Лада 1118: Технические характеристики ВАЗ (Lada) Kalina 1118 седан I

GPVN.RU / Автомобили ВАЗ / Калина / ВАЗ 1118

Фото ВАЗ 1118

ВАЗ 1118 — «седан» семейства Калина.

Характеристика ВАЗ 1118

Автомобиль ВАЗ1118 Калина
Выпусксерийно
Кузов
Тип кузоваседан
Число мест5
Число дверей4
Габариты
Длина, мм4040
Ширина, мм1670
Высота, мм1500
Колесная база, мм2470
Колея колес спереди, мм1430
Колея колес сзади, мм1410
Дорожный просвет, мм160
Шины175/70SR13, 175/65HR14, 185/60HR14
Снаряженная масса, кг1080
Полная масса, кг1555
Полезная нагрузка, кг475
Объем багажника, л420
Объем топливного бака, л50
Двигатель
Модель двигателя11183
Тип двигателяL4
Объем двигателя, см³1596
Мощность, л. с./об.мин58/5600
Крутящий момент, Н·м/об.мин133/2800
Наддув
Клапанов на цилиндр2
Система питанияраспределенный впрыск топлива
Скорость
Максимальная скорость, км/ч170
Разгон до 100 км/ч, с13
Топливо
Расход, л/100 км5,8 (90 км/ч)

LADA 1118 и LADA 1119 вошли в официальный список новинок SIA’2006

LADA 1118 и LADA 1119 названы в официальном списке новинок 14-го Киевского Международного автосалона SIA’2006, который открывается 23 мая в Национальном комплексе »Экспоцентр Украины». Стенд LADA на этом мероприятии подготовлен АВТОВАЗом и генеральным импортером автомобилей LADA в Украине, Торговым Домом »УКРАВТОВАЗ».

Вазовская экспозиция на SIA’2006 занимает весь центральный павильон №1 Национального комплекса »Экспоцентр Украины». На площади более 440 квадратных метров представлены LADA 1118 и LADA 1119, семейства LADA SAMARA и LADA 110, длиннобазовый внедорожник LADA 4X4 (NIVA), а также спортивный автомобиль LADA 1119 SPORT.

23 мая на 14-м Киевском Международном автосалоне SIA’2006 станет Днем АВТОВАЗа. Для представителей средств массовой информации состоится пресс-конференция руководителей ОАО »АВТОВАЗ», будет проведена презентация нового сайта, созданного вазовскими специалистами специально для Украины. На самом стенде в этот день и в течение всей работы автосалона состоятся шоу-программы, конкурсы и викторины. На специально оборудованной площадке пройдут тест-драйвы автомобиля LADA 1118.

Участниками 14-го Киевского Международного автосалона SIA’2006 станут 873 компании, которые разместят свои экспозиции на общей площади 70 тысяч квадратных метров. Каждый посетитель будет иметь возможность принять участие в акции »Приобрети счастливый входной билет — стань владельцем нового авто». Главным призом станет автомобиль LADA 1118 цвета »аспарагус» (такого же, как фирменный цвет автосалона SIA), изготовленный в ОАО »АВТОВАЗ» по специальному заказу компании »УКРАВТОВАЗ» для автосалона SIA’2006.

13 Киевский Международный автосалон SIA’2005 собрал свыше 750 компаний из Белоруссии, Венгрии, Дании, Канады, Китая, Германии, Нидерландов, Польши, России, Словении, США, Турции, Украины, Франции, Швеции, Южной Кореи и других стран. Общая площадь экспозиций составила около 70 тысяч квадратных метров. На SIA’2005 побывало около 430 000 человек.

Киевский Международный автосалон SIA — крупнейшее и самое известное украинское выставочное мероприятие. Оно является единственным в Украине автосалоном, который аккредитован во Всемирной организации производителей автомобилей (OICA). По признанию этой авторитетной международной организации, SIA входит в двадцатку лучших автосалонов мира.

Евгений Веретин, Киев

Группа «АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Renault Group. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО «АВТОВАЗ», а также в Ижевске – ООО «LADA Ижевск».

Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и NIVA. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в 17 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

Vaz 1118 | Автопедия вики

Lada Kalina Sedan (2004-2011)

Ваз 2118 (Lada Kalina Sedan) — первый автомобиль семейства «Лада Калина», выпускавшийся ОАО «АвтоВАЗ» с 18 ноября 2004 года по 1 мая 2011 года. Имеет кузов типа седан.

О самой машине (Запутанная история создания)[]

Автомобилисты не сразу поняли и приняли «Калину». Отчасти в этом виноваты создатели машины, не уделившие достаточного внимания подготовке будущих покупателей, отчасти — стереотипы советских времен, когда выбор автомобилей был небогатым, а классификация предельно простой: есть малолитражки, автомобили среднего класса и представительские авто.

ВАЗ 1111 «Ока» Машину которую реально надо было снять с производства

С 1993 г. по стране стала передаваться новость о том, что ВАЗ готовит новый автомобиль мини-класса. Ничтоже сумняшеся стали считать, что новинка заменит «Оку». 

Уверенность будущих покупателей подкрепилась тем фактом, что в 1995 г. Тольятти снял «Оку» с производства. И когда первые прототипы с названием «Калина» появились на выставках в 1998 г., народ пришел в недоумение. Машина была гораздо крупнее «Оки», а точнее — чуть поменьше «десятки», и уж, конечно, гораздо дороже первой. 

ВАЗ 1119 Прототип (1998)

Так с чем есть «Калину»? Общество дружно решило, что произошла очередная ошибка. Завод лишь усилил путаницу, когда в салонах дилеров появились первые седаны ВАЗ-1118 «Лада Калина», стоившие дороже, чем ВАЗ-2110, машина более крупная и статусная. Конечно, у новинки был ряд преимуществ — маневренность, электроусилитель руля, современный дизайн с хорошей обзорностью, неплохая геометрическая проходимость.

Однако на тех, кто покупал «Калину», смотрели, как на чудаков-эксцентриков. 

Со временем проявились и другие преимущества машины, включая более высокий уровень безопасности и качества. Мало кто знал, что в 2000 г. завод предпринял целую программу комплексной перестройки производства — специально под «Калину».

Широко внедрялись математическое моделирование, электронная конструкторская документация. В результате машина дошла до конвейера быстрее предшественниц. Завод перестроил испытательный центр, и по новым методикам опытные экземпляры «Калины» прошли около 120 испытаний на соответствие 300 международным сертификатам, проехали более 3 млн. км. Доводочные испытания позволили на 10 % улучшить аэродинамику серийной машины по сравнению с первыми прототипами.

ВАЗ 1118 Предсерийный (2001)

Безопасность «Калины», хотя и не дотягивает до средних показателей европейского автопрома, все же соответствует уровню 8,4 балла из 16 максимальных, что гораздо лучше предыдущих моделей ВАЗ.

12 % кузова выполнено из высокопрочных сталей, появились и подушки безопасности. Из других инноваций отметим конические пружины, компенсирующие ухудшение управляемости при большой загрузке машины. Спустя два года после седана появился хэтчбек, а еще через год — универсал. Цена «Калины» пришла в норму относительно «десятого» семейства, а затем и относительно Lada Priora. 

Салон Lada Kalina Sedan

Машина заняла свою нишу — недорогой и относительно современный автомобиль класса В, маневренный и экономичный, с дешевым ремонтом и запчастями. 

Что касается надежности, «Калина» наконец переломила репутацию низкого качества автомобилей из Тольятти.

Стали расти и продажи, и в первой половине 2011 г. «Калина» даже стала самым продаваемым автомобилем в России.

В 2008 г. ВАЗ использовал «Калину» для освоения сегмента «горячих» хэтчбеков, выпустив Lada Kalina Sport. Этот автомобиль собирается на опытном производстве завода тиражом до 2500 экз. в год. Жизнь на конвейере оказалась удивительно короткой для столь удачного автомобиля.

Lada Kalina Sedan (2004-2011)

  В 2011 г., спустя 7 лет после старта, ВАЗ-1118 уступил место новой Lada Granta. Такой короткий цикл жизни модели уже почти соответствует общемировому уровню. Хэтчбек и универсал продолжают выпускать ещё года и после этого в 2013 году произошла полная замена семейства.

ВАЗ 1118 Калина седан технические характеристики


Эксплуатационные характеристики Лада Калина ВАЗ 1118

Максимальная скорость: 170 км/ч
Время разгона до 100 км/ч: 12.9 c
Расход топлива на 100км по городу: 9.8 л
Объем бензобака: 50 л
Снаряженная масса автомобиля: 1080 кг
Размер шин: 175/70 R13

Характеристики двигателя

Рапсоложение: спереди, поперечно
Объем двигателя: 1596 см3
Мощность двигателя: 80 л. с.
Количество оборотов: 5200
Крутящий момент: 120/2700 н*м
Система питания:

Распределенный впрыск
Турбонаддув: нет
Газораспределительный механизм: нет
Расположение цилиндров: Рядный
Количество цилиндров: 4
Количество клапанов на цилиндр: 2
Рекомендуемое топливо: АИ-95

Тормозная система

Передние тормоза: Дисковые
Задние тормоза: Барабанные

Рулевое управление

Тип рулевого управления: Шестерня-рейка
Усилитель руля: Электроусилитель

Трансмиссия

Привод: Передний
Количество передач: механическая коробка — 5

Подвеска

Передняя подвеска: Амортизационная стойка
Задняя подвеска: Продольный рычаг

Кузов

Тип кузова: седан

Количество дверей: 4
Количество мест: 5
Длина машины: 4040 мм
Ширина машины: 1670 мм
Высота машины: 1500 мм
Колея передняя: 1430 мм
Колея задняя: 1410 мм
Дорожный просвет (клиренс): 160 мм
Объем багажника: 400 л

Производство

Год выпуска: с 2004

Блок предохранителей ВАЗ / Lada 1118 (Kalina)

НомерНоминальный ток, AНазначение предохранителя
   
Блок предохранителей расположенных под панелью управления
F110Выключатель аварийной сигнализации
Выключатель света заднего хода
Иммобилизатор
Комбинация приборов
Переключатель наружного освещения
F2 30Электростеклоподъемники передних дверей — контакты реле
F310Выключатель аварийной сигнализации
F420Блок управления электропакетом
Выключатель обогрева заднего стекла
Очиститель ветрового стекла — реле
Очиститель и омыватели ветрового стекла — переключатель, электродвигатель очистителя
F525Отопитель — переключатель электродвигателя (обороты)
Усилитель руля — блок управления
Очистители и омыватели заднего стекла — переключатель
F620Звуковой сигнал — реле
F710Комбинация приборов
Стоп-сигнал — выключатель
Освещение салона — блок
F820Реле включения обогрева заднего стекла (контакты)
F95Габаритные огни — правый борт
Освещение вещевого ящика
F10
5Габаритные огни — левый борт
Включение наружного освещения — сигнализация
Освещение номерного знака
F117,5Задние противотуманные фонари
F127,5Ближний свет — правая фара
Корректор — правая фара
F137,5Ближний свет — левая фара
Корректор — левая фара
F1410Дальний свет — правая фара
Сигнализатор включения света фар в комбинации приборов
F1510Дольний свет — левая фара
F16 
F17 
F18 
F19 
F2015Прикуриватель
F2110Блокировка заднего хода
F2215Блок управления электропакетом
F23 
F24 
F25 
F26 
F3150Блок управления электромеханическим усилителем руля
F32 

Колодки тормозные ВАЗ 1118 Лада Калина

org/Product»> org/Product»>

Код товара: 364442

Колодки тормозные ВАЗ-1118,2170,2190 Калина,Приора,Гранта задние под ABS

Артикул: 1118-3502090 Производитель ALLIED NIPPON ABS1703

Интернет: нет в наличии

Код товара: 627910

Колодки тормозные ВАЗ-1118,2170,2190 Калина,Приора,Гранта задние под ABS PEKAR к-т

Артикул: 1118-3502090 Производитель PEKAR 1118-3502090

Интернет 20 шт.

Код товара: 357781

Колодки тормозные ВАЗ-1118,2170,2190 Калина,Приора,Гранта задние под ABS TRIALLI к-т

Артикул: 1118-3502090 Производитель TRIALLI GF 239

Код товара: 247439

Колодки тормозные ВАЗ-1118,2170,2190 Калина,Приора,Гранта задние под ABS АвтоВАЗ к-т

Артикул: 1118-3502090 Производитель АвтоВАЗ 11180-3502090-55

Интернет 40 шт.

Код товара: 401773

Колодки тормозные ВАЗ-1118,2170,2190 Калина,Приора,Гранта задние под ABS АвтоВАЗ к-т

Артикул: 2192-3502090 Производитель АвтоВАЗ 21920-3502090-55

org/Offer»>

Код товара: 395339

Колодки тормозные ВАЗ-1118,2170,2190 Калина,Приора,Гранта передние LADA SPORT к-т

Артикул: 11180-3501080 Производитель АвтоВАЗ 11180-3501800-83

Интернет 13 шт.

ВАЗ-1118 (Лада Калина седан) — Викизнание.

.. Это Вам НЕ Википедия! ВАЗ-1118. Вид сбоку ВАЗ-1118 ВАЗ-1118 ВАЗ-1118

Лада Калина седан (он же ВАЗ-1118)— автомобиль класса «В» с четырехдверным кузовом «седан», выпускавшийся с 18 ноября 2004 года.

  • Производитель: Волжский автомобильный завод, г.Тольятти, Самарской области

Характеристики ВАЗ-1118[править]

  • Максимальная скорость: 170 км/ч
  • Время разгона до 100 км/ч: 12.9 c
  • Расход топлива на 100км по городу: 9.8 л
  • Объем бензобака: 50 л
  • Снаряженная масса автомобиля: 1080 кг
  • Размер шин: 175/70 R13

Характеристики двигателя[править]

  • Рапсоложение: спереди, поперечно
  • Объем двигателя: 1596 см3
  • Мощность двигателя: 80 л.с.
  • Количество оборотов: 5200
  • Крутящий момент: 120/2700 н*м
  • Система питания: Распределенный впрыск
  • Расположение цилиндров: Рядный
  • Количество цилиндров: 4
  • Количество клапанов на цилиндр: 2
  • Рекомендуемое топливо: АИ-95

Тормозная система[править]

  • Передние тормоза: Дисковые
  • Задние тормоза: Барабанные

Кузов[править]

  • Тип кузова: седан
  • Количество дверей: 4
  • Количество мест: 5
  • Длина машины: 4040 мм
  • Ширина машины: 1670 мм
  • Высота машины: 1500 мм
  • Колея передняя: 1430 мм
  • Колея задняя: 1410 мм
  • Дорожный просвет (клиренс): 160 мм
  • Объем багажника: 400 л
  • ВАЗ Калина кат Сверчок
  • ВАЗ Калина кат Тольятти
  • ВАЗ Калина р+к Авторесурс
  • ВАЗ Калина р+к Сверчок
  • ВАЗ Калина рем (ремонтируем сами) Третий Рим бен. 1,4i; 1,6i
  • ВАЗ Калина рем (школа авторемонта) Третий Рим бен. 1.4 1.6
  • ВАЗ Калина рем в фото Мир Автокниг бен. 1.4/1.6
  • ВАЗ Калина Седан цв/рем в фото Третий Рим бен. 1,4i,1,6i
  • ВАЗ Калина Хэтчбек цв/рем в фото Третий Рим бен. 1.4i ; 1.6i
  • ВАЗ Калина цв/рем (ремонтируем сами) Третий Рим бен. 1.4/1.6
  • ВАЗ Калина цв/рем (своими силами) За Рулем бен. 1,6i
  • ВАЗ Калина цв/рем в фото Мир Автокниг бен. 1,4 1,6 1,6i
  • ВАЗ Калина цв/рем в фото Третий Рим бен. 1,6
  • ВАЗ Калина цв/рем в фото+каталог Мир Автокниг
  • ВАЗ Калина эл/об За Рулем
  • Лоток автолитературы на авторынке в Воронеже

Millenium DTRAB-1118 Пневматический барабанный табурет – Thomann США

Последние 35 лет я использую различные табуреты с круглым верхом. Меня вполне устраивал мой последний, но у него был традиционный способ изменения высоты, при котором нужно выкрутить болты, сломать гвоздь, найти упавшую шайбу под мебелью, а затем снова затянуть болт. Недавно я отыграл несколько концертов, где пол был слегка наклонен, но достаточно, чтобы барабаны стояли под немного неправильным углом, поэтому мне нужно было отрегулировать табурет (но вы застряли с необходимостью перемещать 1 отверстие вверх или вниз — может неправильное количество) или отрегулируйте оборудование барабана.

Во всяком случае, поскольку это было очень дешево, я решил поэкспериментировать с газовым регулируемым стулом, таким как этот. Кроме того, я задавался вопросом, может ли форма велосипедного седла быть лучше. Какая разница! Во-первых, вы можете отрегулировать высоту именно там, где вы хотите, и можете изменить ее одним нажатием рычага, если хотите, чтобы она была немного другой. Кроме того, в отличие от моего старого табурета, он вращается очень свободно, поэтому легкие движения в ту или иную сторону меньше нагружают позвоночник. Другая форма также обеспечивает большую поддержку, чем круглый табурет — я был удивлен.

У меня было одно замечание по поводу этого табурета: он обит кожей, а не тканью, поэтому я ожидал, что во время игры он будет горячим и потным, однако я этого не заметил. Я также не использовал спинку во время игры и не думаю, что мне это понадобится. Я попробовал это, просто чтобы посмотреть, на что это похоже, и это было очень удобно, и если бы я много работал с двумя педалями, я думаю, что это очень помогло бы мне. Когда я прочитал в рекламе перед покупкой, что его легко снять, я ожидал, что мне придется откручивать винты и т. д.и необходимость решить, хочу я этого или нет, и, вероятно, необходимость придерживаться этого решения. Однако это правда! Вы просто вставляете кронштейн в держатель и затягиваете его на нужную глубину, и он так же легко снимается. Вы могли бы даже сделать это посреди концерта, если бы захотели.

Я знаю, что могу показаться продавцом этого продукта, но посмотрите на цену, посмотрите на характеристики, и, честно говоря, другие стулья в продаже не стоят того, чтобы на них смотреть — я не вижу смысла тратить в два раза больше за меньшее количество функций.Если во имя баланса я должен был дать одно замечание, при открытии и закрытии ножек при установке вверх / вниз это не очень гладко, а Т-образный болт выглядит немного дешево, и есть несколько слегка шероховатых краев. металлоконструкции, но конечным результатом является то, что они действительно прочные, так что я могу с этим смириться.

Оценка субстрата FRET-пептида для прогнозирования вирулентности Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Pseudomonas aeruginosa продуцирует ряд протеаз, которые связаны с вирулентностью и прогрессированием заболевания.Субстрат, способный обнаруживать специфичную для P. aeruginosa протеолитическую активность, может помочь быстро предупредить клиницистов о потенциале вирулентности отдельных штаммов P. aeruginosa . Для этой цели мы разработали набор специфичных для P. aeruginosa флуорогенных субстратов, включающих пептиды, меченные переносом энергии флуоресцентного резонанса (FRET), и оценили их применимость к вирулентности P. aeruginosa в ряде клинических изолятов. Было обнаружено, что FRET-пептид, содержащий три глицина (3xGly), специфичен для обнаружения P.aeruginosa протеазы. Дальнейший скрининг 97 клинических изолятов P. aeruginosa показал широкий разброс активности расщепления 3xGly. Отсутствие деградации 3xGly нокаутным штаммом lasI указывает на то, что расщепление 3xGly штаммом P. aeruginosa может быть связано с определением кворума (QS). Эта гипотеза подкрепляется наблюдением сильной корреляции между расщеплением 3xGly и стафилолитической активностью LasA. и производство пиоцианина. Кроме того, изоляты, способные расщеплять 3xGly, были более чувствительны к QS-ингибирующему антибиотику азитромицину (AZM).В заключение мы разработали и оценили субстрат 3xGly, который может быть полезен в качестве простого инструмента для прогнозирования вирулентности и чувствительности к AZM.

Ссылка: Каман В.Е., Аркуби-Эль Аркуби Н.Е., Роффель С., Эндц Х.П., ван Белкум А., Биккер Ф.Дж. и др. (2013) Оценка субстрата FRET-пептида для прогнозирования вирулентности Pseudomonas aeruginosa . ПЛОС ОДИН 8(11): е81428. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081428

Редактор: Джамунарани Вадивелу, Университет Малайи, Малайзия

Получено: 17 июля 2013 г.; Принято: 12 октября 2013 г.; Опубликовано: 26 ноября 2013 г.

Авторские права: © 2013 Kaman et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Это исследование финансировалось Седьмой рамочной программой Европейского сообщества FP7/2007-2013, TEMPOtest-QC, в соответствии с соглашением о гранте №. 241742 и грант STW Valorisation Grant, TNO SBIR: Bacalyzer no. 16-001. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: AB работает в компании BioMerieux. Это не меняет соблюдения авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Pseudomonas aeruginosa представляет собой грамотрицательную палочковидную бактерию, которая является важной причиной инфекции у лиц, страдающих широким спектром основных заболеваний, в том числе у лиц с ослабленной защитой организма, у пациентов с ожогами и у пациенты, страдающие наследственным заболеванием дыхательных путей муковисцидозом (МВ). P. aeruginosa также является частой причиной госпитальной пневмонии, раневых инфекций и бактериемии [1]. Раннее выявление инфекции, вызванной P. aeruginosa , способствует эффективному антимикробному лечению, снижает риск неадекватного назначения антибиотиков и, возможно, может способствовать предотвращению необратимого заболевания легких у пациентов с муковисцидозом. Кроме того, этот бактериальный патоген продуцирует ряд ферментов протеаз, которые связаны с вирулентностью и прогрессированием заболевания [2]. В этом отношении субстрат, способный обнаруживать специфичную для P. aeruginosa протеолитическую активность, может помочь быстро предупредить клиницистов о потенциале вирулентности отдельных штаммов P. aeruginosa , выделенных от разных пациентов. В частности, обнаружение этих протеазных факторов вирулентности потенциально может быть использовано для мониторинга тяжести инфекции и прогнозирования исхода заболевания, тем самым предоставляя полезную информацию для поддержки индивидуального мониторинга и лечения пациентов, что является первым шагом на пути к внедрению «персонализированной медицины».

Теоретически бактериальные протеазы можно использовать в качестве биомаркеров для быстрой и чувствительной идентификации микроорганизмов в клинических образцах. Кроме того, ранее была описана возможность использования методов обнаружения на основе протеаз для диагностики бактериальных инфекций [3,4]. В связи с этим известно, что P. aeruginosa обладает большим арсеналом факторов вирулентности, помогающих успешно заразить хозяина [2]. Большинство этих факторов вирулентности включают протеазы, продуцируемые под контролем систем распознавания кворума (QS) Las и Rhl P.aeruginosa [5], примеры которых включают эластазы LasA и LasB и щелочную протеазу [6]. Эти протеазы играют важную роль в патогенезе P. aeruginosa посредством деградации биологически активных белков, присутствующих в тканях человека [7]. Фактически, значительная роль QS-системы в прогрессировании заболевания, связанного с P. aeruginosa , привела к большому количеству исследований соединений, ингибирующих QS, которые потенциально могут снизить потенциал вирулентности организма [8-12].Кроме того, терапевтическая эффективность этой анти-QS, антивирулентной стратегии при лечении P. aeruginosa уже была продемонстрирована для ингибирующего QS антибиотика азитромицина [12]. Хотя противовирулентное лечение, основанное на ингибировании QS, полезно только тогда, когда активная, секретирующая фактор вирулентности, система QS присутствует в штамме P. aeruginosa , на который нужно воздействовать.

В этом исследовании мы описываем дизайн нового P. aeruginosa -специфического пептидного субстрата переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) и изучаем его применимость для обнаружения P.aeruginosa в клинических образцах. Кроме того, мы изучили связь между эффективностью расщепления субстрата, продукцией фактора вирулентности и чувствительностью к QS-ингибирующим антибиотикам, таким как азитромицин.

Материалы и методы

Бактерии

Штаммы P. aeruginosa , использованные для тестирования субстратной специфичности, перечислены в таблице 1. Клинические штаммы P. aeruginosa были собраны из бактериального биобанка, находящегося в отделении медицинской микробиологии и инфекционных заболеваний медицинского центра Erasmus, Роттердам. , Нидерланды, собраны в период с 2008 по 2012 год.Всего было отобрано 97 клинических изолятов; 13 из крови, 56 из мокроты (35 больных МВ и 21 больной без МВ) и 28 штаммов были выделены из ран. Система VITEK 2 (bioMérieux, Marcy L`Etoile, Франция) использовалась для идентификации и тестирования чувствительности клинических изолятов к антибиотикам. Для приготовления культуральных супернатантов все бактерии выращивали в 5 мл среды Brain Heart Infusion (BHI) (bioTrading, Mijdrecht, Нидерланды) при 37 °C. После 16 ч культивирования бактерии осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 g, а супернатант, содержащий фермент, стерилизовали фильтрованием через 0.Фильтр 22 мкм (Millipore, Амстердам, Нидерланды).

+
Штамм
синегнойной АТСС 15692, PAO1
синегнойной PA14
синегнойной PA14Δ LASI [31]
Pseudomonas Шогезсепз клинический изолят
Pseudomonas putida S12
Pseudomonas stutzeri DSMZ 10701, JM300
золотистый стафилококк ATCC 43300
Staphylococcus simulans ATCC 27851
Staphylococcus capitis subsp. Capitis

Клинический изолят
Streptococcus Pneumoniae ATCC 49619
STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP. zooepidemicus ATCC 43079 90126
Klebsiella Pneumoniae Klebsiella Pneumoniae ATCC 43816
Haemophilus Phangeenzae ATCC 49247

Таблица 1.Бактериальные штаммы, использованные в данном исследовании.

FRET-анализ

Субстраты, использованные в этом исследовании, были приобретены у PepScan Presto B. V. (Лелистад, Нидерланды) с чистотой > 90%. Все субстраты были фланкированы с С-конца флуоресцентным зондом; FITC и N-конец фланкированы лизиновым гасителем; Дабцил. Идентичность субстратов была подтверждена PepScan Presto B.V. с использованием масс-спектрометрии. Анализы проводили в 96-луночных планшетах с черным прозрачным дном (Corning, Lowell, USA).Протеолитическую активность определяли путем инкубации 16 мкМ субстрата с 50 мкл отфильтрованного супернатанта бактериальной культуры или 50 мкл лизостафина (0,04 мкг/мкл, разведенного в BHI, Sigma, Zwijndrecht, Нидерланды) при 37 °C. Отфильтрованную среду BHI использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты считывали в течение 60 минут с 2-минутными интервалами с использованием флуоресцентного считывателя микропланшетов (FLUOstar Galaxy, BMG Laboratories, Оффенбург, Германия) с использованием длины волны возбуждения 485 нм и длины волны излучения 530 нм. Значения относительной флуоресценции (RF) были получены после коррекции по сравнению с контрольной культуральной средой без инокуляции BHI. Активность протеазы определяли в РФ в минуту (РФ/мин).

Тестирование чувствительности субстрата 3xGly

in vitro

P. aeruginosa PAO1 культивировали в течение ночи в среде BHI при 37 °C. На следующий день 20 мкл ночной культуры добавляли к 20 мл свежей среды BHI. Затем бактерии выращивали еще в течение 16 ч и каждый час отбирали образец. Количество бактерий в образце определяли путем подсчета колоний путем посева 10-кратных серийных разведений на чашки с триптиказо-соевым агаром (TSA) (bioTrading, Mijdrecht, Нидерланды).Планшеты инкубировали при 37°С и подсчитывали количество бактерий после инкубации в течение ночи. Протеолитическую активность на субстрате 3xGly исследовали с использованием образцов объемом 50 мкл в анализе FRET, как описано выше. Относительные значения флуоресценции (RF) были получены после поправки на отрицательные образцы культуральной среды. Активность протеазы определяли в РФ в минуту (РФ/мин). Протеолитическую активность с РФ/мин > 5 определяли положительной.

Количественная оценка продукции пиоцианина и активности протеазы LasA

Внеклеточную продукцию пиоцианина определяли, как описано ранее [13].Активность протеазы LasA исследовали путем измерения способности супернатантов культуры стационарной фазы P. aeruginosa (см. раздел FRET-анализа выше) лизировать убитые нагреванием клетки Staphylococcus aureus , как описано Kessler et al [14].

Выделение РНК и синтез кДНК

Для выделения РНК было выбрано 12 изолятов P. aeruginosa . Эти изоляты были культивированы из клинических образцов крови, ран и мокроты, при этом два изолята, которые были 3xGly-активными (+, РФ/мин > 5), и два изолята, которые были 3xGly неактивными (-, РФ/мин <5), были выбраны из каждый тип клинического образца.Штамм P. aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) использовали в качестве положительного эталонного контроля 3xGly. 12 изолятов P. aeruginosa первоначально выращивали в течение ночи в среде BHI при 37°C. На следующий день ночную культуру разбавляли 1:10 в среде BHI и бактерии снова культивировали при 37°C до достижения OD 600 приблизительно 0,9-1,0. Из этих культур тотальную РНК экстрагировали с использованием набора FastRNA ProBlue (Promega, Лейден, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя.Для удаления любой загрязняющей ДНК 1 мкг экстрагированной РНК смешивали с одной единицей ДНКазы (Fermentas, Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерланды) в 1x реакционном буфере ДНКазы. Затем смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин и реакцию останавливали добавлением 1 мкл 50 мМ ЭДТА и последующей инкубацией в течение 10 мин при 65°С. Для синтеза кДНК обработанную ДНКазой РНК (500 нг) инкубировали в течение 60 минут при 42 °C с 5 мкМ случайных гексамерных праймеров, 10 единиц Ribolock, 1 мМ dNTP и 200 единиц RevertAid в 1x реакционном буфере (Fermentas, Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерланды).Реакцию останавливали инкубацией при 70°С в течение 5 мин.

Экспрессия генов чувства кворума

Определение экспрессии гена QS проводили с использованием ПЦР в реальном времени и специально разработанных праймеров для генов пути, связанного с QS, lasI и rhlA , контрольного гена, не связанного с QS, trpD и P. . aeruginosa ген домашнего хозяйства rpsL [15–17]. Каждая ПЦР содержала 1 мастер-микс FastStart SYBR Green (Roche, Woerden, Нидерланды), 4 мМ MgCl 2 и 0.5 пмоль каждого праймера и 2 мкл 10-кратно разведенной кДНК. Амплификацию проводили с использованием LightCycler (Roche, Woerden, Нидерланды). Использовались следующие параметры циклирования: 15 мин при 95 °C, 40 циклов амплификации при 95 °C в течение 20 с, 60 °C в течение 20 с и 72 °C в течение 30 с. с. Анализ кривой плавления, выполненный в конце амплификации, показал один пик продукта, что указывает на отсутствие амплификации неспецифических продуктов. Данные анализировали с использованием программного обеспечения LightCycler (версия 3.0), а ген домашнего хозяйства rpsL использовали в качестве эталонного гена (гена домашнего хозяйства) для нормализации экспрессии генов.Для расчета экспрессии интересующих генов использовали метод 2 -ΔΔCt [18]. Экспрессию гена QS рассчитывали как относительный процент экспрессии нормализованного гена rpsL в контрольном изоляте P. aeruginosa PAO1.

Определение чувствительности к азитромицину

Чувствительность P. aeruginosa к QS-ингибирующему антибиотику азитромицину (AZM) была оценена для 35 штаммов P. aeruginosa , выделенных из мокроты больных муковисцидозом, с использованием метода диско-диффузии.Для этого готовили суспензию каждого бактериального изолята, выращенного в течение ночи на кровяном агаре с трипто-соевым агаром (ТСА), в физиологическом растворе при мутности 0,5 единиц МакФарланда. Каждую бактериальную суспензию наносили штрихами на чашки с TSA стерильным ватным тампоном, чтобы получить равномерный рост бактерий, и диск, содержащий 15 мкг AZM (Oxoid, Badhoevedorp, Нидерланды), помещали в середину чашки с инокулированной культурой. Затем планшеты инкубировали при 37°С, инкубировали в течение ночи и измеряли диаметр зон ингибирования роста (мм).

Результаты

Дизайн

P. aeruginosa – специальные субстраты FRET

В исследовании Vessillier et al. было описано, что специфичная для P. aeruginosa протеаза LasA распознает и расщепляет глициновые связи [19]. Основываясь на этих характеристиках расщепления, мы сконструировали субстраты FRET-пептида, содержащие несколько остатков глицина, и инкубировали эти субстраты с культуральным супернатантом P. aeruginosa . Эти субстраты включали FITC-Gly-LysDbc (1xGly), FITC-(Gly) 2 -LysDbc (2xGly), FITC-(Gly) 3 -LysDbc (3xGly), FITC-(Gly) 4 -LysDbc. (4xGly) и FITC-(Gly) 5 -LysDbc (5xGly).В качестве контроля специфичности мы сравнили активность культурального супернатанта P. aeruginosa по отношению к этим субстратам с активностью расщепления лизостафином, ферментом, продуцируемым Staphylococcus simulans , который распознает и расщепляет пентаглициновые связи [20]. Эксперименты показали, что субстрат 5xGly расщеплялся как лизостафином, так и культуральным супернатантом P. aeruginosa , и что аналогичный результат наблюдался для субстрата, содержащего четыре глицина (рис. 1).Однако при тестировании субстрата 3xGly наблюдалось значительное снижение протеолитической активности лизостафина, тогда как протеолитическая активность P. aeruginosa фактически значительно возрастала. Дополнительные эксперименты показали минимальное расщепление в случае субстрата 2xGly и отсутствие расщепления при использовании субстрата 1xGly. Эти результаты показали, что субстрат 3xGly был лучшим кандидатом среди протестированных субстратов для исследования в качестве потенциального субстрата для быстрого обнаружения вирулентности в P.палочка .

Рис. 1. Расщепляющая активность лизостафина и супернатанта культуры P. aeruginosa на ряде глициновых субстратов.

Лизостафин (2 мкг, серая полоса) и культуральный супернатант P. aeruginosa PAO1 (белая полоса) инкубировали с 16 мкМ FRET-субстрата при 37 °C в течение 1 часа. Расщепление субстратов определяли по относительной флуоресценции в минуту (RF/мин). Результаты выражены как среднее ± SEM (n = 3).

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0081428.g001

Характеристика расщепления субстрата 3xGly

Чтобы охарактеризовать специфичность субстрата 3xGly, мы исследовали расщепление 3xGly с использованием ряда культуральных супернатантов (i) из диапазона видов Pseudomonas , не относящихся к aeruginosa , и (ii) из ряда дополнительных респираторных бактерий, и микроорганизмы, которые, как известно, продуцируют лизостафиновые (подобные) протеазы (таблица 1). Результаты показали, что субстрат 3xGly расщеплялся исключительно культуральными супернатантами P.aeruginosa (штаммы PA14 и PAO1), но не P. putida , P. stutzeri или P. fluorescens . Кроме того, не наблюдалось расщепляющей активности для ряда дополнительных респираторных бактерий и микроорганизмов, которые, как известно, продуцируют лизостафин, которые были протестированы. Интересно, что никакой активности расщепления не наблюдалось, когда субстрат 3xGly инкубировали с культуральным супернатантом штамма P. aeruginosa PA14∆ lasI , в котором отсутствует QS-ген lasI (рис. 2).Помимо вышеупомянутых бактерий, субстрат 3xGly подвергали скринингу с дополнительным набором бактериальных супернатантов, в общей сложности 17. Ни одна из этих бактерий не смогла расщепить субстрат (данные не представлены). Чтобы охарактеризовать чувствительность 3xGly, субстрат инкубировали с серией разведений P. aeruginosa PAO1. Используя отсечку РФ/мин> 5, было замечено, что предел обнаружения для P. aeruginosa PAO1 с использованием субстрата 3xGly составлял 10 7 КОЕ/мл (рис. 3).

Рисунок 2. Тестирование специфичности субстрата 3xGly.

Супернатанты культур Pseudomonas spp., респираторных микроорганизмов и бактерий, продуцирующих лизостафиновые (*) или лизостафиноподобные (**) протеазы, инкубировали с 16 мкМ 3xGly. Флуоресценцию измеряли в течение 1 часа при 37°С. Результаты выражены как среднее ± SEM (n = 3).

https://doi. org/10.1371/journal.pone.0081428.g002

Рисунок 3. Тестирование чувствительности субстрата 3xGly.

Серийные разведения P. aeruginosa PAO1 инкубировали с 16 мкМ 3xGly при 37 °C. Активность расщепления определяли в относительной флуоресценции в минуту (RF/мин). Пороговое значение анализа было оценено как RF/мин, равное 5. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081428.g003

Чтобы получить более полное представление об активности протеаз в расширенном диапазоне клинически значимых изолятов P. aeruginosa , мы протестировали в общей сложности 97 выбрано случайно р.aeruginosa клинических изолятов, полученных из ран, крови и мокроты. Эти штаммы анализировали на активность расщепления надосадочной жидкости на субстрате 3xGly. Результаты показали, что большой процент протестированных штаммов (60/97; 62%) не смог расщепить субстрат 3xGly. Этот процент варьировался между клиническими образцами от 50% в изолятах из ран до 73% в изолятах от пациентов с муковисцидозом (таблица 2).

0 ( N = 13)

0 ( N = 35)

0 ( N = 21)

рана кровь CF Non CF
9012 ( N = 28)
Clavage 14 (50) 4 (31) 9 (27) (28) (48)
No Clavage (50 9 (69) 26 (73) 11 (52)

Таблица 2. Активность расщепления 3xGly среди 97 случайно выбранных клинических изолятов P. aeruginosa a .

Связь между расщеплением 3xGly и вирулентностью

LasA является членом семейства бета-литических эндопептидаз, а пиоцианин является вторичным метаболитом, обладающим способностью окислять и восстанавливать другие молекулы [21,22]. Было показано, что экспрессия обоих этих факторов вирулентности штаммом P. aeruginosa связана с его системой QS [2].Результаты производства как LasA, так и пиоцианина показали, что оба были значительно выше в 3xGly, расщепляющих изолятов P. aeruginosa , хотя наблюдались некоторые различия в отдельных изолятах (рис. 4A-B). Связь между активностью LasA и расщеплением 3xGly была очень значимой ( P <0,0001, r = 0,542).

Рис. 4. Связь между расщеплением 3xGly и секрецией белков, связанных с QS.

Супернатанты культур 56 штаммов P. aeruginosa , выделенных из мокроты, анализировали на активность протеазы LasA (A) и продукцию пиоцианина (B).Связанная с QS активность расщепления LasA при расщеплении 3xGly P . Штаммы aeruginosa (RF/мин > 5) сравнивали с расщеплением LasA у нерасщепляющих штаммов 3xGly (RF/мин < 5) с использованием непарного двустороннего теста Стьюдента t (** P < 0,01). , *** P < 0,0001). Горизонтальная линия указывает среднюю активность LasA/производство пиоцианина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081428.g004

Связь между расщеплением 3xGly и системой определения кворума

Наблюдение за отсутствием активности 3xGly с использованием P.Нокаутный мутантный штамм aeruginosa lasI (рис. 1) показал, что отсутствие активности расщепления 3xGly может быть связано с нарушением экспрессии QS-системы. Для проверки этой гипотезы мы исследовали экспрессию QS-генов lasI и rhlA с использованием селекции 3xGly расщепляющих и нерасщепляющих изолятов P. aeruginosa . Штаммы, у которых отсутствовала протеолитическая активность 3xGly, демонстрировали сниженную экспрессию lasI и rhlA по сравнению с экспрессией lasI и rhlA в расщепляющих 3xGly изолятах.Наблюдалось значительное снижение нормализованного lasI , но не rhlA ( P = 0,05). В нормализованной экспрессии контрольного гена trpD , не связанного с QS-системой, не наблюдалось различий (рис. 5).

Рис. 5. Связь между расщеплением 3xGly и экспрессией QS-генов.

Экспрессию гена QS определяли в подмножестве штаммов P. aeruginosa , как описано в материалах и методах. Нормализованная экспрессия гена QS-цепи lasI , гена QS-мишени rhlA и независимого от QS гена trpD , измеренная в бактериях, выращенных в середине логарифмической фазы, показана как относительные значения (%) по сравнению с P. aeruginosa контрольный штамм PAO1. Горизонтальная линия указывает средние уровни экспрессии. P -значения рассчитаны с использованием непарных, двусторонних t -тестов Стьюдента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081428.g005

Взаимосвязь между расщеплением 3xGly и чувствительностью к азитромицину

Очевидная связь между расщеплением 3xGly и системой QS побудила нас исследовать возможную связь между расщеплением 3xGly и чувствительностью к QS-ингибирующему антибиотику AZM.Мы изучили чувствительность к AZM клинических изолятов P. aeruginosa с помощью диско-диффузионного анализа, но не обнаружили связи между расщеплением 3xGly и чувствительностью к AZM для изолятов P. aeruginosa , культивированных из крови и ран или из мокроты пациентов, не страдающих муковисцидозом. пациенты. Интересно, однако, что наблюдалась весьма значимая связь между зоной ингибирования AZM и расщеплением 3xGly для изолятов P. aeruginosa , культивированных из мокроты пациентов с муковисцидозом (рис. 6).Наконец, было исследовано расщепление 3xGly в отношении ряда резистентностей к антибиотикам, не связанных с AZM, при этом не было обнаружено значительной корреляции между расщеплением 3xGly и устойчивостью к другим протестированным антибиотикам. Однако было отмечено, что среди группы из изолятов P. aeruginosa , у которых отсутствовало расщепление 3xGly, наблюдалось больше изолятов с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) (таблица S1).

Рис. 6. Связь между расщеплением 3xGly и чувствительностью к азитромицину.

Азитромицин (AZM) чувствительность P.aeruginosa , выделенных из мокроты, определяли диско-диффузионным методом. Зоны ингибирования AZM для расщепления 3xGly (RF/мин > 5) P . Штаммы aeruginosa сравнивали с зонами ингибирования 3xGly нерасщепляющих штаммов (RF/мин < 5) с использованием непарного двустороннего теста Стьюдента t (*** P < 0,0001). Горизонтальная линия указывает средний размер зоны ингибирования AZM.

https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0081428.g006

Обсуждение

Мы разработали и оценили флуорогенный субстрат в качестве потенциального маркера вирулентности бактериального патогена P. aeruginosa . Предварительные эксперименты показали, что этот субстрат 3xGly был специфичен для расщепления P. aeruginosa и что чувствительность субстрата составляла 10 7 КОЕ/мл в течение 1 часа, хотя этот предел обнаружения может различаться у разных P. aeruginosa. (было замечено, что PA14 расщепляет субстрат 3xGly более эффективно, чем PAO1).Лишь небольшая перекрестная реактивность наблюдалась с другой бактериальной протеазой, лизостафином, который распознает и расщепляет пентаглициновые связи [20]. Более поздние эксперименты с использованием более широкого диапазона 97 клинических изолятов показали, что активность расщепления 3xGly различалась между изолятами P. aeruginosa , при этом большой процент изолятов был неспособен расщеплять субстрат 3xGly. Возможно, это связано с различием в экспрессии QS-системы P. aeruginosa . Мы действительно наблюдали небольшое, но незначительное снижение экспрессии QS-генов lasI и rhlI у P. aeruginosa , у которых отсутствовала протеолитическая активность 3xGly. Поскольку этот эксперимент был проведен с подмножеством штаммов P. aeruginosa , необходимы будущие эксперименты для определения точной генетической основы корреляции протеолиза/вирулентности.

Одной из наиболее важных протеаз, секретируемых под управлением системы P. aeruginosa QS, является протеаза LasA. Протеаза LasA (стафилолизин) P. aeruginosa может распознавать и разрушать глициновые связи, разрушать эластин и вносит важный вклад в патогенез этого организма.LasA (20 кДа) является членом семейства бета-литических эндопептидаз внеклеточных бактериальных протеаз и обладает высокой стафилолитической активностью [7]. Кроме того, Элстон и соавт. показали, что протеаза LasA способна расщеплять пептиды, в которых присутствуют три глицина [23]. Таким образом, на основании уже установленной расщепляющей глицин протеолитической активности протеазы LasA P. aeruginosa , ее стафилолитической активности, ее контроля с помощью системы QS P. aeruginosa и результатов, наблюдаемых для расщепления 3xGly, представляется, что Протеаза LasA, скорее всего, является фактором вирулентности протеаз, измеренным в P.aeruginosa с использованием нашего субстрата 3xGly, но это необходимо подтвердить экспериментально.

Другими факторами, зависящими от экспрессии QS-системы P. aeruginosa , являются продукция пиоцианина и устойчивость к антибиотикам. Пиоцианин является важным фактором вирулентности и действует как посредник переноса электронов [2]. Кроме того, ранее было показано, что изоляты P. aeruginosa , у которых отсутствует продукция QS-зависимых факторов вирулентности, обладают более высокой степенью устойчивости к противомикробным препаратам, среди которых ципрофлоксацин и тобрамицин [24].Хотя мы действительно наблюдали значительную корреляцию между продукцией пиоцианина и расщеплением 3xGly, значимой корреляции с устойчивостью к исследуемым противомикробным препаратам обнаружено не было (таблица 1). Это несоответствие может быть связано с различием условий культивирования, поскольку секреция QS-метаболитов, таких как протеаза LasA, зависит от наличия питательных веществ в окружающей среде [25].

Возможно, одним из самых интересных результатов исследования был тот факт, что самый высокий процент нерасщепляющихся изолятов 3xGly наблюдался в группе изолятов из мокроты муковисцидоза.Возможно, это связано с тем, что пациенты с муковисцидозом часто колонизированы P. aeruginosa [26]. Kohler и соавт. показали, что при колонизации P. aeruginosa интубированных пациентов количество QS-мутантов увеличивается. У этих мутантов отсутствует производство QS-зависимых белков, таких как эластаза и рамнолипиды, и они используют преимущества «общественного блага», производимого изолятами дикого типа, которые находятся в общей популяции изолятов P. aeruginosa , которые колонизируют пациента. «читерские» штаммы).Это явление может привести к избыточному росту изолята P. aeruginosa дикого типа за счет мутантного изолята из-за его преимущества в приспособленности [27].

В настоящее время проводятся исследования по изучению потенциала соединений, ингибирующих QS, в лечении инфекций, связанных с P. aeruginosa [8–12]. Наиболее тщательно изученным QS-ингибирующим антибиотиком является AZM. Лечение AZM связано с улучшением исхода заболевания у P. aeruginosa инфицированных пациентов с муковисцидозом [28].Однако противовирулентный агент, такой как AZM, эффективен только тогда, когда присутствует активная система QS, секретирующая фактор вирулентности. По этой причине Kohler et al. провели скрининг продукции рамнолипидов, чтобы отобрать пациентов для клинических испытаний эффективности AZM. Пациенты, инфицированные штаммами P. aeruginosa , которые не способны продуцировать эти QS-белки, были исключены из протокола [12].

Мы наблюдали сильную корреляцию между чувствительностью к AZM и расщеплением 3xGly с помощью P. aeruginosa , выделенных из мокроты пациентов с муковисцидозом, при этом зоны ингибирования роста у 3xGly-положительных по расщеплению изолятов были значительно больше по сравнению с зонами у 3xGly-отрицательных по расщеплению изолятов. До недавнего времени утверждалось, что AZM не может уничтожить P. aeruginosa путем уничтожения бактерий [29]. Недавняя публикация Buyck et al. однако было обнаружено, что ингибирование роста P. aeruginosa с помощью AZM зависит от используемой среды [30]. Штаммы P. aeruginosa , выращенные в среде Мюллера-Хинтона, имеют более низкую проницаемость внешней мембраны по сравнению со штаммами, культивируемыми, например, в среде RPMI.Это приводит к увеличению восприимчивости к AZM и, таким образом, может объяснить наличие индуцированных AZM зон ингибирования роста, которые мы наблюдали на чашках с агаром TSA.

В заключение мы разработали и оценили новый субстрат пептида 3xGly FRET для оценки вирулентности P. aeruginosa . Расщепление 3xGly FRET-субстрата было в значительной степени связано с протеазной активностью культурального супернатанта, стафилолитической активностью, продукцией пиоцианина и экспрессией lasI в P. aeruginosa Система QS. Эта публикация представляет собой первый шаг в разработке простого теста для определения и мониторинга вирулентности P. aeruginosa в клинических образцах, включая прогнозирование эффективности лечения антибиотиками, ингибирующими QS. Предварительные оценочные эксперименты предполагают, что эта методология может достичь своего наибольшего потенциала при мониторинге пациентов с муковисцидозом, колонизированных инфекциями P. aeruginosa и проходящих лечение.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Dr.D. Hogan за предоставление штамма P. aeruginosa PA14 и P. aeruginosa PA14∆ lasI и Dr. T. Kohler за последовательности праймеров для определения экспрессии генов QS.

Авторские взносы

Задумал и разработал эксперименты: WK FB JH. Выполнены опыты: ЗК СВ СР. Проанализированы данные: WK. Написал рукопись: WK AB HE FB JH.

Каталожные номера

  1. 1. Bodey GP, Bolivar R, Fainstein V, Jadeja L (1983)Инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa .Преподобный Infect Dis 5: 279-313. doi: https://doi.org/10.1093/cliniids/5.2.279. PubMed: 6405475.
  2. 2. Хименес П.Н., Кох Г., Томпсон Дж.А., Ксавьер К.Б., Кул Р.Х. и другие. (2012) Множественные сигнальные системы, регулирующие вирулентность у Pseudomonas aeruginosa . Microbiol Mol Biol Rev 76: 46-65. doi: https://doi.org/10.1128/MMBR.05007-11. PubMed: 223.
  3. 3. Уайльдебур Д., Хилл К.Е., Джеганатан Ф., Уильямс Д.В., Ридделл А.Д. и другие. (2012) Специфическая протеазная активность указывает на степень инфицирования Pseudomonas aeruginosa в хронических инфицированных ранах.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31: 2183-2189. doi: https://doi.org/10. 1007/s10096-012-1553-6. PubMed: 22278295.
  4. 4. Kaman WE, Galassi F, de Soet JJ, Bizzarro S, Loos BG et al. (2012) Высокоспецифичный подход на основе протеазы для обнаружения Porphyromonas gingivalis при диагностике пародонтита. J Clin Microbiol 50: 104-112. doi: https://doi.org/10.1128/JCM.05313-11. PubMed: 22075590.
  5. 5. Girard G, Bloemberg GV (2008)Центральная роль ощущения кворума в регуляции выработки факторов патогенности у Pseudomonas aeruginosa .Future Microbiol 3: 97-106. doi: https://doi.org/10.2217/17460913.3.1.97. PubMed: 18230038.
  6. 6. Brint JM, Ohman DE (1995) Синтез множественных экзопродуктов в Pseudomonas aeruginosa находится под контролем RhlR-RhlI, другого набора регуляторов в штамме PAO1 с гомологией аутоиндуктор-чувствительного семейства LuxR-LuxI. J Bacteriol 177: 7155-7163. PubMed: 8522523.
  7. 7. Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF (2004) Справочник по протеолитическим ферментам. 387 стр.
  8. 8. Империи Ф., Массаи Ф., Рамачандран П.С., Лонго Ф., Зеннаро Э. и др. (2013) Новая жизнь старого лекарства: антигельминтный препарат никлозамид подавляет Pseudomonas aeruginosa определение кворума. Противомикробные агенты Chemother 57: 996-1005. doi: https://doi.org/10.1128/AAC.01952-12. PubMed: 23254430.
  9. 9. Ходжкинсон Дж.Т., Галлоуэй В.Р., Райт М., Мати И.К., Николсон Р.Л. и другие. (2012)Дизайн, синтез и биологическая оценка неприродных модуляторов чувства кворума у ​​ Pseudomonas aeruginosa .Org Biomol Chem 10: 6032-6044. doi: https://doi.org/10.1039/c2ob25198a. PubMed: 22499353.
  10. 10. Jakobsen TH, van Gennip M, Phipps RK, Shanmugham MS, Christensen LD et al. (2012) Ajoene, богатая серой молекула из чеснока, ингибирует гены, контролируемые чувством кворума. Противомикробные агенты Chemother 56: 2314-2325. doi: https://doi.org/10.1128/AAC.05919-11. PubMed: 22314537.
  11. 11. Christensen LD, van Gennip M, Jakobsen TH, Alhede M, Hougen HP et al. (2012)Синергическая антибактериальная эффективность раннего комбинированного лечения тобрамицином и ингибиторами чувства кворума против Pseudomonas aeruginosa на мышиной модели внутрибрюшинной инфекции инородного тела.J Antimicrob Chemother 67: 1198-1206. doi: https://doi.org/10.1093/jac/dks002. PubMed: 22302561.
  12. 12. ван Делден С., Келер Т., Бруннер-Фербер Ф., Франсуа Б., Карле Дж. и др. (2012) Азитромицин для предотвращения Pseudomonas aeruginosa вентилятор-ассоциированной пневмонии путем подавления чувства кворума: рандомизированное контролируемое исследование. Медицина интенсивной терапии 38: 1118-1125. doi: https://doi.org/10.1007/s00134-012-2559-3. PubMed: 22527075.
  13. 13. Essar DW, Eberly L, Hadero A, Crawford IP (1990)Идентификация и характеристика генов второй антранилатсинтазы в Pseudomonas aeruginosa : взаимозаменяемость двух антранилатсинтаз и эволюционные последствия. J Bacteriol 172: 884-900. PubMed: 2153661.
  14. 14. Kessler E, Safrin M, Olson JC, Ohman DE (1993) Секретируемый LasA из Pseudomonas aeruginosa представляет собой стафилолитическую протеазу. J Biol Chem 268: 7503-7508. PubMed: 8463280.
  15. 15. Келер Т., Перрон Г.Г., Баклинг А., ван Делден С. (2010) Ингибирование восприятия кворума выбирает вирулентность и сотрудничество в Pseudomonas aeruginosa . PLoS Pathog 6: e1000883. ПабМед: 20463812.
  16. 16. Бастин С.А., Бенеш В., Гарсон Дж.А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж. и др. (2009) Руководство MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени. Clin Chem 55: 611-622. doi: https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797. PubMed: 1

    19.

  17. 17. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N et al. (2002) Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля. Геном Биол 3: RESEARCH0034. PubMed: 12184808.
  18. 18. Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Анализ данных об относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2(-Delta Delta C(T)). Методы 25: 402-408. doi: https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262. PubMed: 11846609.
  19. 19. Vessillier S, Delolme F, Bernillon J, Saulnier J, Wallach J (2001)Гидролиз глицинсодержащих пентапептидов эластина с помощью LasA, металлоэластазы из Pseudomonas aeruginosa .Eur J Biochem 268: 1049-1057. doi: https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2001.01967.x. PubMed: 11179971.
  20. 20. Xu N, Huang ZH, de Jonge BL, Gage DA (1997)Структурная характеристика муропептидов пептидогликана с помощью масс-спектрометрии с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы и анализа распада после источника. Анальный биохим 248: 7-14. doi: https://doi.org/10.1006/abio.1997.2073. PubMed: 19.
  21. 21. Kessler E (1995) Беталитические эндопептидазы. Методы Enzymol 248:740-56.: 740-756.
  22. 22. Рада Б., Лето Т.Л. (2009)Окислительно-восстановительная война между эпителиальными клетками дыхательных путей и Pseudomonas : двойная оксидаза против пиоцианина. Иммунол рез. 43: 198-209. doi: https://doi.org/10.1007/s12026-008-8071-8. PubMed: 18979077.
  23. 23. Elston C, Wallach J, Saulnier J (2007) Новые непрерывные и специфические флуорометрические анализы для Pseudomonas aeruginosa эластазы и протеазы LasA. Анальный биохим 368: 87-94. дои: https://дои.org/10.1016/j.ab.2007.04.041. PubMed: 17553454.
  24. 24. Karatuna O, Yagci A (2010) Анализ производства фактора вирулентности, зависящего от определения кворума, и его связи с чувствительностью к противомикробным препаратам у Pseudomonas aeruginosa респираторных изолятов. Clin Microbiol Infect 16: 1770-1775. doi: https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2010.03177.x. PubMed: 20132256.
  25. 25. Duan K, Surette MG (2007) Нормы охраны окружающей среды для систем определения кворума Pseudomonas aeruginosa PAO1 Las и Rhl.J Bacteriol 189: 4827-4836. doi: https://doi.org/10.1128/JB.00043-07. PubMed: 17449617.
  26. 26. Folkesson A, Jelsbak L, Yang L, Johansen HK, Ciofu O et al. (2012)Адаптация Pseudomonas aeruginosa к муковисцидозу дыхательных путей: эволюционная перспектива. Nat Rev Microbiol 10: 841-851. doi: https://doi.org/10.1038/nrmicro2907. PubMed: 23147702.
  27. 27. Köhler T, Buckling A, van Delden C (2009)Сотрудничество и вирулентность клинических популяций Pseudomonas aeruginosa .Proc Natl Acad Sci USA 106: 6339-6344. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.0811741106. PubMed: 1

    72.

  28. 28. Saiman L, Marshall BC, Mayer-Hamblett N, Burns JL, Quittner AL et al. (2003)Азитромицин у пациентов с муковисцидозом, хронически инфицированных Pseudomonas aeruginosa : рандомизированное контролируемое исследование. ДЖАМА 290: 1749-1756. doi: https://doi.org/10.1001/jama.290.13.1749. PubMed: 14519709.
  29. 29. Имамура Ю., Хигасияма Ю., Томоно К., Изумикава К., Янагихара К. и др.(2005) Азитромицин оказывает бактерицидное действие на Pseudomonas aeruginosa посредством взаимодействия с наружной мембраной. Противомикробные агенты Chemother 49: 1377-1380. doi: https://doi.org/10.1128/AAC.49.4.1377-1380.2005. PubMed: 157

    .

  30. 30. Buyck JM, Plésiat P, Traore H, Vanderbist F, Tulkens PM et al. (2012) Повышенная чувствительность Pseudomonas aeruginosa к макролидам и кетолидам в культуральной среде эукариотических клеток и биологических жидкостях из-за снижения экспрессии oprM и повышенной проницаемости внешней мембраны.Clin Infect Dis 55: 534-542. doi: https://doi.org/10.1093/cid/cis473. PubMed: 22573850.
  31. 31. Cugini C, Morales DK, Hogan DA (2010) Candida albicans -продуцируемый фарнезол стимулирует Pseudomonas выработку хинолонового сигнала в LasR-дефектных штаммах Pseudomonas aeruginosa . Микробиология 156: 3096-3107. doi: https://doi.org/10.1099/mic.0.037911-0. PubMed: 20656785.

Исследование доступности теломерных последовательностей с помощью FRET-PAINT: доказательства компактности теломер в зависимости от длины | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Одноцепочечные теломерные выступы имеют длину около 200 нуклеотидов и могут образовывать тандемные G-квадруплексные (GQ) структуры, которые снижают их доступность для нуклеаз и белков, активирующих реакцию на повреждение ДНК.Неизвестно, складываются ли эти тандемные GQ дальше, образуя компактные суперструктуры, которые могут обеспечить лучшую защиту для более длинных теломер. Мы сообщаем об измерениях одиночных молекул, в которых доступность молекул теломерной ДНК человека длиной 24–144 нуклеотида проверяется с помощью короткой молекулы ПНК, комплементарной одному повтору GGGTTA, как это реализовано в методе FRET-PAINT. Связывание цепи PNA с доступными последовательностями GGGTTA приводит к дискретным вспышкам FRET, которые анализируют с точки зрения их времени пребывания, частоты связывания и топографического распределения.Частота связывания была выше для связывания с промежуточными областями теломерной ДНК по сравнению с 3′- или 5′-концами, что позволяет предположить, что эти области более доступны. Примечательно, что частота связывания на теломерный повтор монотонно уменьшалась с увеличением длины теломер. Эти результаты согласуются с тем, что теломеры образуют более компактные структуры при большей длине, что снижает доступность этих критических участков генома.

ВВЕДЕНИЕ

Теломеры человека состоят из длинных участков гексануклеотидных повторов d(GGGTTA), которые заканчиваются 3′-концом одноцепочечного выступа длиной в несколько сотен нуклеотидов (нт) (1–5).После каждого раунда репликации теломеры укорачиваются до тех пор, пока не запустится старение или апоптоз, когда длина выступа укорачивается примерно до 50 нт (6). Теломераза, обратная транскриптаза, удлиняет теломеры, добавляя повторяющиеся сегменты d(GGGTTA) к 3′-концу с использованием матрицы РНК TERRA. Теломераза высоко экспрессируется в большинстве раковых клеток (7–9), тогда как в нормальных клетках ее активность очень низкая (10). Четыре повтора последовательности d(GGGTTA) образуют структуру G-квадруплекса (GQ) in vitro (11,12) и in vivo (13–17).Сложенные копланарные тетрады, стабилизированные парами оснований типа Хугстина и одновалентными катионами, являются характеристиками структуры GQ (18–20). Структуры GQ очень стабильны и, как предполагается, защищают уязвимые теломерные выступы от ферментативной активности, уменьшая их доступность (21). Теломерные GQ человека ингибируют активность теломеразы, делая концы теломер недоступными для опосредованного теломеразой удлинения (22–24). Этот потенциал в сочетании с их четкой планарной структурой сделал их привлекательной мишенью для противораковых препаратов, которые стабилизируют GQ против активности теломеразы (25). Таким образом, изучение доступности теломерных выступов человека и характеристик укладки теломерных GQ имеет большое значение.

В многочисленных исследованиях сообщается о взаимосвязи между условиями раствора и стабильностью, топологией и путями укладки отдельных молекул GQ (20, 24, 26–30) и их взаимодействиями с малыми молекулами, стабилизирующими GQ (31). Их устойчивость к белкам, связывающим одноцепочечную ДНК (32, 33) и геликазам (34–36), также была исследована. Тем не менее, теломерные выступы достаточно длинные, чтобы вместить около 10 тандемных GQ, которые могут образовывать структуры более высокого порядка, влияющие на общую доступность теломер (37–39).Достижения в синтезе теломерных повторов высокой чистоты, значительно более длинных, чем обычно используемые четыре повтора d(GGGTTA), позволили расширить биофизические исследования на последовательности, которые лучше имитируют выступающие теломеры. Более ранние работы (40–47) были сосредоточены на понимании структур, образованных несколькими GQ, потенциального взаимодействия между ними и того, как такие взаимодействия влияют на общую компактность и стабильность. Однако единого мнения по этим вопросам до сих пор не сложилось. Различные исследования обнаружили незначительные взаимодействия, стабилизирующие стэкинг-взаимодействия или фрустрированные и дестабилизирующие взаимодействия из-за соседних свернутых GQ, т.е.е. негативная кооперативность. Резюме этих исследований приводится ниже. Для краткости последовательность d(GGGTTA) будет называться «G-трактом» в этом резюме и в остальной части рукописи.

Использование биофизических анализов, Yu et al. пришел к выводу, что теломерные последовательности, которые содержат 8–16 G-трактов, образуют последовательные тандемные GQ, связанные с линкерами TTA, как бусины на нитке, с незначительным стекинговым взаимодействием между GQ (40). Используя аналогичные методы и моделирование молекулярной динамики, Petraccone et al. предположили, что последовательности, содержащие 8–12 G-трактов, образуют структуры более высокого порядка с двумя или тремя смежными GQ соответственно (41). Два исследования с помощью атомно-силовой микроскопии теломерной последовательности длиной 96 нуклеотидов дали разные результаты, когда Xu et al. сообщили о формировании компактной структуры из четырех тандемных GQ (42), а Wang et al. сообщили только о двух тандемных GQ (43). В исследовании оптического пинцета Punnoose et al. сообщалось, что GQ формировались случайным образом в длинных выступах теломер в течение нескольких секунд, но эти GQ были отделены друг от друга неструктурированными G-трактами (44).Это наблюдение было оправдано тем, что в процессе складывания преобладала кинетика, а не термодинамика. Используя электронную микроскопию, Kar et al. показали, что очень длинные (до 20 000 н.) теломерные последовательности человека в одноцепочечной ДНК (оцДНК) могут спонтанно конденсироваться в цепочки из больших дискретных бусообразных частиц двух разных размеров, уплотняя теломерную ДНК почти в 12 раз по длине. 45). В исследовании ЯМР Sannohe et al. предложил образование палочковидных структур высшего порядка в Br G-замещенных теломерных олигонуклеотидах человека (46). В другом биофизическом исследовании Vorlíčková et al. сообщалось, что термостабильность GQ снижается с увеличением количества G-трактов для длинных теломерных последовательностей 1–17 G-трактов, что предполагает дестабилизирующие взаимодействия между тандемными GQ (47). Принимая во внимание чувствительность конформации и стабильности даже одного теломерного GQ к отжигу, хранению и ионным условиям (48), мы полагаем, что некоторые из расхождений между этими исследованиями связаны с факторами, связанными с подготовкой образца и условиями анализа.

В этом исследовании мы исследовали, как доступность теломер изменяется в зависимости от длины последовательности и положения сайтов-мишеней внутри теломеры. Последовательности теломерной ДНК, содержащие 4–24 G-тракта (24–144 нуклеотида), которые могут образовывать 1–6 тандемных GQ, исследовали на уровне одной молекулы с использованием техники FRET-PAINT (49, 50), которая сочетает ДНК-PAINT (49, 50). 51) (Накопление точек для визуализации в наноразмерной топографии) с помощью спектроскопии переноса энергии в резонансе Фёрстера с одной молекулой (smFRET). DNA-PAINT использовался как метод сверхвысокого разрешения, поскольку он позволяет флуоресцентно меченым ДНК-зондам временно связываться с различными областями системы и позволяет с высокой точностью локализовать сайты связывания. Накопив большие наборы таких событий связывания и локализации, распределенных во времени, стало возможным построить структуры за пределами дифракционного предела. Теломерные последовательности, которые исследовались в этом исследовании, также имеют несколько сайтов связывания (G-Tracts), которые распределены по выступающим теломерам и не обязательно являются статичными.Следовательно, опрос таких сайтов с помощью зондов, которые временно связываются, может выявить детали лежащих в их основе структур. Однако теломерные последовательности образуют компактные структуры с характерными длинами в диапазоне 1–10 нм, что является сложной задачей даже для микроскопии сверхвысокого разрешения. С другой стороны, это идеальный диапазон для smFRET, который побудил нас синтезировать элементы DNA-PAINT, такие как временное связывание флуоресцентно меченных нуклеиновых кислот, с помощью спектроскопии smFRET, которая позволяет разрешать субнанометровые расстояния в масштабе длины интерес.

В нашем подходе короткая цепь пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), которая комплементарна одному G-тракту и флуоресцентно помечена акцепторным флуорофором (Cy5), вводится в микрофлюидный канал, содержащий иммобилизованную на поверхности частичную дуплексную ДНК. (пдДНК). Конструкции пдДНК помечены донорным флуорофором (Cy3) и содержат теломерные последовательности на выступающих концах (рис. 1А и В). Су3-пдНК, иммобилизованная на поверхности, служит конструкцией для стыковки, а Су5-ПНК — нитью имиджера.Молекула Cy5-PNA временно связывается с G-трактами, которые не являются частью GQ, что приводит к сигналу FRET, который варьируется в зависимости от того, насколько далеко Cy5-PNA связывается с Cy3. Используя достаточно низкую концентрацию Cy5-PNA, каждое событие связывания и диссоциации можно обнаружить изолированно от других событий. Мы определили, как частота, время пребывания и топография событий связывания варьируются для шести различных конструкций ДНК, которые могут образовывать 1–6 GQ. Для каждой из этих конструкций мы также охарактеризовали, как время пребывания и частота связывания изменяются для разных сегментов последовательности, т.е.грамм. 3′-конец, средний участок или 5′-конец.

Рис. 1.

Схема конструкций ДНК и пример трассировки smFRET. ( A ) Конструкции частичной дуплексной ДНК были образованы биотинилированной короткой цепью (помеченной донорным флуорофором Cy3) и более длинной цепью, которая содержит теломерный выступ с 4–24 повторами последовательности GGGTTA. Для краткости показаны только три из шести исследованных конструкций. Конструкции 4G-Tract, 16G-Tract и 24G-Tract могут складываться максимум в один, четыре и шесть тандемных GQ соответственно.( B ) Схема поверхности канала smFRET, где конструкции пдДНК иммобилизованы на пегилированной поверхности посредством связывания биотина и нейтравидина. Донорский флуорофор возбуждается в режиме TIR лазерным лучом с длиной волны 532 нм. Нить ПНК, которая помечена акцепторным флуорофором (Cy5), комплементарна G-тракту и связывается с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени перед диссоциацией. Эти события связывания приводят к вспышкам интенсивности акцептора и эффективности FRET.( C ) Пример временной трассы smFRET, которая показывает пять событий связывания с одним выступающим теломером. Время пребывания для одного из этих событий связывания указано оранжевыми стрелками. Привязка к разным сегментам выступа приводит к разным уровням FRET.

Рис. 1.

Схема конструкций ДНК и пример трассировки smFRET. ( A ) Конструкции частичной дуплексной ДНК были образованы биотинилированной короткой цепью (помеченной донорным флуорофором Cy3) и более длинной цепью, которая содержит теломерный выступ с 4–24 повторами последовательности GGGTTA.Для краткости показаны только три из шести исследованных конструкций. Конструкции 4G-Tract, 16G-Tract и 24G-Tract могут складываться максимум в один, четыре и шесть тандемных GQ соответственно. ( B ) Схема поверхности канала smFRET, где конструкции пдДНК иммобилизованы на пегилированной поверхности посредством связывания биотина и нейтравидина. Донорский флуорофор возбуждается в режиме TIR лазерным лучом с длиной волны 532 нм. Нить ПНК, которая помечена акцепторным флуорофором (Cy5), комплементарна G-тракту и связывается с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени перед диссоциацией.Эти события связывания приводят к вспышкам интенсивности акцептора и эффективности FRET. ( C ) Пример временной трассы smFRET, которая показывает пять событий связывания с одним выступающим теломером. Время пребывания для одного из этих событий связывания указано оранжевыми стрелками. Привязка к разным сегментам выступа приводит к разным уровням FRET.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ДНК-конструкции

последовательности ДНК и ПНК приведены в дополнительной таблице S1.Конструкции pdDNA были получены путем отжига короткой (18 нуклеотидов) стержневой цепи с биотином на 3′-конце и Cy3 на 5′-конце, а также длинной нити, которая содержит последовательность, комплементарную стеблю и 4–24 G-трактам. . Две нити нагревали до 95°C в течение 3 мин, затем охлаждали до 30°C с шагом снижения температуры на 5°C и выдерживали по 3 мин на каждом этапе в термоциклере (Hybaid Omn-E Thermal Cycler). . Реакцию отжига проводили при 150 мМ KCl и 2 мМ MgCl 2 (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовались 150 мМ LiCl и 2 мМ MgCl 2 ).

Длинные нити с 8–24 G-трактами были приобретены у Eurofins Genomics (Луисвилл, Кентукки, США) без дополнительной очистки, в то время как неочищенный 4G-тракт и очищенная ВЭЖХ цепочка ствола были приобретены у Integrated DNA Technologies (Коралвилл, Айова , США). Все неочищенные нити были очищены собственными силами с использованием денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE). На дополнительном рисунке S1 показаны рентгенограммы денатурирующего PAGE для очищенных олигонуклеотидов ДНК, радиоактивно меченных изотопом фосфора-32.Очищенную ВЭЖХ короткую стыковочную цепь Cy5-PNA приобретали у PNA Bio (Thousand Oaks, CA, USA). Схемы конструкций pd-4G-Tract, pd-16G-Tract и pd-24G-Tract показаны на рисунке 1A, где предполагалась антипараллельная конформация GQ и максимальное количество складок GQ.

Подготовка проб и анализ smFRET

Просверленные лазером кварцевые предметные стекла и покровные стекла были тщательно очищены гидроксидом калия (КОН) и ацетоном с последующим травлением пираний, покрытием аминосиланом и пассивацией NHS-эфир-полиэтиленгликолем (ПЭГ).Для пассивации поверхности использовали смесь ПЭГ с соотношением м-ПЭГ-5000:биотин-ПЭГ-5000 100:2 (Laysan Bio Inc.). ПЭГ препятствует неспецифическому связыванию молекул ДНК и ПНК с поверхностью, тогда как биотин-ПЭГ-5000 предлагает точку присоединения для молекул биотинилированной ДНК, которые соединяются с биотином-ПЭГ через нейтравидин. Дополнительный цикл ПЭГилирования проводили с использованием небольшого (333 Да) MS(PEG) 4 (приобретенного у Thermofisher Scientific) для уплотнения слоя ПЭГ. Камеры для образцов готовили, прокладывая двухстороннюю ленту между предметным стеклом и покровным стеклом, оба из которых были пегилированы.Камеру обрабатывали 1% (об./об.) Tween-20 (15 мин инкубации) с последующей тщательной промывкой и введением 0,01 мг/мл нейтравидина.

Образцы пдДНК разбавляли до ~40 пМ в несколько этапов и инкубировали в камере для образцов в течение 2–5 минут при 150 мМ KCl (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовалось 150 мМ LiCl) и 2 мМ MgCl 2 , который также сохраняется при всех измерениях. Затем камеры промывали буфером для визуализации для удаления избытка ДНК.Этот протокол позволил иммобилизовать 300–330 молекул на площадь изображения ~ 50 × 100 мкм 2 . Буфер для визуализации содержал основание Tris (50 мМ, pH 7,5), 2 мМ Trolox, 0,8 мг/мл глюкозы, 0,1 мг/мл глюкозооксидазы, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ MgCl 2 и 150. мМ KCl (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где вместо 150 мМ KCl использовалось 150 мМ LiCl) и 40 нМ Cy5-PNA. Исходный раствор цепи Cy5-PNA нагревали в течение 10 минут при 85°C для повышения растворимости.После извлечения из нагревательной бани пробирку, содержащую ПНК, оставляли при комнатной температуре на 15 мин, после чего ее разбавляли в 100-кратном растворе для визуализации. Раствор для визуализации, содержащий Cy5-PNA, инкубировали с молекулами ДНК в канале в течение 15 минут перед записью видео. Фильмы из 2000 кадров были записаны при времени интегрирования кадров 100 мс/кадр.

ЛАДНАЯ КРАСКА

Схема анализа FRET-PAINT представлена ​​на рисунке 1B. При возбуждении лазерным лучом с длиной волны 532 нм меченные Cy3 образцы pdDNA, иммобилизованные на поверхности, дают почти нулевой FRET, если только нить Cy5-PNA не связывается с G-трактом на конце.Всплески интенсивности акцептора и эффективности FRET происходят, когда Cy5-PNA связывается с G-трактом.

Настройка визуализации

Измерения проводились с использованием флуоресцентной установки призменного типа с полным внутренним отражением (ПВО), оснащенной микроскопом Olympus IX-71 и камерой Andor IXON EMCCD (IXON DV-887 EMCCD, Andor Technology, CT, USA-теперь часть Оксфордские инструменты). Камера IXON имеет разрешение 512 × 512 пикселей и размер пикселя 16 мкм. Донорский флуорофор возбуждали лазерным лучом с длиной волны 532 нм (Spectra Physics Excelsior).Для сбора сигнала флуоресценции использовали водный объектив Olympus (60×, 1,20 NA). Общее увеличение в нашей установке составляет 90x, что дает эффективный размер пикселя 178 нм. Интенсивность лазерного луча составляла примерно 1 кВт/см 2 .

Анализ данных

Записанные фильмы были проанализированы с использованием специального программного обеспечения, написанного на C++, для создания временных кривых интенсивности донора ( I D ) и интенсивности акцептора ( I A ) для каждой молекулы.Используя специальный код MATLAB, временные трассы были проверены, чтобы убедиться, что они представляют отдельные молекулы. Фон был вычтен из каждой из этих выбранных молекул, которые затем использовались для определения времени пребывания, частоты связывания и распределения FRET, представленных в этой рукописи. Фрета эффективность ( E FRET ) было рассчитано с использованием E FRET = I A / ( I ( I A + I D ).Гистограммы популяции E FRET (фиг. 2A) были построены из проверенных следов одиночных молекул, которые показали по крайней мере одно событие связывания цепи Cy5-PNA. Вклад молекул нормализовали таким образом, чтобы каждая молекула вносила одинаковый вклад в гистограмму, а общую популяцию гистограммы нормализовали до 100%. Отобранные одиночные молекулы, которые не демонстрировали никакого события связывания, вносили свой вклад в пик только донора (DO), что связано с утечкой эмиссии донора в акцепторный канал.Пик DO использовался в качестве эталона для смещения DO E FRET до нуля и масштабирования диапазона FRET.

Рис. 2.

Нормализованные гистограммы FRET на основе FRET-PAINT. ( A ) Каждая нормализованная гистограмма эффективности FRET построена из сотен коротких событий связывания PNA, как показано на рисунке 1C (точные числа приведены в подписи к рис. 3, где эти события проанализированы с точки зрения их времени пребывания). По мере увеличения количества G-трактов популяция состояний с более низкой эффективностью FRET увеличивается, поскольку становятся доступными сайты связывания, расположенные дальше от донора.Количество молекул (теломерные выступы, у которых было хотя бы одно событие связывания) на каждой гистограмме составляет N = 127, 170, 210, 260, 185 и 230 для 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и конструкция 24G-Tract соответственно. Красная стрелка в конструкции 24G-Tract указывает на уровень E FRET = 0,13, который используется в качестве порога на рисунке 3. ( B ). [ E FRET > 0,50] состояний.Как и ожидалось, это соотношение увеличивается по мере увеличения количества G-трактов.

Рис. 2.

Нормализованные гистограммы FRET на основе FRET-PAINT. ( A ) Каждая нормализованная гистограмма эффективности FRET построена из сотен коротких событий связывания PNA, как показано на рисунке 1C (точные числа приведены в подписи к рис. 3, где эти события проанализированы с точки зрения их времени пребывания). По мере увеличения количества G-трактов популяция состояний с более низкой эффективностью FRET увеличивается, поскольку становятся доступными сайты связывания, расположенные дальше от донора.Количество молекул (теломерные выступы, у которых было хотя бы одно событие связывания) на каждой гистограмме составляет N = 127, 170, 210, 260, 185 и 230 для 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и конструкция 24G-Tract соответственно. Красная стрелка в конструкции 24G-Tract указывает на уровень E FRET = 0,13, который используется в качестве порога на рисунке 3. ( B ). [ E FRET > 0,50] состояний.Как и ожидалось, это соотношение увеличивается по мере увеличения количества G-трактов.

Уровни E FRET и время задержки (τ) событий связывания во временных кривых smFRET были охарактеризованы с помощью автоматизированного и беспристрастного метода обнаружения шагов, Stepfinder (52), который может определять шаги в большие наборы данных, не требуя предварительного знания об их распределении. Он начинается с подгонки одного шага к данным с расположением и размером, которые дают наименьший остаточный хи-квадрат (53).На рис. 3А показана временная трасса smFRET и соответствующая подгонка Stepfinder (красная линия). Частоты связывания (общее количество событий связывания/общее время наблюдения) рассчитывали на основе подгонок Stepfinder . Общее время наблюдения представляет собой сумму отдельных времен наблюдения за каждой молекулой, полученных из временных трасс smFRET. Индивидуальное время наблюдения для каждой молекулы — это период от начала записи до фотообесцвечивания донора или до окончания записи, в зависимости от того, что наступит раньше.{- 1}}$|⁠. Анализ начальной загрузки (54) использовали для определения планок погрешностей, связанных с частотами связывания для каждой конструкции G-Tract. При анализе начальной загрузки сценарий MATLAB сгенерировал 20 000 наборов начальной загрузки с уровнем достоверности 95% из набора данных, в котором указано количество событий привязки в каждой временной трассе (включая трассы, которые не показали никакой привязки). Затем общее количество событий связывания в каждом наборе начальной загрузки делили на общее время наблюдения для каждого набора. Это приводит к распределению частот, как показано на рисунке 5A, которое можно подогнать к функции Гаусса для определения пиковой частоты и стандартного отклонения.Положения пиков этих распределений прекрасно согласуются со средними частотами, определенными путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения фактического набора данных (а не сгенерированных наборов данных начальной загрузки). Стандартное отклонение этих распределений использовалось для оценки неопределенности частот связывания, представленных на рисунке 5B-C. В таблице 1 представлены общее количество временных трасс, общее количество событий связывания, общее время наблюдения и результирующая частота связывания для каждой конструкции ДНК.

Рисунок 3.

Определение характерного времени выдержки. ( A ) Пример временной трассы smFRET, показывающий семь событий связывания ПНК с одним выступающим теломером. Подгонка Stepfinder (красная линия) используется для характеристики уровней FRET и времени пребывания (τ) событий связывания. Пунктирная линия E FRET = 0,13 представляет собой пороговый уровень, используемый для рассмотрения всплеска FRET как события связывания PNA, а не шума.Пакеты сигналов также должны удовлетворять τ≥300 мс, чтобы считаться событием связывания. ( B ) Распределение времени пребывания, определенное с помощью Stepfinder , подходящего для каждой конструкции. Распределения были лучше описаны с помощью двойной экспоненциальной (красная линия) аппроксимации по сравнению с одинарной экспоненциальной (пунктирная голубая линия), которая последовательно занижала количество событий с более длительным временем задержки. В двойной экспоненте |${t_1}$| (более быстрое затухание) — характерное время для коротких выдержек и |${t_2}$| (более медленное затухание) — характерное время для длительных выдержек.Количество событий связывания на гистограммах для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 331, 394, 561, 556, 563 и 604 соответственно.

Рис. 3.

Определение характерного времени выдержки. ( A ) Пример временной трассы smFRET, показывающий семь событий связывания ПНК с одним выступающим теломером. Подгонка Stepfinder (красная линия) используется для характеристики уровней FRET и времени пребывания (τ) событий связывания. Штриховая линия у E FRET = 0.13 представляет пороговый уровень, используемый для рассмотрения пакета FRET как события связывания PNA, а не шума. Пакеты сигналов также должны удовлетворять τ≥300 мс, чтобы считаться событием связывания. ( B ) Распределение времени пребывания, определенное с помощью Stepfinder , подходящего для каждой конструкции. Распределения были лучше описаны с помощью двойной экспоненциальной (красная линия) аппроксимации по сравнению с одинарной экспоненциальной (пунктирная голубая линия), которая последовательно занижала количество событий с более длительным временем задержки.В двойной экспоненте |${t_1}$| (более быстрое затухание) — характерное время для коротких выдержек и |${t_2}$| (более медленное затухание) — характерное время для длительных выдержек. Количество событий связывания на гистограммах для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 331, 394, 561, 556, 563 и 604 соответственно.

Таблица 1. Статистика

, используемая для расчета частоты связывания на рисунке 5. N ДНК относится к числу проанализированных молекул ДНК (временные кривые), N B к количеству событий связывания ПНК, T tot к общему времени наблюдения, F AVE до средней частоты ( N B / T TOT ) и F пик до пиковой частоты распределения нагрузки на рисунке 5А

9116
Конструкция .{ — 3}}{\boldsymbol{\}}$|s −1 ) .
4G-Тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-Тракт тысяча шестьсот тридцать два 395 110326 3,58 3,57
12G-TR 1651 476 476

5. 17 5.16 5.16
16г-Trail 2252 557 557 110646 5.03 5,20
20G-Тракт 1 748 449

4,84 4,48
24G-Тракт тысячу семьсот девяносто-четыре 567 89421 6,34 6,33
9116
Конструкция . N ДНК . Н Б .{ — 3}}{\boldsymbol{\}}$|s −1 ) .
4G-Тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-Тракт тысяча шестьсот тридцать два 395 110326 3,58 3,57
12G-TR 1651 476 476

5. 17 5.16 5.16
16г-Trail 2252 557 557 110646 5.03 5,20
20G-Тракт 1748 449

4,84 4,48
24G-Тракт 1794 567 89421 6,34 6,33
Таблица 1.

Статистические данные, использованные для расчета частоты связывания на рисунке 5. N ДНК относится к числу проанализированных молекул ДНК (временные кривые), N B к количеству событий связывания ПНК, T tot к общему времени наблюдения, f ave к средней частоте ( N B / T tot ) и f f tot )

9116
Конструкция .{ — 3}}{\boldsymbol{\}}$|s −1 ) .
4G-Тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-Тракт тысяча шестьсот тридцать два 395 110326 3,58 3,57
12G-TR 1651 476 476

5.17 5.16 5.16
16г-Trail 2252 557 557 110646 5.03 5,20
20G-Тракт 1 748 449

4,84 4,48
24G-Тракт тысячу семьсот девяносто-четыре 567 89421 6,34 6,33
9116
Конструкция . N ДНК . Н Б .{ — 3}}{\boldsymbol{\}}$|s −1 ) .
4G-Тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-Тракт тысяча шестьсот тридцать два 395 110326 3,58 3,57
12G-TR 1651 476 476

5.17 5.16 5.16
16г-Trail 2252 557 557 110646 5.{ — [ {( {x — {x_0}} )/{t_2}} ]}}$|⁠) функции экспоненциального затухания для гистограмм на рисунке 3B. Происхождение также использовалось для проверки статистической гипотезы на рисунках 3B, 4B, C и 5D. Количество молекул или количество событий связывания, включенных в каждый набор данных, указано в подписи к соответствующему рисунку.

Рисунок 4.

Распределение времени задержки. ( A ) Контурные графики времени пребывания против . Уровни FRET. Здесь показан диапазон времени выдержки 1–7 с, а контурные графики для более коротких выдержек приведены на дополнительном рисунке S4.Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323 соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C). ( B ) Среднее время пребывания в разных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET ближе к 3′-концу конструкции ДНК. (C) Время выдержки для каждого диапазона FRET в (B) усреднено по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для различных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

Рис. 4.

Распределение времени задержки. ( A ) Контурные графики времени пребывания против .Уровни FRET. Здесь показан диапазон времени выдержки 1–7 с, а контурные графики для более коротких выдержек приведены на дополнительном рисунке S4. Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323 соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C).( B ) Среднее время пребывания в разных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET ближе к 3′-концу конструкции ДНК. (C) Время выдержки для каждого диапазона FRET в (B) усреднено по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для различных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

Рисунок 5.

Частоты связывания PNA. ( A ) Гистограммы частоты связывания из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, а разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением. Каждая гистограмма была сгенерирована из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) Диаграмма рассеяния средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-Tract (красный) для всех событий (включая короткое и длинное время пребывания).Частота связывания имеет тенденцию к увеличению по мере увеличения количества G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на G-тракт постоянно снижается. ( C ) График рассеяния средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-Tract (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ>2t 1 ). Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все события связывания. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) рассчитываются из стандартных отклонений гауссовых подгонок к распределениям в (A).( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5′-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET. Столбики погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

Рис. 5.

Частоты связывания PNA. ( A ) Гистограммы частоты связывания из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, а разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением. Каждая гистограмма была сгенерирована из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) Диаграмма рассеяния средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-Tract (красный) для всех событий (включая короткое и длинное время пребывания). Частота связывания имеет тенденцию к увеличению по мере увеличения количества G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на G-тракт постоянно снижается. ( C ) График рассеяния средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-Tract (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ>2t 1 ).Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все события связывания. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) рассчитываются из стандартных отклонений гауссовых подгонок к распределениям в (A). ( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5′-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET.Столбики погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ FRET-PAINT для определения доступности длинных теломерных выступов

Анализ FRET-PAINT был разработан для изучения доступности тандемных GQ, образованных в длинных теломерных последовательностях (рис. 1А и В). Связывание нити имиджера, Cy5-PNA, с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени приводит к вспышкам интенсивности акцептора и эффективности FRET ( E FRET ).Связывание с разными G-Tract приводит к всплеску с разными уровнями E FRET . На рис. 1C показан образец временной трассы smFRET, демонстрирующий такие всплески.

Выбор ПНК в качестве нити формирователя изображения имел решающее значение для этого анализа. Диссоциация нити имиджера должна быть достаточно быстрой, чтобы гарантировать, что отдельные события связывания с конструкцией стыковки не перекрываются, что устанавливает верхний предел концентрации нити имиджера. С другой стороны, концентрация должна быть достаточно высокой, чтобы наблюдать большое количество событий связывания и получать надежные статистические данные (50).Концентрацию цепи Cy5-PNA поддерживали на уровне 40 нМ, что было достаточно высоким для получения надежной статистики связывания, но достаточно низким для поддержания низкого фона флуоресценции и незначительных ложноположительных пиков FRET из-за неспецифического связывания Cy5-PNA с поверхностью в вблизи стыковочных сооружений. Нить имидж-сканера также должна оставаться связанной с стыковочной конструкцией в течение достаточно долгого времени, чтобы обеспечить надежное обнаружение событий связывания, то есть, по крайней мере, в несколько раз дольше, чем время интеграции кадра (100 мс для наших измерений). Это обычно может быть достигнуто за счет использования более длинных цепей формирователя изображений, которые имеют больше оснований, комплементарных конструкции стыковки. Однако использование более длинных нитей имидж-сканера потребует их связывания с более чем одним G-трактом, что приведет к перекрестным помехам между соседними G-трактами. В идеале нить имиджера должна иметь комплементарность только одному G-тракту, т.е. 6 нт или меньше. Несмотря на то, что использовались последовательности, отличные от наших, время диссоциации для цепей имидж-сканера ДНК длиной 6 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 8 нуклеотидов и 9 нуклеотидов было указано как 3.7 мс, 4,8 мс, 63 мс и 670 мс соответственно (50). Учитывая эти времена диссоциации и ограничения во временном разрешении анализов smFRET (10–100 мс), минимально возможная длина нити имидж-сканера ДНК будет составлять 8–9 нт. Однако наши исследования показывают, что времена диссоциации более 1 с возможны с нитью PNA imager, комплементарной одному G-Tract.

Дополнительные рисунки S2 и S3 демонстрируют подтверждающие измерения, которые поддерживают использование анализа FRET-PAINT для изучения доступности длинных теломерных выступов.Ожидается, что присутствие GQ и их стабильность будут влиять как на частоту связывания, так и на время пребывания цепей ПНК на выступающих концах теломер. Ожидается, что GQ с более высокой стабильностью будут разворачиваться реже, что приведет к менее частым событиям связывания PNA. Ожидается также, что после их укладки более стабильные GQ будут более эффективно вытеснять любые связанные нити ПНК с теломерных выступов. Чтобы проверить, наблюдаются ли они в данных FRET-PAINT, мы сравнили время пребывания и частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в 150 мМ KCl и 150 мМ LiCl.Поскольку K + значительно более эффективен в стабилизации GQ по сравнению с Li + , мы ожидаем более длительного времени пребывания и более высоких частот связывания в LiCl по сравнению с KCl, что было подтверждено данными, представленными на дополнительных рисунках S2B-C и S3. Средние частоты связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract были соответственно в 8,4 и 6,8 раз выше в LiCl по сравнению с KCl (дополнительная фигура S2B-C). Характерные времена выдержки ( t 2 ) были равны 2.В 1 и 2,5 раза дольше в LiCl по сравнению с KCl для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract соответственно (дополнительная фигура S3). Кроме того, мы сравнили влияние небольшой молекулы, стабилизирующей GQ (36), на частоты связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в KCl (дополнительная фигура S2B, C). Как для конструкций 12G-Tract, так и для конструкций 16G-Tract частота связывания была в 2,9 раза ниже при использовании небольшой молекулы по сравнению с ее отсутствием. Наконец, мы сравнили частоты связывания в KCl и LiCl для конструкции, которая не может образовывать GQ (конструкция 1G-Tract) и имеет один сайт связывания.Мы наблюдали практически одинаковые частоты связывания для конструкции 1G-Tract в KCl и LiCl (дополнительная фигура S2A), что позволяет предположить, что различия, которые мы наблюдали для конструкций, образующих GQ, связаны с различиями в стабильности GQ.

Гистограммы вспышек FRET для конструкций 4G-Tract, 8G-Tract, 12G-Tract, 16G-Tract, 20G-Tract и 24G-Tract показаны на рисунке 2A. По мере увеличения количества G-трактов нижние состояния FRET становятся более заселенными, поскольку сайты связывания, расположенные дальше от донора, становятся доступными для Cy5-PNA.Увеличение популяции более низких состояний FRET количественно определяется отношением общей популяции состояний [E FRET <0,50] к [E FRET >0,50], как показано на рисунке 2B. С увеличением количества G-Tract в свесе это соотношение увеличивается с 0,13 для 4G-Tract до 0,72 для 24G-Tract. Уплотнение выступа за счет образования GQ сделало возможным изучение таких длинных последовательностей с помощью FRET.

Анализ времени ожидания

Программу Stepfinder использовали для характеристики уровней E FRET и времени пребывания (τ) событий связывания во временных кривых smFRET. На рис. 3А показана временная кривая smFRET с подгонкой Stepfinder (красная линия). Пунктирная линия при E FRET = 0,13 ( E FRET = 0,25 до коррекции DO) указывает пороговый уровень FRET для рассмотрения вспышки FRET как события связывания Cy5-PNA. Этот пороговый уровень FRET был определен на основе распределений FRET, представленных на рисунке 2A. Как показано красной стрелкой на гистограмме 24G-Tract, самой длинной изученной нами конструкции, имеется незначительная популяция FRET из-за событий связывания на E FRET  <0.13. Также требовалось, чтобы события оставались выше этого порогового уровня FRET в течение 4 последовательных точек, т.е. τ ≥300 мс, чтобы отличить их от случайных флуктуаций сигнала. Распределение времени пребывания для всех конструкций показано на рисунке 3B. Распределения времени пребывания подобраны с использованием одинарной и двойной экспоненциальных функций затухания, которые показаны пунктирными голубыми линиями и сплошными красными линиями на рисунке 3B. Результирующие подходящие параметры двойного экспоненциального затухания приведены в дополнительной таблице S2.Двойная экспоненциальная подгонка была значительно лучше, чем одинарная экспоненциальная подгонка для всех конструкций ( P  <0,001 для всех конструкций). F-статистика для этого сравнения приведена в дополнительной таблице S3. Двойная экспоненциальная подгонка дала постоянную времени быстрого затухания t 1 и постоянную более медленного затухания t 2 , которые перечислены на соответствующих гистограммах на рисунке 3B. В то время как быстрое время затухания одинаково для всех конструкций (≈0.7 ± 0,1 с), более медленные константы затухания находятся в диапазоне 4,0–8,6 с без явной зависимости от длины. Согласованность коротких времен пребывания для разных конструкций подразумевает, что они являются результатом одного и того же механизма, такого как частичная гибридизация PNA с G-трактами или с петлями TTA в GQ.

Данные о времени выдержки могут быть дополнительно проанализированы, чтобы выяснить, приводит ли связывание PNA к различным сегментам конструкции, что должно давать разные уровни FRET, к разным временам выдержки. Контурные графики времени пребывания против . E FRET были сконструированы, чтобы ответить на этот вопрос (рис. 4А). Чтобы исключить короткие события связывания, которые могут быть связаны с частичной гибридизацией зонда ПНК с теломерными последовательностями, мы включили время пребывания более 1,0 с на эти контурные графики. Для ясности рисунков верхний предел на этих графиках установлен равным 7,0 с, даже несмотря на то, что малонаселенные карманы существуют при более длительном времени выдержки. Контурные графики, которые включают более короткое время выдержки (<1.0 с) приведены на дополнительном рисунке S4. Связывание Cy5-PNA с 3'-концом и 5'-концом конструкции ДНК приводит к более низким и более высоким уровням FRET соответственно. Как и на рис. 2А, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением длины выступа. Чтобы оценить среднее время задержки для различных положений выступа, шкала E FRET (0,0–1,0) была разделена на пять сегментов FRET равной ширины 0,2, как показано белыми пунктирными линиями на рисунке 4A. Для каждой конструкции было рассчитано среднее время пребывания в каждом из этих сегментов, как показано на рисунке 4B.За исключением конструкции 20G-Tract, однофакторный анализ ANOVA не показал значимой разницы между средним временем пребывания для разных сегментов FRET для любой из конструкций. Чтобы получить глобальное среднее значение, время пребывания для каждого диапазона FRET было усреднено по всем конструкциям (рис. 4C). Односторонний анализ ANOVA в этом случае также не показал существенной разницы во времени пребывания для разных сегментов FRET. Статистика одностороннего теста ANOVA приведена в дополнительной таблице S4. На основании этого мы делаем вывод, что время пребывания для связывания с различными сегментами теломерного выступа не различимо в пределах разрешения наших измерений.

Частота связывания ПНК

Доступность теломер может быть определена количественно путем расчета частоты связывания нитей Cy5-PNA с G-трактами. Частота связывания рассчитывается путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения за каждой конструкцией. Количество событий связывания определяли с помощью пользовательского кода MATLAB, который обрабатывал совпадения, сгенерированные Stepfinder , и подсчитывал события связывания со временем задержки >300 мс и E FRET >0.13, как описано выше.

На рис. 5А показано распределение средних частот, полученных с помощью бутстрап-анализа. Пиковые значения этих распределений превосходно согласуются с расчетными средними частотами связывания, полученными путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения. Разброс в распределениях описывает неопределенность средних частот связывания. Планки погрешностей на рис. 5B и C представляют собой стандартное отклонение гауссовых подгонок к распределениям начальной загрузки, показанным на рис. 5A.

На рис. 5В показано, что частота связывания обычно увеличивается с увеличением длины теломер, что согласуется с увеличением числа потенциальных сайтов связывания. С другой стороны, частота связывания на G-Tract постоянно уменьшается с длиной теломер (рис. 5B, где включены как короткое, так и длинное время пребывания). Подобные тенденции также наблюдаются, когда рассматриваются только события связывания с τ> 2 t 1 , чтобы исключить события, которые потенциально представляют собой частичную гибридизацию PNA (рис. 5C).Снижение частоты связывания на G-Tract с увеличением длины теломер предполагает уплотнение в структуре, которое становится более заметным по мере увеличения длины теломер. Это может быть связано с формированием структур более высокого порядка, возможно, опосредованным наложением GQ.

На рисунке 5D показаны частоты связывания, классифицированные на основе их уровней FRET, где шкала FRET разделена на пять сегментов, как на рисунке 4B. Как и ожидалось, из-за близости донорского флуорофора к доступным сайтам связывания в более коротких конструкциях (таких как 4G-Tract или 8G-Tract) более высокие частоты связывания наблюдаются для более высоких сегментов FRET. Частоты связывания более равномерно распределяются для более длинных конструкций (таких как 20G-Tract или 24G-Tract), поскольку сайты связывания, расположенные дальше от донорского флуорофора, становятся доступными для связывания ПНК. Чтобы проверить, демонстрируют ли наблюдаемые частоты связывания значительные вариации для разных сегментов FRET, был проведен односторонний анализ ANOVA с повторными измерениями, который показал значительные различия в каждой конструкции. Результаты этого теста приведены в дополнительной таблице S5. Это важно, в частности, для более длинных конструкций, которые демонстрируют более высокие частоты связывания на промежуточных сегментах по сравнению с 3′- или 5′-концами.Мы также провели тест попарного сравнения для FRET-сегментов конструкции 20G-Tract и 24G-Tract, где частоты связывания для разных сегментов сравниваются с каждым из других сегментов. Результаты этого анализа представлены в виде контурного графика значений t на дополнительном рисунке S5 и в табличной форме в дополнительной таблице S6. Эти анализы показывают, что GQ на 3′- и 5′-концах выступов в среднем менее доступны по сравнению с промежуточными областями, что согласуется с тем, что GQs ингибируют экзонуклеазную активность на концах теломер (55).

Наши исследования показывают, что хотя события связывания становятся более частыми по мере увеличения длины теломерной ДНК, частота связывания на G-Tract последовательно снижается с увеличением длины теломер, что свидетельствует об общем уплотнении структуры при большей длине. Это обеспечивает потенциальную основу для понимания того, как более длинные теломерные выступы снижают их доступность, образуя более компактные структуры. Это уплотнение будет способствовать защите концов теломер от активности нуклеаз или агентов, которые в противном случае вызвали бы повреждение ДНК.Это также сделало бы теломерные выступы менее доступными для белков, связывающих одноцепочечную ДНК, таких как RPA, чье накопление на теломерах вызовет контрольную точку повреждения ДНК. С другой стороны, более компактная структура может также сделать теломерные GQ менее доступными для малых молекул и наложить более строгие требования на потенциальные противораковые препараты, предназначенные для ингибирования активности теломеразы.

С технической точки зрения мы демонстрируем возможность использования FRET-PAINT в качестве инструмента для изучения доступности теломерных последовательностей, сходных по длине с теми, которые встречаются в физиологических условиях.Используя ПНК в качестве зонда, который образует более стабильный гетеродуплекс с ДНК по сравнению с гомодуплексом ДНК-ДНК или гетеродуплексом ДНК-РНК, можно было уменьшить размер зонда таким образом, чтобы одиночный G-тракт опрашивается за один раз, сохраняя измеримое время задержки (∼1 с). Наши исследования также демонстрируют возможность расширения этого подхода на более сложные условия, где доступность теломер изучается в присутствии белков Shelterin, ДНК-связывающих белков, геликаз или агентов краудинга.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Все данные FRET для отдельных молекул, представленные в этой рукописи, могут быть предоставлены по запросу от соответствующего автора.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим доктора Луука Леффа (Технический университет Делфта, Нидерланды) за то, что он поделился с нами программой Stepfinder и за помощь в ее реализации.Мы хотели бы поблагодарить Кристин Йегер и Викторию Рейнольдс (статистический консалтинг, библиотеки Кентского государственного университета) за их помощь в статистическом анализе. Мы благодарим Эрика Йоки за помощь в корректуре и редактировании рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальных институтов здравоохранения, США [1R15GM109386 и 1R15GM123443 до H.B]. Финансирование платы за открытый доступ: NIH [1R15GM123443].

Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

1.

Блэкберн

Э.Х.

Структура и функция теломер

.

Природа

.

1991

;

350

:

569

573

.2.

Макаров

В.Л.

,

Hirose

Y.

,

Langmore

J.P.

Длинные G-хвосты на обоих концах хромосом человека указывают на механизм деградации C-цепи для укорочения теломер

.

Сотовый

.

1997

;

88

:

657

666

.3.

Райт

З.Е.

,

Тесмер

В.М.

,

Хаффман

К.Е.

,

Левен

С.Д.

,

Шай

Дж.В.

Нормальные хромосомы человека имеют длинные G-богатые теломерные выступы на одном конце

.

Гены Дев.

1997

;

11

:

2801

2809

.4.

Стюарт

С.А.

,

Бен-Порат

I.

,

Кэри

В.J.

,

O’Connor

B.F.

,

Hahn

W.C.

,

Weinberg

R.A

Эрозия одноцепочечного выступа теломер при репликативном старении

.

Нац. Жене.

2003

;

33

:

492

496

.5.

Верден

Р.Э.

,

Карлседер

J.

Репликация и защита теломер

.

Природа

.

2007

;

447

:

924

931

.6.

Rhodes

D.

,

Lipps

H.J.

Обзор и сводка G-квадруплексы и их регулирующая роль в биологии

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

;

43

:

8627

8637

.7.

Testorelli

C.

Теломераза и рак

.

Дж. Экспл. клин. Рак рез.

2003

;

22

:

165

169

.8.

Ханахан

Д.

,

Вайнберг

Р.А.

Признаки рака: следующее поколение

.

Сотовый

.

2011

;

144

:

646

674

.9.

Джафри

М.А.

,

Ансари

С.А.

,

Алкахтани

М.Х.

,

Шай

Дж.В.

Роль теломер и теломеразы в развитии рака и достижения в терапии, нацеленной на теломеразу

.

Геном Мед

.

2016

;

8

:

69

.10.

Шай

Дж.В.

,

Райт

З.Э.

Теломеры и теломераза в нормальных и раковых стволовых клетках

.

ФЭБС Письмо.

2010

;

584

:

3819

3825

.11.

Хендерсон

Э.

,

Хардин

К.К.

,

Прогулка

С.К.

,

Тиноко

И.

,

Блэкберн

Э.Х.

Олигонуклеотиды теломерной ДНК образуют новые внутримолекулярные структуры, содержащие пары оснований гуанин·гуанин

.

Сотовый

.

1987

;

51

:

899

908

.12.

Sen

D.

,

Gilbert

W.

Формирование параллельных четырехцепочечных комплексов богатыми гуанином мотивами в ДНК и его значение для мейоза

.

Природа

.

1988

;

334

:

364

366

.13.

Biffi

G.

,

TannaHill

,

D.

,

D.

,

MCCAFFERTY

J.

,

BALASUBRAMANAMANIAN

S.

Количественная визуализация ДНК G-квадруплексных структур в клетках человека

.

Нац. хим.

2013

;

5

:

182

186

.14.

Оганесян

Л.

,

Карлседер

Дж.

Теломерная броня: Слои концевой защиты

.

J. Cell Sci.

2009

;

122

:

4013

4025

.15.

Хендерсон

А.

,

Ву

Ю.

,

Хуанг

Ю.К.

,

Чавес

Э.А.

,

Платт

Дж.

,

Джонсон

Ф.Б.

,

Брош

Р.М.

,

Сен

Д.

,

Лансдорп

вечера

Обнаружение ДНК G-квадруплекса в клетках млекопитающих

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2014

;

42

:

860

869

.16.

Чжан

S.

,

Sun

H.

,

H.

,

Wang

L.

,

LIU

Y.

,

CHEN

H.

,

LI

Q.

,

Гуань

А.

,

Лю

М.

,

Tang

Y.

Мониторинг G-квадруплексов ДНК в живых клетках в режиме реального времени с помощью низкомолекулярного флуоресцентного зонда

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2018

;

46

:

7522

7532

.17.

Ди Антонио

М.

,

Понявич

А.

,

Радзявичюс

А.

,

Ранасинге

R.T.0002

,

Каталано

М.

,

Чжан

Х.

,

Шен

Дж.

,

Нидхэм

Л.-М.

,

Ли

С.Ф.

,

Кленерман

Д.

и др. .

Одномолекулярная визуализация образования G-квадруплекса ДНК в живых клетках

.

Нац. хим.

2020

;

12

:

832

837

.18.

Геллерт

М.

,

Липсетт

М.Н.

,

Дэвис

Д.Р.

Образование спирали гуаниловой кислотой

.

Проц. Натл. акад. науч. США

1962

;

48

:

2013

2018

.19.

Нейдл

С.

,

Паркинсон

Г.Н.

Структура теломерной ДНК

.

Курс. мнение Структура биол.

2003

;

13

:

275

283

.20.

Бердж

С.

,

Паркинсон

Г.№

,

Хейзел

П.

,

Тодд

А.К.

,

Neidle

S.

Квадруплекс ДНК: последовательность, топология и структура

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2006

;

34

:

5402

5415

.21.

Hwang

H.

,

Kreig

A.

,

Calvert

J.

,

Lormand

J.

,

Kwon

Y.

,

Дэйли

Дж.М.

,

Сун

П.

,

Опреско

П.Л.

,

Myong

S.

Длина теломерного выступа определяет структурную динамику и доступность для теломеразы и ALT-ассоциированных белков

.

Структура

.

2014

;

22

:

842

853

.22.

Ван

К.

,

Лю

Дж.К.

,

Чен

З.

,

Чжэн

К.В.

,

Чен

К.Ю.

,

Хао

Ю.Х.

,

Tan

Z.

Образование G-квадруплекса на 3′-конце теломерной ДНК ингибирует ее удлинение теломеразой, полимеразой и раскручивание геликазой

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2011

;

39

:

6229

6237

.23.

Чеонг

В.В.

,

Хедди

Б.

,

Лех

Си Джей

,

Фан

А.Т.

Ксантин и 8-оксогуанин в G-квадруплексах: образование тетрады G·G·X·O

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

;

43

:

10506

10514

.24.

Spiegel

J.

,

Adhikari

S.

,

Balasubramanian

S.

Структура и функция ДНК G-9003es.

Trends Chem

.

2020

;

2

:

123

136

.25.

Neidle

S.

Теломерный G-квадруплекс человека: текущий статус теломерных G-квадруплексов как терапевтических мишеней при раке человека

.

ФЕБС Дж.

2010

;

277

:

1118

1125

.26.

Серый

R.D.

,

Trent

J.O.

,

Стулья

Дж.B.

Пути сворачивания и разворачивания теломерного G-квадруплекса человека

.

Дж. Мол. биол.

2014

;

426

:

1629

1650

.27.

Бесси

I.

,

Йонкер

Х.Р.А.

,

Richter

C.

,

Schwalbe

H

Участие долгоживущих промежуточных состояний в сложном пути сворачивания теломерного G-квадруплекса человека

.

Анжю. хим. — Междунар. Эд.

2015

;

54

:

8444

8448

.28.

Marchand

A.

,

Gabelica

V.

Пути фолдинга и неправильного фолдинга ДНК G-квадруплекса

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2016

;

44

:

10999

11012

.29.

Бхаттачарья

Д.

,

Арахчилаге

Г.М.

,

Басу

С.

Катионы металлов в G-квадруплексной укладке и стабильности

.

Фронт. хим.

2016

;

4

:

38

.30.

Fujii

T.

,

Podbevšek

,

P.

,

стр.

,

Plavec

J.

,

J.

,

SUGIMOTO

N.

Влияние ионов металлов и сосуды на G-Quadrouplex Topology

.

Дж. Неорг. Биохим.

2017

;

166

:

190

198

.31.

Maleki

стр.

,

мА

Ю.

,

IIDA

K.

,

Nagasawa

K.

,

Balci

H.

Одиночная молекула Изучение флуоресцентно меченное производное теломестатина и G-квадруплексные взаимодействия

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2017

;

45

:

288

295

.32.

Рэй

С.

,

Бандария

Дж.Н.

,

Куреши

М.Х.

,

Yildiz

A.

,

Balci

H.

Образование G-квадруплекса в теломерах усиливает защиту POT1/TPP1 от связывания RPA

.

Проц. Натл. акад. науч. США

2014

;

111

:

2990

2995

.33.

Рэй

С.

,

Куреши

М.Х.

,

Малькольм

Д.В.

,

Будхатоки

Дж.B.

,

Çelik

U.

,

Balci

H.

Опосредованное RPA разворачивание систематически изменяющихся структур G-квадруплекса

.

Биофиз. Дж.

2013

;

104

:

2235

2245

.34.

BEDHATHOKI

J.B.

,

RAY

S.

,

S.

,

URBAN

V.

,

Janscak

стр.

,

Йод

j.g.

,

Балчи

Х.

RecQ-ядро BLM разворачивает теломерный G-квадруплекс в отсутствие АТФ

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

;

42

:

11528

11545

.35.

Будхатоки

Дж.Б.

,

Стаффорд

Э.Дж.

,

Йодх

Дж.Г.

,

Balci

H.

АТФ-зависимое разворачивание G-квадруплекса геликазой Блума демонстрирует низкую процессивность

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

;

43

:

5961

5970

.36.

Maleki

стр.

,

Mustafa

G.

,

G.

,

Gyawali

стр.

,

Budhathoki

JB

,

мА

Y.

,

Nagasawa

K.

,

Balci

H.

Количественная оценка влияния низкомолекулярных лигандов на стабильность G-квадруплекса против хеликазы Блума

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2019

;

47

:

10744

10753

.37.

Чандрадос

С. Д.

,

Хаагсма

А.К.

,

Ли

Ю.К.

,

Хван

Дж.Х.

,

Nam

J.M.

,

Joo

C.

Поверхностная пассивация для исследований белков с одной молекулой

.

Дж. Вис. Эксп.

2014

;

86

:

e50549

.38.

Neidle

S.

Квадруплексные нуклеиновые кислоты как новые терапевтические мишени

.

J. Med. хим.

2016

;

59

:

5987

6011

.39.

Абрахам Пунноуз

Дж.

,

Цуй

Й.

,

Коирала

Д.

,

Янъюору

П.М.

,

Гимире

К.

,

Шреста

П.

,

Мао

Х.

Взаимодействие G-квадруплексов в полноразмерном 3 теломерном выступе человека

.

Дж. Ам. хим. соц.

2014

;

136

:

18062

18069

.40.

Ю

Ш.К.

,

Miyoshi

D.

,

Sugimoto

N.

Характеристика структуры и стабильности G-квадруплексов длинных теломерных ДНК

.

Дж. Ам. хим. соц.

2006

;

128

:

15461

15468

.41.

Петраккон

Л.

,

Спинк

К.

,

Трент

Дж.О.

,

GARBETT

N.C.

,

MEKMAYSY

C.S.

,

Giancola

C.

,

C.

,

C.

j.b.

Структура и стабильность более высокого порядка человеческих телемерных квадруплексов

.

Дж. Ам. хим. соц.

2011

;

133

:

20951

20961

.42.

XU

Y.

,

ISHIZUKA

T.

,

T.

,

Kurabayashi

K.

,

Komiyama

,

Komiyama

M.

Последовательное образование G-квадруплексов в человеческом теломереверханге ДНК: защитное покрытие структура концов теломер

.

Анжю. Хеми — Междунар. Эд.

2009

;

48

:

7833

7836

. 43.

Ван

Х.

,

Нора

Г.J.

,

Ghodke

H.

,

Opresko

P.L.

Исследования отдельных молекул физиологически значимых теломерных хвостов выявили механизм POT1, способствующий разворачиванию G-квадруплекса

.

Дж. Биол. хим.

2011

;

286

:

7479

7489

.44.

Авраам Пуннус

Дж.

,

Ма

Й.

,

Хок

М.Э.

,

Куи

Й.

,

Sasaki

,

Sasaki

S.

,

GUO

AH

,

AH

,

Nagasawa

K.

,

MAO

H.

Случайное формирование G-квадруплексов в полноразмерных телемерах наложения человека приводит к кинетический паттерн складывания с целевыми вакантными G-Tracts

.

Биохимия

.

2018

;

57

:

6946

6955

.45.

Кар

А.

,

Джонс

Н.

,

Ozlem Arat

Nzlem Arat

N.

,

Fishel

R

,

R

,

GRIFIFTH

JD

Длительная повторяющаяся (TTAGGG) N одноцентровые ДНК Самоконденсированные в компактные бисерные нити, стабилизированные G-Cadropple

.

Дж. Биол. хим.

2018

;

293

:

9473

9485

.46.

Саннохе

Ю.

,

Сато

К.

,

Мацугами

А.

,

Shinhahara

,

K. ICHI

K. yichi

,

Mashimo

T.

,

T.

,

Katahira

М.

,

SUGIYAMA

H.

Ориентация концов г-квадруплексных структур, исследованных с использованием конца удлиненные олигонуклеотиды

.

Биоорганическая Мед. хим.

2009

;

17

:

1870

1875

.47.

Ворличкова

М.

,

Хладкова

Й.

,

Kejnovská

,

I.

,

I.

,

Fialová

M.

,

kypr

j.

J.

Гуанина Тетрафиология Топология человеческой телемере ДНК регулируется количеством (TTAGGG) повторяется

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2005

;

33

:

5851

5860

.48.

Малеки

П.

,

Будхатоки

Дж.Б.

,

Рой

В.А.

Практическое руководство по изучению структур G-квадруплекса с использованием одиночной молекулы FRET

.

мол. Жене. Геномика

.

2017

;

292

:

483

498

.49.

Ауэр

А.

,

Штраус

М.Т.

,

Schlichthaerle

T.

,

Jungmann

R.

Быстрая бесфоновая визуализация DNA-PAINT с использованием зондов на основе FRET

.

Нано Летт.

2017

;

17

:

6428

6434

.50.

Lee

J.

,

Park

S.

,

Hohng

S.

Ускоренная микроскопия FRET-PAINT

.

мол. Мозг

.

2018

;

11

:

70

.51.

Юнгманн

Р.

,

Штайнхауэр

К.

,

Шейбле

М.

,

Кузык

А.

,

Тиннефельд

П.

,

Зиммель

Ф.К.

Кинетика одиночных молекул и микроскопия сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной визуализации кратковременного связывания ДНК-оригами

.

Нано Летт.

2010

;

10

:

4756

4761

.52.

Loeff

L.

Борьба с микробами: освещение адаптивного иммунитета CRISPR с использованием флуоресценции одиночных молекул

.

2017

;

Делфтский технологический университет

.53.

Керссемакерс

Дж.В.Дж.

,

Лаура Мунтяну

E.

,

Laan

L.

,

Noetzel

T.L.

,

Janson

M.E.

,

Dogterom

M

Динамика сборки микротрубочек при молекулярном разрешении

.

Природа

.

2006

;

442

:

709

712

.54.

Эфрон

Б.

,

Тибширани

Р.J.

Введение в Bootstrap

.

1993

;

Нью-Йорк

Чепмен энд Холл

.55.

Тан

Дж.

,

Кан

З.Ю.

,

Яо

Ю.

,

Ван

В.

,

Хао

Ю.Х.

,

Tan

Z.

G-квадруплекс преимущественно образуется на самом 3′-конце теломерной ДНК позвоночных

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2008

;

36

:

1200

1208

.

© Автор(ы), 2021 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа цитируется правильно.

Ежедневно Низкие цены на Walmart.ca!

Интернет-магазины в Канаде: ежедневные низкие цены в Walmart.ок!

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart.Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart.Нажми для деталей.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Лето еще не скоро наступит

Качественные разговорные наборы для развлечения и наслаждения.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Happy Holi

Разбавьте свои блюда блюдами индийской и южноазиатской кухни.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Горячие ежедневные и еженедельные предложения

От наших избранных партнеров-продавцов.

Только онлайн.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка до вас теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка до вас теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

Доставка к вам теперь является углеродно-нейтральной*

Walmart в сотрудничестве с EcoCart компенсирует 100% выбросов углерода, возникающих при доставке последней мили.

*Относится только к товарам, продаваемым и отправляемым Walmart. Нажми для деталей.

JavaScript отключен

Извините, для правильной работы этой веб-страницы требуется JavaScript.

Пожалуйста, включите JavaScript в вашем браузере и перезагрузите страницу.

Уход за животными Shaggy Chic | Няня для домашних животных в Пулер, Джорджия

Вы планируете хорошо отдохнуть за городом, но беспокоитесь о том, чтобы оставить своих собак дома одних? Не волнуйтесь! Вы можете заручиться помощью надежной местной няни, когда сталкиваетесь с такими ситуациями. Однажды попробовав профессиональные услуги по уходу за дорогими пушистыми питомцами, вам больше не придется беспокоиться о своем питомце, когда вы уезжаете за город.

Почему вам следует воспользоваться услугами местного кинолога

Вот несколько причин, по которым вам стоит воспользоваться услугой присмотра за домашними животными:

Почему бы просто не использовать друга или соседа?

При найме сиделки важно взвесить все факторы.Очевидно, что если у вас есть член семьи, который может взять домашнее животное, вы можете пойти по этому пути. Все сводится к тому, чтобы иметь кого-то, кому вы доверяете заботиться о вашем доме и животных, и, в конечном счете, кого-то, с кем вы чувствуете себя комфортно. Выбирая услуги няни, няня обязана заботиться о ваших питомцах, это их работа, а не просто услуга. Большинство нянь выбрали свою профессию из-за любви к животным и, как правило, имеют собственных питомцев. Кроме того, у профессиональной местной няни для собак есть обязывающий договор на защиту вашего питомца и вашего дома.

Зачем еще вам нанимать службу?

Другими причинами, по которым вы можете захотеть воспользоваться услугой по присмотру за собакой, могут быть сохранение вашего питомца на одном и том же графике кормления, посещения туалета и прогулок, не допускайте вашего питомца в конуру для домашних животных и наличие обученного специалиста для ухода за вашей собакой в ​​случае чрезвычайной ситуации. Кроме того, если упражнения и время игр вашего питомца останутся прежними, они могут даже не знать, что вы ушли! Кроме того, наличие профессионала, обученного оказанию первой помощи животным и сердечно-легочной реанимации, который присмотрит за вашим питомцем в случае чрезвычайной ситуации, может спасти жизнь вашему питомцу. Кроме того, не пуская вашего питомца в конуру, вы сохраните его здоровье и избавите от болезней.

Если вы ищете местную няню для собак в Пулере, штат Джорджия, позвоните в отдел ухода за животными Shaggy Chic по телефону (912) 748-1118.

Добавьте постоянную ссылку в закладки.

Основанный на FRET подход для количественной оценки форсколин-индуцированного транспорта пендринов в плазматической мембране в бронхиальных клетках NCI h392 — Полный текст — Клеточная физиология и биохимия 2013, Vol. 32, Доп. 1

История вопроса: Пендрин человека (SLC26A4, PDS) представляет собой интегральный мембранный белок, действующий как электронейтральный анионообменник.Мутации с потерей функции в белке пендрин вызывают синдром Пендреда, расстройство, характеризующееся нейросенсорной глухотой и частичным дефектом йодорганизации, которое может привести к зобу щитовидной железы. Кроме того, активация пендрина может играть роль в патогенезе ряда заболеваний, включая бронхиальную астму и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Таким образом, наблюдение за численностью плазматической мембраны и перемещением pendrin в контексте живой клетки имеет решающее значение. Методы: Поступление пендрина на плазматическую мембрану контролировали с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) — физического явления, происходящего между двумя флуорофорами (FRET-донором и акцептором), расположенными в непосредственной близости друг от друга. Поскольку эффективность переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, FRET чрезвычайно чувствителен к небольшим изменениям расстояния между донором и акцептором и, следовательно, является мощным инструментом для определения белок-белковых взаимодействий. Результаты: Исследования FRET показали, что индуцированная форсколином продукция цАМФ связана со значительным повышением экспрессии пендрина на плазматической мембране, что сопровождается снижением внутриклеточного рН. Транспозиция пендрина на мембрану сопровождается частичной деполимеризацией актинового цитоскелета за счет ингибирования Rho-GTPase. Заключение: Транспортировка на плазматическую мембрану имеет решающее значение для регуляции активности пендрина. Поэтому очень желательны надежные инструменты для мониторинга и количественной оценки этого явления.

© 2014 S. Karger AG, Базель

Введение

Пендрин человека (SLC26A4, PDS) представляет собой мембранный белок из 780 аминокислот с 12 предполагаемыми трансмембранными доменами с транспортными характеристиками, отличными от свойств других членов семейства SLC26, поскольку он действует как натрий-независимый анионообменник исключительно для одновалентных анионов, включая йодид, хлорид, бикарбонат, гидроксид и тиоцианат [1,2,3]. Эти биофизические свойства являются фундаментальными для множества физиологических функций транспортера и его участия во многих патологических процессах.В соответствии с этим пендрин экспрессируется в различных тканях и органах, таких как щитовидная железа, почки, внутреннее ухо, молочная железа, яички, плацента, эндометрий, легкие, амелобласты и печень [4,5,6,7]. Мутации потери функции в белке пендрина вызывают синдром Пендреда, аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, характеризующееся тяжелой двусторонней потерей слуха, аномалиями внутреннего уха и частичным дефектом йодорганизации, что может привести к развитию эутиреоидного зоба или гипотиреоза [8,9,10, 11].Увеличение/нарушение регуляции пендрина действительно может способствовать возникновению ряда заболеваний человека. Например, в почках пендрин может играть роль в патогенезе гипертензии, тогда как избыточная экспрессия транспортера в легких может усугублять респираторные заболевания, такие как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). Измененная экспрессия гена пендрина может быть частью путей передачи сигнала, характеризующих начало специфических заболеваний человека. Развитие бронхиальной астмы и ХОБЛ частично зависит от передачи сигналов, опосредованной интерлейкином-4/интерлейкином-13 (ИЛ-4/ИЛ-13), который модулирует уровень экспрессии нескольких генов, включая пендрин, через STAT-6 [12].

Для комплексного понимания физиологической роли белков крайне важно разработать передовые методы мониторинга не только экспрессии генов, но и субклеточной локализации белков в контексте живой клетки. Хорошо известно, что содержание пендрина в плазматической мембране является строго регулируемым процессом. В щитовидной железе количество пендрина на уровне плазматической мембраны контролируется передачей сигналов цАМФ/ПКА [13,14]. В почках роль передачи сигналов цАМФ/PKA в регуляции экспрессии и переноса pendrin противоречива.Азроян и др. обнаружили, что кратковременная (20 мин) стимуляция пути цАМФ/ПКА увеличивает количество пендрина на клеточной поверхности, а также его транспортную активность в стабильно трансфицированных проксимальных клетках почки опоссума [15]. Другие обнаружили, что длительное (в течение ночи) повышение уровня цАМФ увеличивает содержание общего белка пендрина как в культивируемых кортикальных собирательных трубочках, так и в соединительных канальцах мышей, в то время как кратковременное (30 минут) лечение форсколином (агонистом аденилатциклазы) не изменяет белок пендрина. изобилие или его субклеточное распределение [16].В легких цАМФ увеличивал объем и рН секретируемой жидкости за счет стимуляции активности CFTR и пендрина соответственно [17]. Вместе эти находки подчеркивают тесную связь, связывающую экспрессию генов и регулируемый внутриклеточный транспорт с функцией pendrin.

В этом исследовании мы количественно оценили количество пендрина на плазматической мембране в живых клетках с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). FRET — это физический процесс, при котором энергия возбужденного флуорофора (донора FRET) передается ближайшей флуоресцентной молекуле (акцептору FRET).Непременным условием для передачи энергии является непосредственная пространственная близость донора и акцептора, которая должна находиться в пределах 1-10 нм. Эта важная особенность делает FRET мощным инструментом для оценки белок-белковых взаимодействий с пространственным и временным разрешением [18] в фиксированных и живых клетках. Мы исследовали FRET между пендином (путем создания усиленного цианофлуоресцентного белка (ECFP) на С-конце пендрина, PDS-ECFP) и плазматической мембраной (используя конструкцию, содержащую усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP) с N-концевым соединением). метка последовательности, которая посттрансляционно пальмитоилирована и нацелена на плазматическую мембрану, EYFP-Mem) как в фиксированных, так и в живых бронхиальных эпителиальных клетках (NCI-h392).Наши исследования показали, что стимулированное форсколином увеличение внутриклеточного цАМФ вызывало значительное увеличение содержания пендрина на плазматической мембране. Важно отметить, что повышенный перенос пендрина на клеточную поверхность был связан со значительным увеличением обмена Cl /HCO 3 , что приводило к внутриклеточному закислению. Более того, мы обнаружили, что внедрение pendrin в плазматическую мембрану, вероятно, облегчается стимулируемой форсколином деполимеризацией актиновых филаментов посредством Rho-GTPases.

Материалы и методы

Химические вещества и реактивы

Все химические вещества были приобретены у Sigma (Sigma-Aldrich, Милан, Италия). Форсколин был от Fermentek Biotechnology. Ацетоксиметиловый эфир 2′,7′-бис(карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеина (BCECF-AM), среды и сыворотки для культивирования клеток получали от Life Technologies (Life Technologies, Монца, Италия).

Плазмиды

Открытую рамку считывания (ORF) пендина человека из нормальной ткани щитовидной железы субклонировали с помощью ПЦР из вектора pTARGET (Promega Corporation) (первоначально предоставленного проф.P. Beck-Peccoz, Миланский университет, Италия) в сайты рестрикции XhoI и BamHI вектора pECFPN1 (Clontech). При трансфекции в клетки млекопитающих эта конструкция приводит к продукции пендрина с С-концевой меткой ECFP.

CFP(d)Del-EPAC(dDEPCD)-cp173Venus(d)-Venus(d) (обменный белок, активируемый зондом цАМФ (EPAC)) для мониторинга внутриклеточной концентрации цАМФ был получен от Jalink Kees [19 ].

Конструкция Raichu-Rho-связывающего домена (RBD) была ранее описана Yoshizaki et al.[20] и любезно предоставлено профессором Мацуда (Университет Осаки, Япония).

Конструкция pEYFP-Mem была произведена компанией Clontech. Трансфекция клеток этой конструкцией приводит к сильному мечению плазматической мембраны.

Культура клеток и трансфекция

Клетки NCI-h392 (от ATCC) выращивали в среде Advanced RPMI 1640 (Life Technologies, Монца, Италия) с добавлением 10% (об. /об.) эмбриональной бычьей сыворотки и 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C с 5% CO 2 .Клетки NCI-h392 высевали на покровные стекла диаметром 40 мм и выращивали в течение 24 часов (слияние ~80%). Для экспериментов FRET клетки временно трансфицировали плазмидами (0,4 мкг ДНК/см 2 ) с использованием реагента для трансфекции TransIT®-2020 (0,75 мкл/см 2 ) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем (Mirus, Mirus Bio ООО, США). Эксперименты FRET проводили через 48 часов после трансфекции.

Измерения видеоизображения

Для измерения FRET и внутриклеточного pH покровные стекла помещали в перфузионную камеру (система закрытых камер FCS2, BIOPTECHS, Butler, U.S.A.), а измерения проводились с использованием инвертированного микроскопа (Nikon Eclipse TE2000-S), оборудованного для измерения флуоресценции отдельных клеток и анализа изображений. Образец освещали через масляный иммерсионный объектив с увеличением 40Х (ЧА = 1,30).

Измерения FRET

Эксперименты FRET проводились, как описано ранее [21,22]. Вкратце, клетки NCI-h392 котрансфицировали (временно) PDS-ECFP и EYFP-Mem, Raichu-RBD для оценки активности Rho или зондом EPAC для измерения изменений цАМФ.Визуализацию клеток, экспрессирующих ECFP и/или EYFP, и обнаружение FRET проводили на инвертированном микроскопе (Nikon Eclipse TE2000-S), оснащенном монохроматором, управляемым программным обеспечением MetaMorph/MetaFluor. ECFP возбуждали при 433 нм, а EYFP при 512 нм. Все изображения были совмещены и скорректированы на фон в окнах эмиссии для FRET (535/30 нм), ECFP (475/30 нм) и EYFP (535/26 нм). Каждое изображение было дополнительно скорректировано с учетом перекрестных помех ECFP и перекрестного возбуждения EYFP. Таким образом, netFRET = IFRETbg — (ICFPbg x a) — (IYFPbg — b), где IFRETbg, ICFPbg и IYFPbg — значения серого пикселя с поправкой на фон, измеренные в окнах FRET, ECFP и EYFP соответственно; а и b — относительный вклад в интенсивность флуоресценции в окне FRET за счет перекрестных помех ECFP и перекрестного возбуждения EYFP соответственно. Полученные значения netFRET нормализовали по уровням экспрессии белка (NFRET=netFRETx 100/(ICFPbg x IYFPbg) 1/2 ). Интегральные значения плотности флуоресценции изображений из десяти областей интереса в каждой клетке (вблизи границы клетки) анализировали с использованием программного обеспечения MetaMorph и Microsoft Excel. Поскольку флуоресценция вариантов зеленого флуоресцентного белка чувствительна к рН [23], на FRET может влиять зависимое от пендрина внутриклеточное подкисление.

Измерения внутриклеточного pH

Клетки NCI-h392 нагружали 1 мкМ BCECF-AM в течение 30 минут при 37°C в среде Игла, модифицированной Дульбекко, а затем промывали раствором Рингера, содержащим (в ммоль/л): 130 NaCl, 3 KCl, 0.5 MgCl 2 , 1,2 NaHCO 3 , 10 глюкоза, 1,2 CaCl 2 , 10 HEPES, pH 7,4. BCECF возбуждали при 490 и 440 нм. Излучаемую флуоресценцию пропускали через однополосное дихроичное зеркало и фильтровали при 535 нм (Omega Optical, Brattleboro, VT, USA). Соотношение интенсивности флуоресценции BCECF калибровали в конце каждого эксперимента с помощью калибровочного раствора, содержащего 10 мкМ нигерицина и высокое содержание калия (в ммоль/л: 5 NaCl, 130 KCl, 0,1 MgCl 2 , 10 глюкоза, 1,2 CaCl 2 , 10 HEPES, рН 5.30 — 8,44 с поправкой на KOH или HCl) [24]. Колебания pH (ΔupH) рассчитывали с помощью (pHf-pH0)/pH0, где pH0 — это pH до стимуляции форсколином, а pHf — максимальный pH, достигаемый после стимуляции форсколином.

Окрашивание актином

Клетки NCI-h392 выращивали на покровных стеклах диаметром 12 мм, не обрабатывали или стимулировали форсколином (100 мкМ в течение 45 минут) и фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 минут. Клетки промывали 3 раза по 5 минут в PBS и пермеабилизировали 0.1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут. Актиновый цитоскелет визуализировали путем инкубации с изотиоцианатом фаллоидин-тетраметилродамина (Phalloidin-TRITC, 100 мкг/мл) в течение 45 минут. Покровные стекла помещали на предметные стекла с монтажной средой Mowiol (Sigma-Aldrich, Милан, Италия) и анализировали с помощью конфокального микроскопа (Leica TCS SP2, Leica Microsystems, Heerbrugg, Швейцария).

Статистический анализ

Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ выполняли с помощью t-критерия Стьюдента (непарного или парного, если это применимо) при p<0.05 считается статистически значимым, и где n представляет количество клеток.

Результаты

Количественное определение количества пендрина на плазматической мембране с помощью исследований FRET

Для количественного определения количества пендрина, экспрессируемого на плазматической мембране, мы применили метод, основанный на физическом процессе FRET в фиксированных и живых клетках. Как указано выше, ECFP функционировал как донор FRET, а EYFP — как акцептор FRET. Клетки NCI-h392 котрансфицировали конструкциями, содержащими пендрин, меченный на С-конце ECFP (PDS-ECFP), и EYFP-Mem (состоящий из слитого белка, состоящего из EYFP, меченного на N-конце 20 аминокислотами нейромодулина, которые содержат сигнал посттрансляционного пальмитоилирования, который направляет конструкцию на плазматическую мембрану [21,25]). Для возникновения FRET два гибридных белка должны находиться в непосредственной близости друг от друга, т. е. пендрин вставлен в плазматическую мембрану или расположен близко к ней (рис. 1А) [26]. Чтобы оценить и проверить чувствительность этого подхода, NFRET был рассчитан в фиксированных клетках NCI-h392, обработанных в течение 45 минут форсколином (100 мкМ), активатором передачи сигналов цАМФ/ФКА, который, как известно, регулирует субклеточную локализацию и функцию пендрина [13]. ,14,15,17], либо транспортное средство (контроль). По сравнению с необработанными клетками сигнал FRET был значительно повышен в клетках, обработанных форсколином (100 ± 2.73, n = 104 и *129,1 ± 5,32, n = 123 для контрольных и обработанных форсколином клеток соответственно, где *p <0,0001) (рис. 1B). Это открытие согласуется с увеличением содержания пендрина на плазматической мембране при активации пути передачи сигнала цАМФ/ПКА.

Рис. 1

A, схематическая модель FRET между слитым белком PDS-ECFP (донор) и EYFP-Mem (акцептор). ECFP слит с С-концом пендрина (PDS), а EYFP прикреплен к клеточной мембране своим липидным якорем.FRET происходит только в том случае, если два белка находятся на расстоянии 1-10 нм. B, репрезентативная клетка, показывающая сигнал FRET под контролем (CTR) и стимуляция форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 минут). Гистограммы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) представляют изменения NFRET между контрольными (CTR) и обработанными форсколином (FK) клетками. C, динамические эксперименты FRET. Интенсивность флуоресценции в канале FRET при возбуждении на длине волны 433 нм. Регистрировали интенсивность флуоресценции в реальном времени и рассчитывали (F1-F0)/F0 (см. результаты). Исходные записи являются репрезентативными для сверхэкспрессирующих PDS и фиктивных клеток.

Динамическое перемещение пендрина к плазматической мембране было дополнительно исследовано в живых клетках. Изменения интенсивности флуоресценции в канале FRET (коэффициент эмиссии 535/475 нм), испускаемые при возбуждении на длине волны 433 нм (рис. 1C), оценивали с помощью визуализации эпифлуоресценции одиночных клеток и количественно оценивали по отношению к уровням, обнаруженным до стимуляции форсколином, измеряя максимальное изменение F1-F0)/F0, где F0 — средняя интенсивность флуоресценции в FRET-канале до стимуляции форсколином, а F1 — средняя интенсивность флуоресценции в FRET-канале после стимуляции форсколином в течение 5 мин.(F1-F0)/F0 увеличился на 27,50% ± 1,5 (n=56, p<0,0001) в клетках, экспрессирующих пендирин. В клетках, трансфицированных только EYFP-Mem и ECFP (ложные клетки), не было обнаружено значительных изменений в (F1-F0)/F0.

Оценка активности пендрина путем измерения внутриклеточного pH в режиме реального времени

В большинстве секретирующих эпителиальных клеток HCO 3 пендрин играет роль в модуляции pH секретируемой жидкости [17]. Секреция HCO 3 через пендрин сопровождается внутриклеточным закислением [27].Чтобы оценить, соответствует ли повышенное содержание пендрина на плазматической мембране при активации цАМФ/ПКА увеличению его активности, были проведены измерения внутриклеточного рН в реальном времени. С этой целью клетки NCI-h392, трансфицированные PDS-ECFP, нагружали рН-чувствительным красителем BCECF-AM (1 мкМ в течение 30 мин). Стимуляция форсколином привела к значительному внутриклеточному подкислению в клетках, сверхэкспрессирующих пендрин, тогда как в нетрансфицированных клетках (ложных клетках) не было обнаружено соответствующих изменений внутриклеточного pH (ΔupH = 0.074 ± 0,011, n = 43 и *0,301 ± 0,018, n = 35 для ложных и PDS-трансфицированных клеток соответственно, где *p < 0,0001) (рис. 2). Эти наблюдения согласуются с увеличением функции пендрина после активации передачи сигналов цАМФ/ПКА.

Рис. 2

Репрезентативные экспериментальные записи, демонстрирующие влияние стимуляции форсколином (ФК, 100 мкМ в течение 5 минут) на внутриклеточный рН в клетках, сверхэкспрессирующих пендрин, и в клетках-имитаторах. На вставке гистограммы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) представляют изменение внутриклеточного pH (ΔupH) после стимуляции форсколином (*p <0. 0001).

Участие белков Rho в качестве нижестоящих эффекторов пути передачи сигнала cAMP/PKA

Ремоделирование актина является фундаментальным в контроле переноса и клеточного распределения различных каналов и транспортеров [28,29]. Для дальнейшего исследования молекулярного механизма, контролирующего клеточную локализацию пендрина после стимуляции форсколином, мы оценили: 1) концентрации цАМФ, 2) активность Rho и 3) реорганизацию актинового цитоскелета. Клетки NCI-h392 трансфицировали сенсором FRET, включающим связывающую цАМФ последовательность EPAC, расположенную между ECFP и EYFP [30].Связывание цАМФ с EPAC вызывает внутримолекулярное конформационное изменение, приводящее к увеличению расстояния между донором и акцептором FRET, тем самым уменьшая сигнал FRET (рис. 3А). По сравнению с клетками, обработанными носителем (CTR), стимуляция форсколином снижала расчетные значения NFRET (100 ± 4,2, n = 54 и *77 ± 3,46, n = 51 для клеток, обработанных CTR и форсколином, соответственно, где *p < 0,0001). ), что согласуется со значительным увеличением внутриклеточной концентрации цАМФ и последующей активацией ПКА (рис.3Б).

Рис. 3

A, схематическая модель зонда FRET, содержащего последовательность связывания цАМФ EPAC, расположенную между ECFP (донор) и EYFP (акцептор). Связывание цАМФ с EPAC приводит к внутримолекулярному стерическому конформационному изменению, вызывающему значительное увеличение расстояния между флуоресцентным донором и акцептором, тем самым уменьшая FRET. B, гистограммы (среднее ± SEM) представляют изменения NFRET между контрольными (CTR) и обработанными форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 минут) клетками (* p <0.0001).

ГТФаза RhoA является известной мишенью PKA. Фосфорилирование RhoA GTPase по Ser188 ингибирует ее активность за счет усиления связывания между ней и ее ингибитором Rho-GDI [31,32]. Чтобы проверить, было ли вызванное форсколином увеличение внутриклеточного цАМФ параллельным снижением активности Rho в нашей экспериментальной системе, клетки NCI-h392 трансфицировали сенсором FRET (Raichu-RBD), содержащим Rho-связывающий домен (RBD), сэндвич между ECFP и EYFP [20]. Связывание эндогенного GTP-RhoA с RBD вытесняет EYFP и ECFP, тем самым снижая эффективность FRET (рис.4А). Результаты экспериментов FRET суммированы на рис. 4B. По сравнению с клетками, обработанными носителем (CTR), стимуляция форсколином значительно увеличивала сигнал NFRET, что согласуется со снижением активности RhoA (100 ± 3,64, n = 102 и *113,8 ± 4,16, n = 109 для клеток, обработанных CTR и форсколином, соответственно, где *p < 0,05) (рис. 4Б). Ингибирование Rho действительно связано с деполимеризацией актина [32,33,34]. Исследования с конфокальной визуализацией подтвердили, что стимуляция клеток NCI-h392 форсколином вызывала значительное уменьшение количества актиновых филаментов, что согласуется с реорганизацией актинового цитоскелета (рис.5).

Рис. 4

A, схематическая модель датчика FRET, содержащего Rho-связывающий домен (RBD), зажатый между ECFP (донор) и EYFP (акцептор). Связывание GTP с RBD приводит к внутримолекулярному конформационному изменению, вызывающему значительное увеличение расстояния между флуоресцентным донором и акцептором, тем самым уменьшая FRET. B, гистограммы (среднее ± SEM) представляют изменения NFRET между контрольными (CTR) и обработанными форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 минут) клетками (* p <0.05).

Рис. 5

Влияние стимуляции форсколином на реорганизацию актина в клетках NCI-h392. Клетки обрабатывали носителем (CTR) или стимулировали форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 мин). F-актин окрашивали фаллоидином-ТРИТЦ и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.

Обсуждение

В этом отчете мы описали основанный на FRET подход к оценке количества пендрина на плазматической мембране в культуре клеток бронхиального эпителия (NCI-h392), стимулированных форсколином.Недавние исследования показали, что не только потеря функции, но и активация активности пендина могут играть ключевую роль в возникновении ряда заболеваний у человека [5], что обуславливает необходимость в надежных инструментах для количественного определения экспрессируемого через мембрану пендина при различные патофизиологические состояния. Технология FRET была впервые описана как мощный инструмент для изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках [35]. Позже стало очевидно, что FRET можно также применять для измерения широкого спектра клеточных ответов, таких как изменения внутриклеточных концентраций кальция и металлов, рН, напряжения, активности ферментов и локальных изменений концентрации вторичных мессенджеров [36,37].

Здесь, используя датчик FRET цАМФ на основе EPAC, мы подтвердили, что форсколин, известный активатор аденилатциклазы, вызывает значительное снижение NFRET, что согласуется с увеличением внутриклеточных уровней цАМФ в клетках NCI-h392 (рис. 3). ). Чтобы оценить специфические и дискретные изменения количества пендринов на клеточной поверхности, мы использовали акцептор FRET, генетически сконструированный для нацеливания на плазматическую мембрану (EYFP-Mem). Этот специфический флуоресцентный датчик обеспечивает количественную индикацию распределения мембранных белков с высоким пространственно-временным разрешением. Мы продемонстрировали, что форсколин значительно увеличивал сигнал FRET как в фиксированных (рис. 1B), так и в живых (рис. 1C) клетках NCI-h392, коэкспрессирующих EYFP-Mem и PDS-ECFP (рис. 1A), что согласуется с увеличением пендрина. экспрессия на плазматической мембране. В соответствии с ролью секреции HCO 3 в эпителиальной ткани дыхательных путей [17], увеличение содержания пендрина, которое мы обнаружили на клеточной мембране, сопровождалось значительным внутриклеточным подкислением (рис. 2). Подобно тому, что показано в щитовидной железе и почках [14,15], наши данные показывают, что стимуляция пути передачи сигнала цАМФ также увеличивает количество пендрина, экспрессируемого на клеточной поверхности, и его транспортную активность в культивируемых бронхиальных клетках NCI-h392.Транспозиция пендрина на клеточную мембрану, вероятно, регулируется PKA, поскольку мутация предполагаемого сайта фосфорилирования PKA (T717A) приводит к уменьшению транслокации транспортера на плазматическую мембрану в ответ на форсколин в клетках щитовидной железы [14]. Будут проведены дальнейшие исследования, чтобы выяснить, играет ли фосфорилирование PKA роль в регуляции локализации и функции пендрина в клетках бронхиального эпителия. Чтобы обеспечить дальнейшее понимание молекулярных сигналов, контролирующих клеточное распределение пендрина, мы сосредоточились на Rho-GTPases, которые являются специфическими нижестоящими мишенями каскада cAMP/PKA и модулируют события внутриклеточного переноса [32,38,39,40].Белки семейства Rho (Rho, Rac и Cdc42) активны в своем GTP-связанном состоянии и неактивны в своем GDP-связанном состоянии [38]. Ранее мы продемонстрировали, что стимуляция форсколином приводит к значительному увеличению фосфорилирования RhoA в S188, посттрансляционной модификации, которая стабилизирует неактивную форму RhoA. После фосфорилирования RhoA с помощью PKA, Rho действительно может отделяться от своих нижестоящих эффекторов, таких как Rho-kinase и белки ERM [28,32,41,42]. Используя специальный зонд FRET, созданный для измерения активности Rho [20], мы показали, что стимуляция форсколином связана со значительным снижением активности Rho (рис. 4). Ослабление активности Rho, как было показано, способствует частичной деполимеризации актинового цитоскелета, что можно считать основной предпосылкой, облегчающей внутриклеточный перенос белков [32,43,44]. Соответственно, стимуляция клеток NCI-h392 форсколином приводила к значительной реорганизации актинового цитоскелета (рис. 5). Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий участие передачи сигналов Rho в клетках NCI-h392 при стимуляции цАМФ/PKA. Влияют ли белки Rho прямо или косвенно на клеточное распределение pendrin посредством деполимеризации актина, еще предстоит исследовать.

В заключение, здесь мы предлагаем основанный на FRET подход для количественного определения экспрессии пендрина на плазматической мембране в фиксированных и живых клетках NCI-h392. Этот флуоресцентный анализ имеет высокое пространственно-временное разрешение, точен, гибок с точки зрения времени инкубации и может применяться в нескольких клеточных моделях для отслеживания даже незначительных изменений экспрессии пендрина на плазматической мембране в режиме реального времени.

Конфликт интересов

У авторов нет конфликта интересов, о котором следует заявить.

Благодарности

Это исследование финансировалось за счет грантов Университета Бари, Италия (Идея Джовани, 2011 г.) и проектов PRIN (Исследовательская программа национального интереса) для Г. Таммы (Tamma01373409Prin). C. Nofziger поддерживается Программой стипендий Roche Postdoc (№ 231). Эта работа была дополнительно поддержана грантами FWF (P18608) и FP-7 (PIRSES-GA-2008-230661) М. Паульмихлу.

Лицензия открытого доступа: Это статья открытого доступа, лицензированная в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-NonCommercial 3.0 Неперенесенная лицензия (CC BY-NC) (www.karger.com/OA-license), применимая только к онлайн-версии статьи. Распространение разрешено только в некоммерческих целях.
Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности.Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством.
Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам. Появление рекламы и/или ссылок на продукты в публикации не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности.Издатель и редактор(ы) отказываются от ответственности за любой ущерб людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в содержании или рекламе.

honeybag: значение, происхождение, определение — Словарь WordSense

honeybag (английский)

Происхождение и история

мед + пакет

Существительное

медовый мешок ( пл. медовый мешок )
  1. Сосуд для меда в медоносной пчеле.

Практические примеры

Автоматически сгенерированные примеры:

Не беспокойтесь слишком сильно в действии, месье; и, любезный месье, смотрите, чтобы медовый мешок не порвался; Мне бы очень не хотелось, чтобы вы переполнились медовым мешком , синьор.
Delphi Полное собрание сочинений Уильяма Шекспира (иллюстрированное) (Уильям Шекспир)

Мусье Паутина; Добрый месье, возьмите в руки оружие и убей мне краснопёстрого шмеля на верхушке чертополоха; и, любезный месье, принесите мне медовый мешок .
Полное собрание сочинений Уильяма Шекспира (William Shakespeare)

Не слишком утомляйтесь в действии, месье; и, любезный месье, следите за тем, чтобы медовый мешок не порвался. Мне бы не хотелось, чтобы вы переполняли медовый мешок , синьор.
Шекспир и нечистая эстетика — Страница 81 (Хью Грейди)

Не беспокойтесь слишком сильно в действии, мсье; и, любезный месье, позаботьтесь о том, чтобы медовый мешок не порвался; Мне бы очень не хотелось, чтобы вы переполнились медовым мешком , синьор.
Полное собрание сочинений Шекспира (40 сочинений) (Уильям Шекспир)

Мсье Паутина, добрый мсье, возьмите в руки оружие и убей мне краснобокого шмеля на верхушке чертополоха; и, любезный месье, принесите мне медовый мешок .
Сон в летнюю ночь — Иллюстрация Артура Рэкхема:… (Уильям Шекспир)

Не беспокойтесь слишком сильно в действии, мсье; Мне бы очень не хотелось, чтобы вы переполнились медовым мешком , синьор.
Сон в летнюю ночь (с примечаниями к биографии и… (Уильям Шекспир)

Нижний месье Паутина, добрый месье, возьмите в руки оружие и убей мне краснобокого шмеля на верхушке чертополоха; и добрый месье, принесите мне медовый мешок .
Истории фермы Висконсин-Хиллз: приключения биодинамического фермера (Мари-Лора Валандро)

Не беспокойтесь слишком сильно в действии, месье, и, добрый месье, берегите медовый мешок не сломайтесь, мне бы очень не хотелось, чтобы вы переполнились медовым мешком , синьор.
Изображение чумы в Англии раннего Нового времени (Ребекка Тотаро)

И, добрый мсье, будьте осторожны, медовый мешок не сломайте. Мне бы не хотелось, чтобы вы переполняли медовый мешок , синьор. [Уходит Паутина] Где месье Горчичное семя? 5.474.1 Exit Cobweb Bottom отменяет Cobweb Ready.
Новый Оксфордский Шекспир: Полное собрание сочинений — стр. 1118 (Уильям Шекспир)

Не беспокойтесь слишком сильно в действии, г-н.Паутина, и следите за тем, чтобы медовый мешок не порвался; Мне было бы очень жаль, если бы вы переполнились медовым мешком .
Сокровищница молодежи, том III — в 12 томах (Гамильтон Райт Мэйби)


Записи со словом «медовый мешок»

honeybags : honeybags (английский)


Пользовательские заметки

Для этой записи нет пользовательских заметок.

Добавить примечание

Добавить примечание к записи «медовый мешок».Напишите подсказку по использованию или пример и помогите улучшить наш словарь. Не просите о помощи, не задавайте вопросов и не жалуйтесь. HTML-теги и ссылки не допускаются.

Все, что нарушает эти правила, будет немедленно удалено.


Next

Honeybags (английский) Имя существительное медовые мешочки Множественное число от honeybag

honeybee (английский) Происхождение и история мед + пчела Произношение …

медоносные пчелы (английский) Имя существительное медоносные пчелы Множественное число от honeybee

honeyberries (английский) Имя существительное ягоды мёда Множественное число от honeyberry

honeyberry (английский) Происхождение и история мёд + ягода Имя существительное …

Honeybird (английский) Происхождение и история мед + птица Имя существительное …

медоносные птицы (английский) Имя существительное медоносные птицы Множественное число от honeybird

honeyblob (английский) Имя существительное медовые капли (мн.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

2019 © Все права защищены. Карта сайта