, при котором возбужденный (донорный) флуорофор релаксирует обратно в основное состояние путем безызлучательной передачи своей энергии другому (акцепторному) хромо- или флуорофору [7], [8]. Самая популярная пара флуоресцентных белков для измерения взаимодействий или изменений конформации состоит из голубого флуоресцентного белка (CFP) в качестве донора и желтого флуоресцентного белка (YFP) в качестве акцептора. Было сделано несколько улучшений спектральных свойств CFP и YFP [9]–[12], которые увеличили эффективность FRET этой пары.

Применение пары CFP/YFP для обнаружения FRET было очень успешным, однако некоторые характеристики этой пары не оптимальны. Во-первых, синее возбуждение, необходимое для CFP, может вызывать значительный уровень аутофлуоресценции. Во-вторых, многоэкспоненциальный спад CFP усложняет анализ FRET по измерениям времени жизни. Кроме того, флуоресцентные белки могут подвергаться фотоконверсии или обратимому фотообесцвечиванию [13]. При перемещении длины волны возбуждения в сторону красного цвета уровни аутофлуоресценции обычно снижаются.

Другим преимуществом пар с красным смещением является тот факт, что эффективность FRET обычно увеличивается для пар на более высоких длинах волн. Это вызвано большим радиусом Фёрстера из-за зависимости λ 4 в интеграле перекрытия J(λ) уравнения Фёрстера (R 0 в Å): (1) в котором κ 2 — ориентационный фактор , n — показатель преломления среды, Q D — квантовый выход донора и J(λ) (в M −1 см −1 нм 4 ) определяется как: (2) F D (λ) – спектр флуоресценции донора, ε A (λ) – спектр поглощения акцептора, λ – длина волны [8].

Первым шагом к красному смещению пар FRET была идентификация красного флуоресцентного белка DsRed [14]. Однако существование зеленого промежуточного состояния при созревании и тетрамеризации красного флуоресцентного белка было серьезной проблемой для приложений FRET. Разработка мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP1) решила проблемы медленного и неполного созревания и облигатной тетрамеризации DsRed [15]. Впоследствии mRFP1 был улучшен для получения новых красных флуоресцентных белков, названных mCherry и mStrawberry, с повышенной фотостабильностью, скоростью созревания и коэффициентом экстинкции [16]. Из-за их относительно высокого коэффициента экстинкции эти белки являются привлекательными акцепторами FRET для доноров желтого/оранжевого цвета. Хотя появились некоторые исследования, в которых для изучения FRET используются желтые и красные флуоресцентные белки [17]–[20], подробное параллельное сравнение нескольких комбинаций для обнаружения FRET в отдельных живых клетках все еще отсутствует. Поэтому наша цель состояла в том, чтобы выяснить, обеспечивают ли пары FRET с красным смещением превосходные альтернативы паре CFP/YFP для обнаружения белок-белковых взаимодействий в отдельных живых клетках.

С этой целью была создана серия тандемных конструкций, в которых донор был слит непосредственно с акцептором, при этом линкер оставался одинаковым, чтобы обеспечить как можно более объективное сравнение между парами. Эти тандемные конструкции позволяют напрямую сравнивать эффективность FRET между различными парами, поскольку (i) пара FRET присутствует в выражении 1∶1, и (ii) расстояние/ориентация между конструкциями максимально схожи из-за одинаковых линкеров. Подобные подходы были использованы для характеристики FRET в парах CFP-YFP, и эти тандемные конструкции могут быть потенциально полезны в качестве стандартов FRET [21], [22].

Очень надежным способом измерения FRET в живых клетках является определение времени жизни донорного флуорофора в возбужденном состоянии с помощью микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) [23]–[25]. Поэтому FLIM использовался для количественной оценки эффективности FRET пар. Кроме того, варианты YFP с циклической перестановкой использовались в качестве доноров для изучения возможных эффектов ориентации на эффективность FRET. Наконец, пара FRET, которая оказалась наиболее эффективной на основе R 0 и измерений тандемных конструкций в клетках с помощью FRET, была использована для измерения гомодимеризации субъединицы NF-κB p65 в живых клетках.

Результаты

Расчет радиусов Фёрстера

Радиус Фёрстера (R 0 ) пары FRET определяется как расстояние, на котором происходит 50% передачи энергии, и является основным показателем качества для пары FRET. Поскольку мы постоянно наблюдали более высокую эмиссию флуоресценции для очищенного mKO по сравнению с mOrange при равном поглощении, мы повторно оценили их квантовые выходы. Для mOrange мы нашли значение 0,67, что соответствует опубликованному значению [16].Однако для mKO мы нашли значение 0,74, что существенно выше опубликованного значения 0,60 [26]. В настоящее время у нас нет объяснения этому несоответствию, и для расчета радиусов Фёрстера использовалось значение 0,74. Что касается донорного квантового выхода и акцепторного коэффициента экстинкции других флуоресцентных белков, то использовались их опубликованные значения [10], [16].

Радиус Ферстера R 0 и интеграл перекрытия J(λ) пар FRET, использованных в этом исследовании, были рассчитаны согласно уравнениям 1 и 2 соответственно и показаны в таблице 1.Был использован показатель преломления воды (n = 1,33), и мы установили коэффициент ориентации κ 2 равным 2/3 (представляющий случайную ориентацию донорного и акцепторного дипольных моментов), чтобы можно было провести сравнение по литературе. Следует отметить, что расчетные значения R 0 могут отличаться от фактических значений R 0 из-за другого значения фактора ориентации [24]. Тем не менее, представленные значения R 0 позволяют провести беспристрастное количественное сравнение с радиусами Фёрстера, рассчитанными для других пар FRET.Интеграл перекрытия можно использовать для расчета R 0 для других значений κ 2 и n с использованием уравнения 1.

Из таблицы можно сделать вывод, что все пары имеют значение R 0 , которое значительно выше, чем R 0 популярной пары ECFP-EYFP (около 47 Å), и выше, чем у улучшенного SCFP3A-. Пара SYFP2 (54 Å) [10]. Это можно объяснить более высоким квантовым выходом желтых и оранжевых доноров по сравнению с ECFP и SCFP3A, а также компонентой λ 4 в интеграле перекрытия, которая в целом увеличивает ферстеровский радиус для пар в красной части видимого спектра.Основываясь на значениях R 0 , mStrawberry является предпочтительным акцептором для SYFP2, а оранжево-красная пара с самым высоким значением R 0 , равным 64 Å, представляет собой mKO-mCherry.

Конструирование пар флуоресцентных белков

Тандемные слитые белки с красными флуоресцентными белками, mRFP1 [15], mStrawberry и mCherry [16] в качестве акцепторов FRET, были сконструированы, как показано на рисунке 1. В качестве доноров мы использовали недавно описанный вариант желтого флуоресцентного белка SYFP2 [10] или оранжевые флуоресцентные белки mKO [26] и mOrange [16].Сходные линкеры внутри группы пар использовали, чтобы избежать зависимых от линкера различий в эффективности FRET между парами. Подробности о парах флуоресцентных белков и последовательности линкеров можно найти в дополнительной таблице (таблица S1).

Рисунок 1. Схематический обзор конструкций тандемных флуоресцентных белков, использованных в этом исследовании.

Красный флуоресцентный белок, сокращенно RFP, представляет собой mRFP1, mStrawberry или mCherry. Однобуквенные аббревиатуры используются для обозначения аминокислот, входящих в состав линкера.

https://doi. org/10.1371/journal.pone.0001011.g001

FLIM слитых белков донора YFP

Слияния тандемных флуоресцентных белков, несущие красный флуоресцентный белок в качестве акцептора, были экспрессированы в клетках HeLa. Через один день после трансфекции эффективность FRET в живых клетках исследовали с использованием микроскопии флуоресцентной визуализации в течение жизни (FLIM) в частотной области. Этот подход дает два времени жизни: фазовое время жизни (τ ϕ ), определяемое по фазовому сдвигу испускаемого света, и время жизни модуляции (τ Μ ), определяемое по уменьшению глубины модуляции испускаемого света по сравнению со светом возбуждения. 23].Эффективность FRET тандемной конструкции можно рассчитать по уменьшенному времени жизни донора (τ ϕ или τ Μ ) относительно времени жизни флуоресценции нетушенного донора в соответствии с уравнением 3. Это дает два значения эффективности FRET, одно из которых основано на τ ϕ и еще один на основе τ Μ .

Клетки, которые экспрессировали только донор (SYFP2), показали время жизни гомогенной фазы около 3,1 нс, аналогичное значению, описанному ранее [10]. Однако клетки, экспрессирующие тандем mStrawberry-SYFP2, показали пониженное время жизни фазы, которое значительно варьировалось от 2.от 2 нс до 2,8 нс (рис. 2а–г). Из карты продолжительности жизни (рис. 2b) видно, что вариация вызвана различиями между отдельными ячейками, а не различиями внутри одной ячейки. Нет никакой корреляции между интенсивностью флуоресценции клеток и временем жизни их флуоресценции, как можно сделать вывод из двумерной гистограммы (рис. 2d), на которой интенсивность отображается в зависимости от времени жизни на попиксельной основе. Изменение продолжительности жизни указывает на изменение эффективности FRET, вероятно, вызванное неполным сворачиванием/созреванием белка акцептора.Поскольку сообщается, что созревание mStrawberry происходит относительно медленно, эксперименты FLIM проводили через два и три дня после трансфекции. Через два дня после трансфекции клетки, экспрессирующие mStrawberry-SYFP2, продемонстрировали низкое и однородно распределенное фазовое время жизни 2,1 нс (рис. 2e–h), которое снова не зависело от интенсивности флуоресценции (рис. 2h). Такой же результат был получен через три дня после трансфекции (данные не показаны). Изменение было специфичным для акцептора mStrawberry, поскольку тандемы mRFP1 и mCherry показали небольшую клеточную вариацию через день после трансфекции.Интересно, что мы не обнаружили гетерогенности во времени жизни флуоресценции при использовании пары YFP-mStrawberry для изучения взаимодействия гетеротримерных G-белков в растительных клетках [17]. Эти клетки инкубируют в течение ночи при комнатной температуре после трансфекции, что свидетельствует о том, что в этой системе более низкая температура способствует сворачиванию или созреванию mStrawberry.

Рисунок 2. Данные FLIM живых клеток, экспрессирующих тандем mStrawberry-SYFP2.

Эксперименты проводили либо через 1 день (а–г), либо через 2 дня (д–з) после трансфекции. На панелях показаны интенсивность флуоресценции SYFP2 (а, д), карта фазового времени жизни SYFP2 (б, е), гистограмма распределения времени жизни (в, ж) и двумерная гистограмма распределения времени жизни в зависимости от интенсивности флуоресценции ( д, з). Представление в искусственных цветах карты времени жизни соответствует цветам, используемым в гистограмме времени жизни. Ширина изображений соответствует 112 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001011.g002

Результаты FLIM-анализа гибридных белков с SYFP2 в качестве донора и красных флуоресцентных белков в качестве акцептора представлены в таблице 2.Время жизни как фазы, так и модуляции явно снижено в конструкциях тандемного слияния, что указывает на FRET. Время жизни донора снижается в большей степени в конструкциях mCherry и mStrawberry по сравнению с конструкцией mRFP1. Более высокая эффективность FRET (рассчитанная по уравнению 3) для акцепторов mCherry и mStrawberry, скорее всего, связана с более высоким коэффициентом экстинкции (ε A , также см. уравнение 2) следующего поколения красных флуоресцентных белков. Следовательно, mCherry и mStrawberry более эффективны, чем mRFP1, как акцепторы FRET.

Акцепторное фотообесцвечивание красных акцепторов

Те же конструкции исследовали на FRET с помощью акцепторного фотообесцвечивания [27] с использованием линии 568 нм Ar/Kr-лазера на коммерческом лазерном сканирующем микроскопе. Для всех трех пар после обесцвечивания акцептора наблюдалось четкое усиление желтой флуоресценции. Эффективность FRET была рассчитана с использованием уравнения 4 и приведена в таблице 3. При сравнении с кажущимися значениями FRET, рассчитанными на основе экспериментов FLIM (таблица 2), становится ясно, что общая тенденция такая же, причем mCherry и mStrawberry значительно лучше. FRET-акцепторы, чем mRFP1.Эффективность FRET, рассчитанная на основе экспериментов по отбеливанию акцептора, значительно выше, чем рассчитанная на основе значений срока службы. Это известное явление, которое можно объяснить тем фактом, что вклады времени жизни не имеют одинакового веса в определенных временах жизни. В результате среднее время жизни, определенное с помощью FLIM, смещено в сторону более высоких времен жизни мультиэкспоненциально затухающих доноров. Подробное обсуждение можно найти в других источниках [28], [29]. В заключение, обесцвечивание акцепторов очень хорошо подходит для идентификации FRET от SYFP2 до красных флуоресцентных акцепторов.

FLIM слитых белков донора YFP с круговой пермутацией

Поскольку FRET является процессом, зависящим от ориентации, мы исследовали роль относительной ориентации хромофора в тандемных конструкциях. С этой целью мы воспользовались наличием вариантов с круговой перестановкой варианта YFP Venus. Эти варианты имеют новые N- и C-концы, введенные в пяти разных местах бета-ствола, тем самым изменяя ориентацию донорного флуорофора [30].

В первую очередь измеряли время жизни флуоресценции только доноров, включая непермутированную Венеру.Результаты суммированы в таблице 4. Интересно, что время жизни как фазы, так и времени модуляции белков с кольцевой пермутацией было выше по сравнению с Венерой, за исключением cpV6, который имеет время жизни флуоресценции, подобное Венере, равное 2,9 нс. Самое высокое время жизни наблюдалось для cpV9, у которого время жизни фазы и модуляции увеличилось на 0,23 нс и 0,28 нс соответственно.

FLIM конструкций mCherry-cpV показывает явно уменьшенное время жизни фазы и модуляции для всех конструкций (таблица 4).В целом эффективность FRET между конструкциями Cherry-cpV выше, чем у конструкции mCherry-SYFP2, вероятно, из-за более длинного линкера в последней конструкции. Время жизни фазы и модуляции уменьшилось наиболее значительно в конструкции mCherry-cpV3, что дало эффективность FRET 42% и 29%, рассчитанную на основе времени жизни фазы и модуляции, соответственно. Самая низкая эффективность FRET была рассчитана для mCherry-cpV9, 30% и 19%, рассчитанные на основе времени жизни фазы и модуляции соответственно.Таким образом, эффективность FRET по отношению к акцептору красного флуоресцентного белка зависит от пермутации донорного флуорофора, что, вероятно, сообщает о различиях в ориентации между переходными диполями донора и акцептора. Эти результаты предполагают, что стоит изучить использование донорных флуорофоров с круговой перестановкой в ​​исследованиях FRET белок-белковых взаимодействий или в репортерах на основе FRET на основе YFP ​​и mCherry.

FLIM оранжевых флуоресцентных белков и фотоконверсия

Поскольку эффективность FRET зависит от перекрытия между спектрами излучения донора и спектрами поглощения акцептора, мы взяли оранжевые доноры, которые смещены в красную сторону по сравнению с YFP.Эффективность FRET для красного акцептора будет увеличена за счет большего интеграла перекрытия (см. таблицу 1). Сначала были охарактеризованы предполагаемые оранжевые флуоресцентные доноры, mOrange и mKO. Время жизни флуоресценции mOrange в живых клетках составило τ ϕ  = 2,7 нс и τ Μ  = 2,9 нс. Время жизни флуоресценции mKO составило τ ϕ  = 3,5 нс и τ Μ  = 3,7 нс, что является относительно высоким временем жизни, как наблюдалось ранее [26]. Случайное открытие было сделано, когда клетки, экспрессирующие mKO, были освещены интенсивным светом с длиной волны 436 нм от ртутной лампы. Удивительно, но эти клетки проявляли зеленую флуоресценцию, а не оранжевую флуоресценцию. Зеленый флуоресцентный вид был стабилен в течение не менее 30 минут. При проведении визуализации времени жизни клеток после освещения светом с длиной волны 436 нм было получено среднее время жизни фазы 1,4±0,04 нс и время жизни модуляции 1,9±0,1 нс (n = 9). Чтобы проверить, является ли это специфичным для mKO или общим свойством оранжевых хромофоров, был приготовлен образец, содержащий клетки, экспрессирующие как mOrange, так и mKO. Эксперимент FLIM на смешанном образце показывает, что клетки, экспрессирующие mKO, можно четко отличить от клеток, экспрессирующих mOrange, на основе контраста при жизни (рис. 3a–d).Наличие двух различных популяций времени жизни также видно из гистограммы 1D (рис. 3c) и гистограммы 2D (рис. 3d), на которых время жизни модуляции отображается в зависимости от времени жизни фазы на попиксельной основе. После воздействия света с длиной волны 436 нм наблюдается поразительный контраст времени жизни между клетками, экспрессирующими mOrange и mKO, возбужденными при длине волны 514 нм (рис. 3e–h). Клетки, экспрессирующие mOrange, демонстрируют такое же время жизни, как и необлученные клетки, но время жизни клеток, экспрессирующих mKO, снизилось почти на 2 нс (сравните рисунок 3f–h с рисунком 3b–d).Кроме того, флуоресценция mKO снизилась до 46% (n = 9), тогда как mOrange уменьшилась только до 75% (n = 6) от исходной интенсивности. Фотоконверсия mKO в зеленый вид является первым примером, в котором, помимо изменения цвета, наблюдается прижизненный контраст. Интересно, что мы также наблюдали фотоконверсию исходного димерного KO (данные не показаны), предполагая, что это преобразование является внутренним свойством хромофора mKO, а не следствием обширного мутагенеза, необходимого для создания мономерного белка [26].К счастью, при воздействии на mKO света >500 нм значительной фотоконверсии не наблюдается. Следовательно, этот белок можно надежно использовать в качестве донора в исследованиях FRET.

Рисунок 3. Данные FLIM клеток, экспрессирующих mKO или mOrange.

FLIM выполняли до (a–d) и после (e–h) воздействия на клетки света с длиной волны 436 нм. На панелях показаны интенсивность флуоресценции (а, д), карта времени жизни модуляции (б, е), гистограмма распределения времени жизни модуляции (в, ж) и двумерная гистограмма зависимости времени жизни фазы от времени жизни модуляции (г, з). ).Представление в искусственных цветах карты времени жизни соответствует цветам, используемым в гистограмме времени жизни. Ширина изображений соответствует 85 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001011.g003

FLIM слитых белков с оранжевыми флуоресцентными донорами

И mOrange, и mKO были слиты с mRFP1 и mCherry в качестве акцепторных флуорофоров. mStrawberry не был включен в качестве акцептора, поскольку спектр его излучения в значительной степени перекрывается со спектром излучения оранжевых флуоресцентных белков, оставляя небольшую спектральную полосу для специфического обнаружения оранжевого донора.Результаты экспериментов FLIM на тандемных конструкциях обобщены в таблице 5. Во всех тандемных конструкциях наблюдается явное сокращение срока службы по сравнению с измерениями только донора. Опять же, тандемные конструкции, содержащие mRFP1 в качестве акцептора, демонстрируют меньшее снижение, чем конструкции mCherry. Конструкция mCherry-mKO показывает наибольшее снижение времени жизни флуоресценции донора; 1,3 нс. Перенос энергии в конструкциях, содержащих mOrange, ниже, чем в конструкциях на основе mKO. Таким образом, mKO более эффективен в качестве донора для FRET красных флуоресцентных белков, чем mOrange.

Обнаружение белок-белкового взаимодействия с помощью пары mKO-mCherry FRET

Предыдущее исследование показало, что гомодимеры факторов транскрипции могут быть обнаружены с помощью FLIM в отдельных живых клетках [31]. Поскольку из структурных исследований и биохимических экспериментов с клеточными экстрактами известно, что комплекс фактора транскрипции NF-κB может существовать в виде гомодимера p65 [32], наша цель состояла в том, чтобы изучить, могут ли гомодимеры p65 быть обнаружены в отдельных живых клетках с помощью FLIM. и сравнить пригодность CFP/YFP по сравнению с mKO-/mCherry. Для этого р65 метили донорными и акцепторными флуорофорами и экспрессировали в клетках. Из-за повышенных уровней экспрессии слияния p65 были преимущественно расположены в ядре для всех конструкций, как можно сделать вывод из фигуры 4 (панели b и e). Результаты экспериментов FLIM, проведенных с использованием ECFP-p65 и EYFP-p65, суммированы на рисунке 4a. Среднее время жизни фазы управления и модуляции ECFP-p65 составило 2,43 ± 0,06 нс и 2,98 ± 0,03 нс, что согласуется с ранее измеренным временем жизни ECFP [10].При котрансфекции EYFP-p65 эти значения лишь незначительно снижались до 2,32 ± 0,08 нс и 2,86 ± 0,05 нс соответственно. Ясно, что в этих экспериментах очень трудно отличить контрольную ситуацию от ситуации FRET.

Рисунок 4. Гомодимеризация p65 может быть обнаружена с помощью FLIM.

Данные о времени жизни нескольких клеток суммированы (а) путем построения графика времени жизни модуляции в зависимости от времени жизни фазы для клеток, экспрессирующих ECFP-p65 (кружки), ECFP-p65 и EYFP-p65 (квадраты), только mKO-p65 (ромбы) ) или клетки, экспрессирующие mKO-p65 и mCherry-p65 (треугольники). FLIM-изображения клеток, экспрессирующих mKO-p65, в отсутствие (b–d) или в присутствии (e–g) mCherry-p65. Панели показывают интенсивность флуоресценции двух объединенных репрезентативных ядер (b, e), карту времени жизни модуляции (c, f) и гистограмму распределения времени жизни модуляции (d, g). Сокращение времени жизни, наблюдаемое для клеток, экспрессирующих как mKO-p65, так и p65-mCherry, связано с FRET, что указывает на гомодимеризацию p65. Ширина изображений соответствует 28 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001011.g004

Затем гибриды mKO-p65 и mCherry-p65 конструировали и экспрессировали в клетках HeLa. Клетки, экспрессирующие mKO-p65, имели контрольную фазу и время жизни модуляции 3,56 ± 0,13 и 3,76 ± 0,03 соответственно, что аналогично наблюдаемому для неслитых mKO (рис. 4a, c, d). Однако клетки, экспрессирующие как p65-mKO, так и p65-mCherry, демонстрировали явно сниженную фазу и время модуляции 3,21 ± 0,12 нс и 3,54 ± 0,06 нс соответственно, которые были однородно распределены по ядру (рис. 4а,е,ж). Сокращение времени жизни донора демонстрирует, что mKO и mCherry находятся в непосредственной близости, указывая на то, что субъединица p65 может гомодимеризоваться в живых клетках. Основываясь на времени жизни фазы, мы обнаружили 10% FRET для пары mKO-mCherry и только 5% для пары ECFP-EYFP.

Обсуждение

В этом исследовании мы систематически охарактеризовали желтые или оранжевые флуоресцентные доноры и красные флуоресцентные акцепторы для обнаружения белок-белковых взаимодействий с помощью FRET. Эти пары обладают рядом преимуществ, включая возбуждение на более высоких длинах волн, снижение аутофлуоресценции и фототоксичности.Расчет R 0 и экспрессия тандемных конструкций показали, что пары с красным смещением демонстрируют относительно высокую эффективность FRET, которую можно обнаружить с помощью FLIM или фотообесцвечивания акцептора.

Характеристика in vivo была выполнена путем конструирования тандемных слитых белков, поскольку это дает контроль над соотношением донора и акцептора (что часто бывает нелегко достичь для исследований двухкомпонентных взаимодействий). Кроме того, выбирая сопоставимые линкеры, мы максимально старались добиться одинаковой ориентации и расстояния между флуорофорами в тандемных конструкциях.Однако следует иметь в виду, что эффективность FRET в тандемных конструкциях может не всегда зависеть от длины линкера [33], поскольку добавление или удаление нескольких аминокислот может изменить ориентацию между донорным и акцепторным дипольными моментами, что очень важно, как обсуждается ниже.

Хотя можно провести сравнение показанных здесь конструкций, результаты не всегда можно напрямую сравнивать с эффективностью FRET, полученной в других исследованиях. Во-первых, линкеры, которые мы и другие используем, различаются между конструкциями, и, следовательно, и расстояние, и ориентация могут быть разными.Чтобы проиллюстрировать влияние ориентации на эффективность FRET в тандемных конструкциях, в качестве доноров использовали варианты YFP с круговой пермутацией. Наблюдалась заметная разница в эффективности FRET между конструкциями, содержащими разные флуоресцентные белки с кольцевой пермутацией. Важно отметить, что эти результаты демонстрируют, что донорные и акцепторные флуорофоры не ориентированы случайным образом друг относительно друга, на что указывалось ранее [24]. Во-вторых, в литературе используются разные методы для измерения эффективности FRET в тандемных конструкциях флуоресцентных белков, что приводит к различной очевидной эффективности FRET.По этой причине мы сознательно выбрали более надежные и количественные методы на основе доноров, то есть FLIM и фотообесцвечивание акцепторов, для измерения эффективности FRET в живых клетках. Акцепторные методы, т.е. так называемые фильтр-FRET [34], [35], осложняются прямым возбуждением акцептора и просачиванием флуоресценции донора в канал детектирования акцептора [25], что требует нескольких поправочных коэффициентов. Кроме того, методы FRET на основе акцептора способствуют высокому квантовому выходу акцептора для увеличения сигнала сенсибилизированного излучения, тогда как для методов на основе донора квантовый выход акцептора не имеет значения.

Относительно высокая эффективность FRET, обнаруженная в одиночных живых клетках, согласуется с большими радиусами Фёрстера, рассчитанными для пар с красным смещением (таблица 1), со значениями до 64 Å для mKO-mCherry. Это улучшение можно объяснить относительно высоким квантовым выходом желтых и оранжевых доноров и компонентой λ 4 в интеграле перекрытия, которая обычно увеличивает ферстеровский радиус для пар в красной части видимого спектра. Как пары FRET со смещением в красную область сравниваются с другими парами FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий? Значения R 0 пар с красным смещением выше, чем для зеленых и желтых акцепторов, включая BFP-GFP и CFP-YFP (включая оптимизированную в нашей лаборатории пару SCFP3A-SYFP2 FRET с R0 54 Å [10]. ]).Также другие пытались повысить эффективность FRET в паре CFP-YFP. Используя скрининг на основе FRET, эффективность FRET конструкции CFP-YFP была оптимизирована, в результате чего была получена оптимальная пара CyPet-Ypet. Однако этот подход не оптимизирует увеличение радиуса Фёрстера, поскольку коэффициенты экстинкции, спектры и квантовые выходы серьезно не изменяются [36]. Причиной увеличения динамического диапазона детекции каспаз на основе FRET с конструкцией CyPet-YPet является более узкий спектр CyPet, уменьшение просачивания донора и, возможно, более оптимальная ориентация двух флуоресцентных белков в тандемной конструкции.Поскольку почти все обнаруженные точечные мутации находятся на поверхности флуоресцентных белков, весьма вероятно, что оптимальная ориентация обусловлена ​​специфическим взаимодействием бета-бочонков CyPet и YPet в одной тандемной конструкции [37]. Как отсутствие изначально более высоких радиусов Фёрстера, так и, что более важно, возможное взаимодействие между белками CyPet и YPet препятствуют применению этой пары для изучения белок-белковых взаимодействий. Особенно для исследований взаимодействия важно избегать любого взаимодействия между парой флуоресцентных белков и как можно большим радиусом Ферстера.

Чтобы улучшить обнаружение FRET, YFP использовался в качестве акцептора для флуоресценции GFP в исследованиях FRET. Благодаря высокому перекрытию, высокому квантовому выходу донора и высокому коэффициенту экстинкции акцептора R 0 увеличивается до 55 Å [38]. Чтобы уменьшить сложность анализа FRET из-за сильного перекрытия, был представлен элегантный подход, в котором использовался нефлуоресцентный «темный» акцептор на основе YFP ​​(R 0  = 59 Å) [39]. Было продемонстрировано, что эта пара подходит для обнаружения белок-белковых взаимодействий с помощью FLIM, недостатком которой является то, что экспрессия акцептора не может быть определена количественно в живых клетках.

Первые пары, включавшие красные мономерные акцепторы, были основаны на EGFP в качестве донора, т.е. EGFP-mRFP1. Хотя EGFP-mCherry представляет собой улучшенную зелено-красную пару (R 0  = 54 Å), она все же значительно менее эффективна для FRET, чем пара SYFP2-mCherry (R 0  = 59 Å), из-за уменьшенного перекрытия. Поэтому использование желтых доноров для FRET для mStrawberry и mCherry является предпочтительным. Недавно сообщалось о новом мономерном ярко-красном флуоресцентном белке, tagRFP, который хорошо подходит в качестве FRET-акцептора EGFP с R 0 58 Å [40].Для повышения эффективности FRET можно использовать мультимерные акцепторы красного (например, YFP/tandem-HcRed, R 0  = 67 Å [41]) за счет увеличения коэффициента экстинкции. Хотя эту стратегию не следует сбрасывать со счетов, т.е. можно также рассмотреть возможность использования tdTomato в качестве акцептора, тандемные димерные акцепторы в этом исследовании не учитывались, поскольку мы считаем предпочтительным использовать только мономерные флуоресцентные белки, избегая увеличения размера слитого белка.

Описанные в этом исследовании мономерные пары FRET со смещением в красную область демонстрируют эффективный FRET и имеют высокие значения R 0 .Поэтому мы считаем, что SYFP2-mStrawberry, mKO-mCherry и mOrange-mCherry являются предпочтительными парами FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий количественными методами FRET на основе доноров в живых клетках. Относительно низкий квантовый выход акцептора будет в некоторой степени ограничивать использование пар FRET, описанных в этом исследовании, для применения в приложениях FRET на основе акцептора, таких как биосенсоры на основе FRET, из которых камелеон [42], [43] является наиболее известным. пример. Для исследований FRET на основе акцепторов (например,соотношение-визуализация), динамический диапазон отклика зависит от R 0 , ориентации донора и акцептора, прямого возбуждения акцептора, просачивания флуоресценции донора в акцепторный канал и чувствительности обнаружения в два канала, которые обычно являются переменными в разных настройках. Следует отметить, что, несмотря на оптимальные свойства, флуоресцентные белки все же требуют внимания. mStrawberry демонстрирует относительно медленное созревание, которое можно решить, удлинив период транзиторной экспрессии.mKO можно фотопреобразовать, но только при высокой интенсивности синего света, чего можно легко избежать.

Преимущества использования пары с красным смещением четко продемонстрированы для обнаружения гомодимеризации субъединицы p65 NF-κB с помощью FRET. Двукратное увеличение эффективности FRET по сравнению с парой ECFP-EYFP наблюдалось при использовании пары mKO-mCherry, что отражает увеличение R 0 этой пары. В заключение мы показали, что пары FRET с красным смещением предпочтительнее для обнаружения белок-белковых взаимодействий методами FRET на основе доноров в одиночных живых клетках.Результаты этого исследования могут служить ориентиром для будущих исследований FRET, направленных на обнаружение белок-белковых взаимодействий в живых клетках.

Методы

Конструирование слияний флуоресцентных белков

mRFP1, mStrawberry, mCherry и mOrange были амплифицированы из бактериальных векторов экспрессии (любезный подарок R.Y.Tsien) и использованы для замены EGFP в векторе pEGFP-C1 (Clontech) для экспрессии в клетках млекопитающих. Для mKO (любезно предоставленного A.Miyawaki) использовалась та же процедура, но в этом случае последние три аминокислоты mKO (AHS) были заменены на последние три аминокислоты GFP (LYK), которые не давали флуоресцентным клеткам при трансфекции. Поэтому были созданы две новые конструкции, в которых либо С-, либо и N-, и С-концы были удлинены подобно тому, что было сделано для серии фруктов [16]. Обе конструкции давали оранжевые флуоресцентные клетки.

SYFP2 амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали в pmRFP1-C1, pmStrawberry-C1 и pmCherry-C1 с использованием сайтов рестрикции KpnI и BamHI. Аналогичная стратегия использовалась для построения пар, в которых донором является mOrange или mKO. Циркулярные пермутированные варианты Венеры (cpV) (любезный подарок А. Мияваки) были вырезаны из YCam 3.20, YC3.30, YC3.60, YC3.70, YC 3.90 (сокращенно cpV2, cpV3, cpV6, cpV7, cpV9 соответственно) с использованием SacI и EcoRI и встроенных в pmCherry-C1 разрез с теми же ферментами. Для получения слияний в рамке полученные векторы разрезали с помощью BglII, а затем 1 мкг разрезанного вектора обрабатывали 5 ед. нуклеазы маша (New England Biolabs) в течение 1 часа при 30°C для удаления выступающих частей и лигировали. Все конструкции были проверены секвенированием. Плазмида, кодирующая p65-EGFP, была любезно предоставлена ​​Дэвидом Нельсоном [44].EGFP заменяли на ECFP, EYFP, mCherry или mKO с использованием сайтов рестрикции AgeI и BsrGI. Для исследования димеризации р65 клетки трансфицировали равными количествами плазмид, кодирующих р65-ECFP и p65-EYFP или p65-mKO и p65-mCherry. Для получения значений продолжительности жизни негашеных доноров клетки однократно трансфицировали p65-ECFP или p65-mKO.

Очистка белков и флуоресцентная спектроскопия

His 6 -меченые белки были получены в E.coli и очищены на His-связывающей смоле (Novagen, Дармштадт, Германия).После элюирования имидазолом белки дважды подвергали диализу против PBS или 20 мМ Трис. Спектральную характеристику проводили, как описано ранее, с небольшими изменениями [10]. Для определения квантового выхода mOrange и mKO разводили в 20 мМ Трис (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА и сравнивали со стандартным Родамином 6G (Molecular Probes, Лейден, Нидерланды) в EtOH (QY = 0,94) [45], [46]. ]. Возбуждение было при 515 нм (ОП<0,05 нм), а эмиссия регистрировалась в диапазоне длин волн 525–730 нм с использованием спектрофлуориметра PTI Quantamaster 2000-4 (Photon Technologies International, Лоуренсвилл, Нью-Джерси) с последующей поправкой на инструментальный отклик [47]. ].Образцы были скорректированы на различия в поглощении на длине волны возбуждения и на различия в показателе преломления (n = 1,329 для H 2 O и n = 1,359 для EtOH).

Подготовка проб

Клетки

HeLa трансфицировали с использованием 1 мкл липофектамина (Invitrogen, Бреда, Нидерланды), 0,5 мкг плазмидной ДНК и 50 мкл OptiMEM на 35-мм чашку с покровным стеклом 24 мм Ø #1. Если не указано иное, образцы визуализировали через 2 дня после трансфекции. Покровные стекла с клетками помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Бреда, Нидерланды) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (pH = 7.4), 137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl 2 , 0,8 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы). Все измерения проводились при комнатной температуре.

Флуоресцентная визуализирующая микроскопия на всю жизнь

Визуализация времени жизни флуоресценции была выполнена с использованием широкопольного подхода в частотной области на самодельном приборе [48] с использованием АОМ с РЧ-модуляцией и усилителя изображения с РЧ-модуляцией (Lambert Instruments II18MD), соединенного с ПЗС-камерой (Photometrics HQ). как детектор. Объектив с увеличением 63x (Планапохромат NA 1.4 масло) использовалось для всех измерений. Частота модуляции была установлена ​​на 75,1 МГц. Двенадцать фазовых изображений со временем экспозиции 50–100 мс были получены в случайном порядке записи, чтобы свести к минимуму артефакты из-за фотообесцвечивания [49]. Для возбуждения на длине волны 514 нм использовали аргон-ионный лазер, который пропускали на образец дихроичным светом с длиной волны 525 нм, а испускаемый свет фильтровали эмиссионным фильтром 545/30 нм. Каждое измерение FLIM калибруется по эталонному измерению отраженного лазерного излучения с использованием модифицированного фильтрующего куба [48] для коррекции дрейфа фазы и модуляции возбуждающего света. Эталон калибруется путем усреднения трех-пяти измерений FLIM свежеприготовленного раствора эритрозина В с концентрацией 1 мг/мл (номер по каталогу 198269, Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Нидерланды) в H 2 O, который имеет известную короткую флуоресценцию. время жизни 0,086 нс [49], [50]. Эта дополнительная калибровка корректирует разницу в длине оптического пути и возможные отражения, связанные с оптикой, которые различаются между FLIM и эталонными измерениями. Из каждого образца получали не менее пяти последовательностей фаз.Из последовательности фаз рассчитываются изображение интенсивности (DC) и изображение времени жизни фазы и модуляции [23] с использованием макросов Matlab. По этим данным определяется среднее время жизни отдельных клеток с помощью ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Затем вычисляются среднее время жизни фазы и модуляции (± стандартное отклонение). Для представления карт жизненного цикла к необработанным данным применяется гладкий фильтр 5×5. Карты времени жизни ложных цветов и гистограммы 1D и 2D генерируются макросом ImageJ.

Фотоконверсию mKO выполняли путем освещения образца в течение 10 с светом от лампы мощностью 100 Вт ртутного столба, отфильтрованной фильтром 436/20 нм. Мощность, измеренная на объективе, составила 20 Вт/см 2 .

Эффективность FRET E рассчитывали согласно: (3), где τ DA — время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора, а τ D — время жизни флуоресценции донора в отсутствие акцептора. Поскольку FLIM в частотной области дает время жизни фазы и время жизни модуляции, эффективность FRET можно рассчитать на основе τ ϕ и τ M .

Дегашение донора при фотообесцвечивании акцептора

Исследования дегашения донора при отбеливании акцептора проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Zeiss LSM510 (Zeiss, Германия). Использовался масляный иммерсионный объектив Zeiss 63x (Plan-Apochrom, NA 1.4). YFP и RFP возбуждались с использованием лазерной линии 488 нм и 568 нм соответственно, которые отражались на образец дихроичным зеркалом 488/568 нм. Вторичная дихроичная (570 нм) разделяла желтую и красную флуоресценцию, которые пропускали через полосовой фильтр 505–550 нм и длиннопропускающий фильтр 585 нм соответственно.Была использована настройка точечного отверстия, соответствующая 2 воздушным единицам, и функция многодорожечной передачи (на кадр) для обеспечения минимальных перекрестных помех. Получение изображений до и после обесцвечивания проводилось при минимальной мощности лазерного возбуждения (AOTF<0,5%) при коэффициенте масштабирования 2, тогда как обесцвечивание красного флуоресцентного белка выполнялось при максимальной мощности (100% 568 нм) с 150 итерациями при масштабировании 2. Среднее значение Интенсивность флуоресценции SYFP2 отдельных клеток до и после обесцвечивания определяли количественно и вычитали фон.Эти значения были использованы для расчета эффективности FRET E в соответствии с: (4), где I до представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции донора с поправкой на фон до обесцвечивания акцептора, а I после представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции с поправкой на фон. донора после отбеливания акцептора.

Благодарности

Эрик Мандерс получил признание за поддержание конфокального микроскопа в хорошем состоянии. Мы благодарим Roger Tsien за любезный подарок красных и оранжевых флуоресцентных белков, Atsushi Miyawaki за любезный подарок вариантов mKO и YFP и David Nelson за любезный подарок p65-EGFP.

Авторские взносы

Идея и разработка экспериментов: JG TG. Выполнял эксперименты: JG JV Lv. Проанализированы данные: JG TG. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: СП МА Лв ТГ. Написал статью: JG TG.

Каталожные номера

  1. 1. Чудаков Д.М., Лукьянов С., Лукьянов К.А. (2005) Флуоресцентные белки как инструмент для визуализации in vivo. Тенденции биотехнологии 23: 605–613.
  2. 2. Zhang J, Campbell RE, Ting AY, Tsien RY (2002) Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии.Nat Rev Mol Cell Biol 3: 906–918.
  3. 3. Schultz C, Schleifenbaum A, Goedhart J, Gadella TW Jr (2005)Многопараметрическая визуализация для анализа внутриклеточной передачи сигналов. Чембиохим 6: 1323–1330.
  4. 4. Цзянь Р.Ю. (1998) Зеленый флуоресцентный белок. Annu Rev Biochem 67: 509–544.
  5. 5. Miyawaki A (2003)Визуализация пространственной и временной динамики внутриклеточной передачи сигналов. Ячейка разработчиков 4: 295–305.
  6. 6. Jares-Erijman EA, Jovin TM (2006)Визуализация молекулярных взаимодействий в живых клетках с помощью микроскопии FRET.Curr Opin Chem Biol 10: 409–416.
  7. 7. Förster T (1948) Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluorescenz. Энн Физ 2: 55–75.
  8. 8. Страйер Л. (1978) Передача энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Annu Rev Biochem 47: 819–846.
  9. 9. Griesbeck O, Baird GS, Campbell RE, Zacharias DA, Tsien RY (2001) Снижение чувствительности желтого флуоресцентного белка к окружающей среде. Механизм и приложения. J Biol Chem 276: 29188–29194.
  10. 10. Кремерс Г.Дж., Гоэдхарт Дж., Ван Мюнстер Э. Б., Гаделла Т.В. младший (2006)Голубые и желтые суперфлуоресцентные белки с улучшенной яркостью, укладкой белка и радиусом Форстера FRET. Биохимия 45: 6570–6580.
  11. 11. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Нац. биотехнология 20: 87–90.
  12. 12. Rizzo MA, Springer GH, Granada B, Piston DW (2004)Улучшенный вариант голубого флуоресцентного белка, полезный для FRET.Nat Biotechnol 22: 445–449.
  13. 13. Синнекер Д., Фойгт П., Хеллвиг Н., Шефер М. (2005)Обратимое фотообесцвечивание усиленных зеленых флуоресцентных белков. Биохимия 44: 7085–7094.
  14. 14. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г. и др. (1999) Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Nat Biotechnol 17: 969–973.
  15. 15. Кэмпбелл Р.Е., Тур О., Палмер А.Е., Штайнбах П. А., Бэрд Г.С. и др. (2002)Мономерный красный флуоресцентный белок.Proc Natl Acad Sci U S A 99: 7877–7882.
  16. 16. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, et al. (2004)Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из Discosoma sp. красный флуоресцентный белок. Nat Biotechnol 22: 1567–1572.
  17. 17. Adjobo-Hermans MJ, Goedhart J, Gadella TW Jr (2006) Гетеротримеры белка G растений требуют двойных липидных мотивов G {альфа} и G {гамма} и не диссоциируют при активации.J Cell Sci 119: 5087–5097.
  18. 18. Гальперин Е., Верхуша В.В., Соркин А. (2004) Треххромофорная FRET-микроскопия для анализа мультибелковых взаимодействий в живых клетках. Нат-методы 1: 209–217.
  19. 19. He L, Wu X, Simone J, Hewgill D, Lipsky PE (2005)Определение тримеризации фактора, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли, в живых клетках с помощью CFP->YFP->mRFP FRET, обнаруженного с помощью проточной цитометрии. Нуклеиновые кислоты Рез. 33: e61.
  20. 20. Wu X, Simone J, Hewgill D, Siegel R, Lipsky PE, et al.(2006) Одновременное измерение активности двух каспаз в живых клетках с помощью нового двойного флуоресцентного индикаторного зонда FRET. Цитометрия А 69: 477–486.
  21. 21. Доминго Б., Сабариегос Р., Пиказо Ф., Ллопис Дж. (2007) Визуализация стандартов FRET с помощью стационарной флуоресценции и методов продолжительности жизни. Микроск Рес Тех.
  22. 22. Koushik SV, Chen H, Thaler C, Puhl HL 3rd, Vogel SS (2006) Эталонные стандарты Cerulean, Venus и VenusY67C FRET. Биофиз J 91: L99–L101.
  23. 23.ван Мюнстер Э.Б., Гаделла Т.В. (2005)Микроскопия флуоресцентной визуализации (FLIM). Adv Biochem Eng Biotechnol 95: 143–175.
  24. 24. Jares-Erijman EA, Jovin TM (2003) FRET-визуализация. Nat Biotechnol 21: 1387–1395.
  25. 25. Ясуда Р. (2006)Визуализация пространственно-временной динамики передачи сигналов нейронов с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции и микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции. Curr Opin Neurobiol 16: 551–561.
  26. 26. Карасава С., Араки Т., Нагаи Т., Мизуно Х., Мияваки А. (2004)Флуоресцентные белки, излучающие голубой и оранжевый, в качестве пары донор/акцептор для резонансной передачи энергии флуоресценции.Биохим Дж. 381: 307–312.
  27. 27. Bastiaens PI, Majoul IV, Verveer PJ, Soling HD, Jovin TM (1996)Визуализация внутриклеточного транспорта и состояния четвертичной структуры AB5 холерного токсина. Эмбо J 15: 4246–4253.
  28. 28. Ван Мюнстер Э.Б., Кремерс Г.Дж., Аджобо-Херманс М.Дж., Гаделла Т.В. мл. (2005) Измерение резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) путем постепенного фотообесцвечивания акцептора. J Microsc 218: 253–262.
  29. 29. Vermeer JE, Van Munster EB, Vischer NO, Gadella TW Jr (2004)Исследование микродоменов плазматической мембраны в протопластах вигны с использованием липидированных GFP-гибридных белков и многорежимной FRET-микроскопии.Дж. Микроск 214: 190–200.
  30. 30. Нагаи Т., Ямада С., Томинага Т., Итикава М., Мияваки А. (2004) Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca (2+) с помощью желтых флуоресцентных белков с круговой перестановкой. Proc Natl Acad Sci USA 101: 10554–10559.
  31. 31. Имминк Р.Г., Гаделла Т.В. младший, Феррарио С., Бушер М., Ангенент Г.К. (2002) Анализ взаимодействий белок-белок MADS-бокса в живых растительных клетках. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 2416–2421.
  32. 32.Хоффманн А., Натоли Г., Гош Г. (2006) Регуляция транскрипции с помощью сигнального модуля NF-kappaB. Онкоген 25: 6706–6716.
  33. 33. Симозоно С., Хосой Х., Мидзуно Х., Фукано Т., Тахара Т. и др. (2006)Конкатенация голубых и желтых флуоресцентных белков для эффективной резонансной передачи энергии. Биохимия 45: 6267–6271.
  34. 34. Гордон Г.В., Берри Г., Лян Х.Х., Левин Б., Герман Б. (1998) Количественные измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса с использованием флуоресцентной микроскопии. Биофиз J 74: 2702–2713.
  35. 35. Соркин А., МакКлюр М., Хуанг Ф., Картер Р. (2000)Взаимодействие рецептора EGF и grb2 в живых клетках, визуализированное с помощью микроскопии флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). Курр Биол 10: 1395–1398.
  36. 36. Нгуен А.В., Догерти П.С. (2005)Эволюционная оптимизация флуоресцентных белков для внутриклеточного FRET. Nat Biotechnol 23: 355–360.
  37. 37. Охаши Т., Галиаси С.Д., Бриско Г., Эриксон Х.П. (2007) Экспериментальное исследование FRET на основе GFP с применением к внутренне неструктурированным белкам.Белковая наука 16: 1429–1438.
  38. 38. Harpur AG, Wouters FS, Bastiaens PI (2001)Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в отдельных клетках. Nat Biotechnol 19: 167–169.
  39. 39. Ганесан С., Амир-Бег С.М., Нг Т.Т., Войнович Б., Воутерс Ф.С. (2006) Резонансный энергоакцепторный хромопротеин (REACh) на основе темно-желтого флуоресцентного белка (YFP) для резонансной передачи энергии Форстера с GFP. Proc Natl Acad Sci USA 103: 4089–4094.
  40. 40. Мерзляк Э.М., Годхарт Дж., Щербо Д., Булина М.Е., Щеглов А.С., и др.(2007)Яркий мономерный красный флуоресцентный белок с увеличенным временем жизни флуоресценции. Нат-методы 4: 555–557.
  41. 41. Пейкер А., Рокс О., Бастианс П.И. (2005) Визуализация активации двух изоформ Ras одновременно в одной клетке. Чембиохим 6: 78–85.
  42. 42. Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (1999) Динамические и количественные измерения Ca2+ с использованием улучшенных камелеонов. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 2135–2140.
  43. 43. Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA, et al.(1997) Флуоресцентные индикаторы для Ca2+ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина. Природа 388: 882–887.
  44. 44. Нельсон Д.Е., Ихекваба А.Е., Эллиотт М., Джонсон Дж.Р., Гибни К.А. и соавт. (2004)Колебания в передаче сигналов NF-kappaB контролируют динамику экспрессии генов. Наука 306: 704–708.
  45. 45. Фишер М., Джордж Дж. (1996) Квантовый выход флуоресценции родамина 6G в этаноле в зависимости от концентрации с использованием спектрометрии с термолинзой. Письма по химической физике 260: 115–118.
  46. 46. Magde D, Wong R, Seybold PG (2002)Квантовые выходы флуоресценции и их связь со временем жизни родамина 6G и флуоресцеина в девяти растворителях: улучшенные абсолютные стандарты для квантовых выходов. Фотохим Фотобиол 75: 327–334.
  47. 47. Пфайфер Д., Хоффманн К., Хоффманн А., Монте С., Реш-Генгер У. (2006) Набор для калибровки спектральных флуоресцентных стандартов — простой и сертифицированный инструмент для стандартизации спектральных характеристик флуоресцентных приборов.J Fluoresc 16: 581–587.
  48. 48. Ван Мюнстер Э.Б., Гаделла Т.В. младший (2004) phiFLIM: новый метод, позволяющий избежать алиасинга в микроскопии времени жизни флуоресценции в частотной области. Дж. Микроск 213: 29–38.
  49. 49. ван Мюнстер Э.Б., Гаделла Т.В. младший (2004)Подавление артефактов, вызванных фотообесцвечиванием, в частотной области FLIM путем перестановки порядка записи. Цитометрия А 58: 185–194.
  50. 50. Bastiaens PI, van Hoek A, Wolkers WF, Brochon JC, Visser AJ (1992)Сравнение динамических структур липоамиддегидрогеназы и глутатионредуктазы с помощью поляризованной флуоресценции флавина с временным разрешением.Биохимия 31: 7050–7060.

Резонансный перенос энергии флуоресценции — Химия LibreTexts

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) — это специальный метод измерения расстояния между двумя хромофорами, который называется донорно-акцепторной парой. Ограничение FRET состоит в том, что этот процесс переноса эффективен только тогда, когда разделяющее расстояние пары донор-акцептор меньше 10 нанометров. Однако FRET — это явление, сильно зависящее от расстояния, и поэтому оно стало популярным инструментом для измерения динамической активности биологических молекул в наномасштабе.

Введение

FRET — это аббревиатура от Förster (флуоресцентная) резонансная передача энергии. Перенос энергии Фёрстера — это явление, при котором возбужденный донор передает энергию (не электрон) группе акцептора посредством безызлучательного процесса. Этот процесс сильно зависит от расстояния, что позволяет исследовать биологические структуры. Одним из распространенных применений является простое измерение расстояния между двумя интересующими позициями на большой молекуле, обычно биологической макромолекуле, путем присоединения соответствующих донорно-акцепторных групп к большой молекуле.Если большая молекула включает только одну донорную и одну акцепторную группу, расстояние между донором и акцептором можно легко измерить, если в этом процессе не происходит конформационного изменения. Кроме того, если молекула имеет огромное конформационное изменение, можно также измерить динамическую активность между двумя участками этой макромолекулы, например, белковые взаимодействия. Сегодня этот метод широко применяется во многих областях, таких как эксперименты с одиночными молекулами, молекулярные моторы, биосенсоры и механические движения ДНК.FRET также называют «спектроскопической линейкой» из-за его внутреннего удобства.

Теоретический анализ был хорошо разработан Теодором Фёрстером. Этот безызлучательный механизм переноса схематично показан на рисунке \(\PageIndex{1}\). Донорная группа (D) возбуждается фотоном, а затем релаксирует в низшее возбужденное синглетное состояние S 1 (по правилу Каши). Если акцепторная группа не слишком далеко, энергия, высвобождаемая при возвращении электрона в основное состояние (S 0 ), может одновременно возбудить донорную группу.Этот безызлучательный процесс называется «резонансом». После возбуждения возбужденный акцептор испускает фотон и возвращается в основное состояние, если других гасящих состояний не существует.

Рисунок \(\PageIndex{1}\): Схематическая диаграмма резонансной передачи энергии Фёрстера. (CC BY; LibreTexts)

Резонансный механизм связан с кулоновским взаимодействием между электронами. Таким образом, относительное расстояние кулоновского взаимодействия между донорно-акцепторной парой может быть больше, чем передача энергии электронного обмена, которая требует перекрытия волновых функций, а именно передача энергии Декстера.Кулоновское взаимодействие нуждается только в перекрытии спектра, что означает идентичность энергии резонанса. Рисунок \(\PageIndex{2}\) здесь должен дать представление о механизме резонанса. (Обратите внимание, что щель HOMO-LUMO не равна разности энергий между основным состоянием и нижним S 1 возбужденным состоянием молекулы.)

Рисунок \(\PageIndex{2}\): Схематическая диаграмма кулоновских взаимодействий. (CC BY; LibreTexts)

Факторы, влияющие на FRET

Эффективность FRET (\(E\)) — квантовый выход перехода с переносом энергии; я.е., доля события передачи энергии, происходящего на событие возбуждения донора. Эффективность FRET определяется как

. 6} \label{2}\]

, где \(r\) — расстояние между донорными и акцепторными хромофорами, а \(R_o\) — характерное расстояние (расстояние Фёрстера или радиус Фёрстера) с эффективностью переноса 50%.

Перекрытие спектра

Для повышения эффективности FRET группа доноров должна иметь хорошие способности поглощать фотоны и излучать фотоны. Это означает, что донорная группа должна иметь высокий коэффициент экстинкции и высокий квантовый выход. Перекрытие спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора означает, что энергия, теряемая из возбужденного донора в основное состояние, может возбудить группу акцептора. Энергетическое согласование называется явлением резонанса. Таким образом, чем больше перекрываются спектры, тем лучше донор может передавать энергию акцептору.4 \,d\лямбда \метка{3}\]

, где \(F_D(λ)\) — нормированный спектр излучения донора, \(\epsilon_{A}\) стандарты молярного коэффициента поглощения акцептора, а \(λ\) — длина волны.

Рисунок \(\PageIndex{3}\): Схема спектрального перекрытия. (CC BY; LibreTexts)

Ориентация переходных диполей

На механизм резонансной передачи энергии также влияет ориентация диполя эмиссионного перехода донора и диполя поглощения акцептора.{-4} \метка{4}\]

Таблица \(\PageIndex{1}\): расстояния Фёрстера для различных пар донор-акцептор. Сокращения: БФЭ, В-фикоэритрин; CY5, карбоксиметилиндоцианин; дансил, просто дансильная группа; EM, малеимид эозина; FITC, флуорцеин-5-изотиоцианат; LY, люцифер желтый; ODR, октадецилродамин; ТНП-АТФ, тринитрофенил-АТФ.
Донор Акцептор

Расстояние Ферстера (\(R_0\), нм)

Нафталин Дансил 2.2
ЛЕ ТНП-АТП 3,5
Дансил ОДР 4,3
ЛЕ ЭМ 5,3
ФИТЦ ЭМ 6,0
БПЭ CY5 7. 2

Заключение и ограничения FRET

FRET обеспечивает эффективный способ измерения расстояния между донорным и акцепторным хромофором. На эффективность передачи энергии сильно влияет соотношение \(R\) и \(R_0\) из-за показателя степени 6. Таким образом, измеряя эффективность FRET, можно легко получить точное расстояние между донором и акцептором. При правильном выборе донора и акцептора этот эксперимент можно также провести in vivo .Однако FRET дает информацию только о расстояниях. Если происходит резкое конформационное изменение, такое как удлинение или перегиб, он не может знать точное движение донора и акцептора. Кроме того, важно прикрепление хромофоров к точным участкам макромолекулы, как по количеству хромофоров, так и по положению макромолекулы, иначе FRET может давать шумовые сигналы. (см. вопрос 5)

Упражнение \(\PageIndex{1}\)

Филамент F-актина состоит из мономеров G-актина.Присоединив донорный (D) или акцепторный (A) хромофор к мономеру G-актина и измерив эффективность переноса энергии, можно измерить среднее расстояние между мономерами G-актина в пленке F-актина (при условии, что мономеры хорошо расположены в последовательности ДАДАДАДА. …), и можно обнаружить, что средняя эффективность передачи энергии составляет 23%. Если \(R_0\) равно 4,5 нм, каково среднее расстояние между мономерами в нити?

Ответить

5.5 нм.

Упражнение \(\PageIndex{2}\)

Основываясь на вопросе 1, если последовательность нити состоит из 8 мономеров в порядке DADADADA, сколько видов эффективности можно обнаружить, если нить не изгибается и \(R_0\) достаточно велик, чтобы увидеть все их?

Ответить

Будет обнаружено 4 вида эффективности.

Упражнение \(\PageIndex{3}\)

Пара cy3-дорнор и cy5-акцептор прикрепляются к концам последовательности ДНК.Если пренебречь ориентацией переходных диполей донора и акцептора, нарисуйте зависимость между отношением (\(R/R_0\)) и эффективностью передачи энергии.

Ответить

Пожалуйста, посетите веб-сайт профессора Тэкджип Ха. https://netfiles.uiuc.edu/tjha/www/newTechnique.html

Упражнение \(\PageIndex{4}\)

Используйте пример из вопроса 3, а теперь рассмотрите ориентацию переходных диполей.Пожалуйста, постройте зависимость между разделяющим расстоянием пары донор-акцептор и эффективностью передачи энергии. (Помните, что при удлинении ДНК путем добавления пар оснований ориентация донорных и акцепторных хромофоров изменится) (Вопросы 3 и 4 переработаны из статьи, в которой измерялась ориентационная зависимость в процессе FRET с использованием спирали ДНК.

Ответить

См. PNAS, август 2008 г., 105(32), 11176-11181, doi:10.1073/пнас.0801707105

Упражнение \(\PageIndex{5}\)

Одной из самых сложных проблем в области ионных каналов является наблюдение за тем, как канал работает in vivo и за конформационным изменением канала, встроенного в клеточную мембрану. Если ученый хочет исследовать движение ворот ионного канала с помощью FRET, какие факторы следует учитывать? Например, как правильно прикрепить донора и акцептора к точным положениям ворот канала.

Ответить

Открытый вопрос. Пожалуйста, обратитесь к этому вводному документу об использовании FRET для исследования движения ионных каналов. Биофизический журнал, январь 2003 г., 84(1), 1-2, doi:10.1016/S0006-3495(03)74827-9

Сноски

  1. PNAS, 2006 Dec., 103(49), 18458-18463, doi: 10.1073/pnas.0605422103
  2. PNAS, ноябрь 2008 г., 105(47), 18337-18342, doi: 10.1073/pnas.0800977105
  3. Nature Biotechnology 2003, 21, 1387-1395, doi:10.1038/nbt896
  4. PNAS, 2009 Oct., 106(42), 17741-17746, doi: 10.1073/pnas.07106
  5. Природа, 1997 авг., 388, 882-887
  6. PNAS, 2006 Dec., 103(51) 19217-19218, doi: 10.1073/pnas.0609223103
  7. PNAS, август 1967 г.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

2019 © Все права защищены. Карта сайта